يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تخليق ماساريميسين ، وهو مثبط جزيء صغير للنمو البكتيري الإيجابي الجرام

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63191

⸱

يناير 7, 2022

 ,  , 
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد الدياميد ماساريميسين المضاد للجراثيم ، وهو مسبار جزيء صغير يمنع نمو Bacillus subtilis والمكورات العقدية الرئوية عن طريق استهداف تدهور جدار الخلية. يظهر تطبيقه كمسبار كيميائي في اختبارات التآزر / العداء والدراسات المورفولوجية مع B. subtilis و S. pneumoniae.

الملخص

Peptidoglycan (PG) في جدار الخلية من البكتيريا هو بنية جزيئية كبيرة فريدة من نوعها تمنح الشكل والحماية من البيئة المحيطة. من الأمور الأساسية لفهم نمو الخلايا وانقسامها معرفة كيفية تأثير تدهور PG على التخليق الحيوي وتجميع جدار الخلية. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن وضع العلامات الأيضية ل PG من خلال إدخال السكريات المعدلة أو الأحماض الأمينية. في حين أن الاستجواب الكيميائي لخطوات التخليق الحيوي مع مثبطات الجزيئات الصغيرة أمر ممكن ، فإن أدوات البيولوجيا الكيميائية لدراسة تدهور PG بواسطة autolysins غير متطورة. ال autolysins البكتيرية هي فئة واسعة من الإنزيمات التي تشارك في التدهور المنسق بإحكام من PG. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد مسبار جزيء صغير ، masarimycin ، وهو مثبط ل N-acetylglucosaminidase LytG في Bacillus subtilis ، واستقلاب جدار الخلية في العقدية الرئوية. يتم توفير إعداد المثبط عن طريق التوليف العضوي بمساعدة الميكروويف والكلاسيكية. يتم تقديم إمكانية تطبيقه كأداة لدراسة فسيولوجيا إيجابية الجرام في الفحوصات البيولوجية.

المقدمة

Peptidoglycan (PG) هو بوليمر يشبه الشبكة يحدد شكل الخلية وبنيتها في كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام 1,2. هذا البوليمر المتغاير عبارة عن مصفوفة من السكريات الأمينية المرتبطة بالببتيدات القصيرة3،4،5،6 مع العمود الفقري المكون من بقايا N-acetylglucosamine (GlcNAc) و N-acetylmuramic acid (MurNAc) المرتبطة β (1،4) (الشكل 1)1. تعلق على C-3 لاكتيل moiety من MurNAc هو الببتيد الجذعي. يتضمن استقلاب PG نظاما منسقا بإحكام من الإنزيمات الاصطناعية الحيوية والتحلل لدمج مواد جديدة في جدار الخلية 7,8. يتم تحلل PG بواسطة إنزيمات يشار إليها مجتمعة باسم autolysins9 ويتم تصنيفها بشكل أكبر بناء على خصوصية الرابطة المشقوقة. تشارك Autolysins في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك نمو الخلايا ، وانقسام الخلايا ، والحركة ، ونضج PG ، و chemotaxis ، وإفراز البروتين ، والكفاءة الوراثية ، والتمايز ، والإمراض10,11. يمكن أن يكون الكشف عن الوظائف البيولوجية المحددة ل autolysins الفردية أمرا شاقا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى التكرار الوظيفي. ومع ذلك ، قدمت الدراسات الفيزيائية الحيوية الحديثة8،12،13 والدراسات الحسابية12 نظرة ثاقبة جديدة على أدوارها في استقلاب PG. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت التقارير الأخيرة مزيدا من التبصر في التوليف 14 وخطوات 15،16،17 بوساطة الغشاء في استقلاب PG. إن الفهم الشامل للعلاقة بين المسارات التحلل والاصطناعية لاستقلاب PG يمكن أن يؤدي إلى أهداف المضادات الحيوية غير المستغلة سابقا.

في حين كان هناك تقدم كبير في منهجية لدراسة علم الأحياء السكرية في حقيقيات النوى ، فإن علم الأحياء السكرية البكتيرية ، وعلى وجه الخصوص ، لم يتقدم استقلاب PG بمعدل مماثل. تشمل الأساليب الكيميائية الحالية لدراسة استقلاب PG المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية18 ، ومجسات الفلورسنت19،20 ، ووضع العلامات الأيضية21،22،23،24. توفر هذه الأساليب الجديدة طرقا جديدة لاستجواب استقلاب جدار الخلية البكتيرية. في حين أن بعض هذه الاستراتيجيات قادرة على وضع علامات PG في الجسم الحي ، إلا أنها يمكن أن تكون19 نوعا خاصا ، أو تعمل فقط في سلالات تفتقر إلى autolysin25 معين. العديد من استراتيجيات وضع العلامات PG مخصصة للاستخدام مع جدران الخلايا المعزولة26 أو مع مسارات التخليق الحيوي PG المعاد تشكيلها في المختبر 20،27،28. يقتصر استخدام المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية حاليا على خطوات التخليق الحيوي و transpeptidation18.

المعرفة الحالية من autolysins البكتيرية ودورها في استقلاب جدار الخلية تأتي من التحليل الكيميائي الحيوي الوراثي وفي المختبر 11،29،30،31،32. في حين أن هذه الأساليب قد وفرت ثروة من المعلومات حول هذه الفئة المهمة من الإنزيمات ، فإن فك رموز دورها البيولوجي يمكن أن يكون تحديا. على سبيل المثال ، بسبب التكرار الوظيفي33 ، لا يؤدي حذف autolysin في معظم الحالات إلى وقف نمو البكتيريا. هذا على الرغم من دورها الضمني في نمو الخلايا وانقسامها 7,12. ومن المضاعفات الأخرى أن الحذف الجيني لل autolysins البكتيرية يمكن أن يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرية ميتا34. تنشأ الأنماط الظاهرية الفوقية من التفاعل المعقد بين المسار المتأثر بالحذف الجيني والمسارات المترابطة الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن أن ينشأ النمط الظاهري الفوقي عن طريق تأثير مباشر مثل عدم وجود إنزيم ، أو تأثير غير مباشر مثل تعطيل المنظمين.

حاليا ، لا يوجد سوى عدد قليل من مثبطات الغليكوزيداز autolysins مثل N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) و N-acetylmuramidases ، والتي يمكن استخدامها كمجسات كيميائية لدراسة تدهور PG. لمعالجة هذا ، تم تحديد diamide masarimycin (الذي كان يطلق عليه سابقا باسم fgkc) ووصف35 كمثبط للجراثيم لنمو Bacillus subtilis الذي يستهدف GlcNAcase LytG32 (الشكل 1). LytG هو GlcNAcase36 ذو مفعول خارجي ، وهو عضو في المجموعة 2 ضمن عائلة هيدرولاز غليكوزيل 73 (GH73). وهو GlcNAcase النشط الرئيسي أثناء النمو الخضري32. على حد علمنا ، Masarimycin هو أول مثبط ل GlcNAcase الذي يعمل PG والذي يمنع النمو الخلوي. وجدت دراسات إضافية على ماساريميسين مع العقدية الرئوية أن ماساريميسين من المحتمل أن يمنع استقلاب جدار الخلية في هذا الكائن الحي37. هنا ، يتم الإبلاغ عن إعداد masarimycin للاستخدام كمسبار بيولوجيا كيميائية لدراسة علم وظائف الأعضاء في الكائنات الحية إيجابية الجرام B. subtilis ، و S. pneumoniae. يتم تقديم أمثلة على التحليل المورفولوجي لعلاج التركيز المثبط دون الحد الأدنى باستخدام ماساريميسين ، بالإضافة إلى فحص التآزر / الخصومة. يمكن أن تكون مقايسات التآزر والعداء باستخدام المضادات الحيوية مع طرق عمل محددة جيدا طريقة مفيدة لاستكشاف الروابط بين العمليات الخلوية38،39،40.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الطرق العامة

ملاحظة: تم شراء جميع المركبات من الموردين القياسيين واستخدامها دون مزيد من التنقية.

  1. نفذ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على صفيحة ألومنيوم مغلفة مسبقا بهلام السيليكا XG F254. الكشف عن البقع تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، عن طريق الغمر في بقعة p-anisaldehyde، أو عن طريق التعرض لبخار I2.
  2. سجل جميع أطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) على مطياف 400 ميجاهرتز.
    ملاحظة: تمت الإشارة إلى 1H- NMR و 13من أطياف C-NMR إلى قمم المذيبات المتبقية. يتم إعطاء ثوابت الاقتران في [هرتز] والتحولات الكيميائية في [جزء في المليون].
  3. سجل أطياف قياس الطيف الكتلي للضغط الجوي للتأين الكيميائي (APCI) للماساريميسين على مطياف كتلة مدمج مجهز بمسبار تحليل المواد الصلبة في الغلاف الجوي.

2. الإجراء العام لإعداد ماساريميسين

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية في غطاء الدخان.

  1. تحضير محلول 0.1 M في الميثانول لكل متفاعل: سيكلوهيكسيلامين، سيكلوهكسيل كاربوكسالدهيد، حمض أو-يودوبنزويك، وسيكلوهكسيل إيزوسيانيد35.
    تنبيه: سيكلوهيكسيلامين ، سيكلوهكسيل إيزوسيانيد ، وسيكلوهكسيل كاربوكسالدهيد قابلة للاشتعال. يمكن أن تسبب تآكل الجلد وتحفز السمية الفموية أو الجلدية أو التنفسية أو الإنجابية. حافظ على المركبات بعيدا عن اللهب المكشوف والأسطح الساخنة ومصادر الاشتعال. ارتداء حماية مناسبة للبشرة والعين ، والعمل في منطقة جيدة التهوية وتجنب استنشاق الأبخرة أو الضباب. للتخزين ، احتفظ بالزجاجات مغلقة بإحكام وخزنها في مكان بارد وجاف. تخزين سيكلوهيكسيل كاربوكسالدهيد في مجفف تحت جو N2 .
  2. امزج 5 مل من السيكلوهيكسيلامين (محلول 0.1 متر في الميثانول) و 5 مل من كربوكسالدهيد سيكلوهيكسيل (0.1 متر في الميثانول) في قارورة سفلية مستديرة مغطاة وحرك المحلول باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي على صفيحة تحريك / تسخين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في حمام رملي. راقب درجة الحرارة باستخدام ميزان حرارة يوضع على بعد حوالي 1 سم تحت سطح الرمال.
  3. بعد 30 دقيقة ، أضف 5 مل من إيزوسيانيد السيكلوهكسيل (محلول 0.1 م في الميثانول) إلى المحلول من الخطوة 2.2 وحرك لمدة 20 دقيقة إضافية عند 50 درجة مئوية. أخيرا ، أضف 5 مل من حمض o-iodobenzoic (محلول 0.1 M في الميثانول) إلى خليط التفاعل واستمر في التحريك عند 55 درجة مئوية لمدة 3-5 ساعات.
  4. راقب تقدم التفاعل بشكل دوري بواسطة TLC كل ساعة تقريبا بعد تحريك خليط التفاعل أعلاه لمدة 3 ساعات.
  5. قطع شريط 3 سم × 6 سم من لوحة TLC المدعومة من الألومنيوم. باستخدام قلم رصاص #2 ، ارسم خطا على بعد حوالي 1 سم من الأسفل. باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية ، ضع حوالي 5 ميكرولتر من خليط التفاعل على لوحة TLC واتركها حتى تجف.
  6. إلى كوب سعة 150 مل ، أضف ما يكفي من المرحلة المتحركة (90: 10 هيكسان: الأيزوبروبانول) لتغطية الجزء السفلي من الدورق. باستخدام زوج من الملقط ، ضع لوحة TLC أعلاه بعناية في الكأس لضمان دخول لوحة TLC إلى مرحلة التنقل بالتساوي. غطي الجزء العلوي من الكأس بقطعة من التنفيل.
    ملاحظة: تأكد من أن المرحلة المتنقلة لا تغطي الخط والعينة المرقطة.
  7. اسمح للمرحلة المتنقلة بالانتقال إلى أعلى لوحة TLC حتى تصبح على بعد حوالي 1 سم أسفل الجزء العلوي من اللوحة. قم بإزالة لوحة TLC وباستخدام قلم رصاص ، ارسم خطا يشير إلى المسافة التي قطعتها المرحلة المتنقلة. اترك لوحة TLC لتجف في غطاء الدخان.
  8. بمجرد تجفيفها ، ضع لوحة TLC في كوب يحتوي على كمية صغيرة من المادة الصلبة I2 وقم بتغطية الكأس بقطعة من رقائق القصدير. راقب TLC لتطوير بقع صفراء / بنية. بمجرد تطويرها، قم بإزالة لوحة TLC ووضع علامة على موقع البقع باستخدام قلم رصاص (الشكل التكميلي 1).
    ملاحظة: إذا لم يتم وضع علامة على بقع2 ، فسوف تتبدد البقعة بمرور الوقت. يمكن أيضا تصور البقع على لوحة TLC عن طريق الأشعة فوق البنفسجية أو تلطيخ p-anisaldehyde أو تلطيخ برمنجنات البوتاسيوم (انظر المعلومات التكميلية).
  9. احسب قيم Rf لجميع البقع المرئية باستخدام الصيغة التالية:
    Rf = figure-protocol-1
  10. ضع في اعتبارك أن التفاعل يكتمل عندما تكون بقعة واحدة فقط مع Rf = 0.3 مرئية على لوحة TLC. قم بإزالة المذيب في مبخر دوار تحت ضغط منخفض وجفف المنتج الخام (الذي تم الحصول عليه كزيت بني مصفر) تحت فراغ عال حتى يتبخر كل الميثانول.
  11. قم بإذابة المنتج الخام المجفف في 30 مل من خلات الإيثيل وانقله إلى قمع منفصل. استخراج خلات الإيثيل بالتتابع مع 1 M HCl (2 × 30 مل) ، H 2 O (30 mL) ، محلول NaHCO3 المشبع (2 × 30 mL) ، H 2 O (30 mL) ومحلول NaCl المشبع (2× 30 mL). تخلص من الطبقات المائية.
    ملاحظة: طبقة خلات الإيثيل هي الطبقة العليا في كل عملية استخراج. لكل عملية استخراج، هز بقوة القمع الفاصل الذي يحتوي على خلات الإيثيل والمحلول المائي (HCl أو H2O أو NaHCO3 أو NaCl) واسمح للطبقات بالانفصال الكامل.
  12. قم بإزالة طبقة خلات الإيثيل من القمع الفاصل واجمعها في قارورة Erlenmeyer. أضف ملعقة مليئة ب Na2SO4 (اللامائي) لإزالة الماء المتبقي من خلات الإيثيل.
    ملاحظة: يعتبر محلول خلات الإيثيل جافا عندما يعمل Na2SO4 في القارورة بحرية ولا يتكتل. إذا كان Na2 SO 4 يتكتل ، فيمكن إضافة ملعقة إضافية من Na2SO4.
  13. قم بتصفية محلول خلات الإيثيل المجفف من خلال ورق الترشيح رقم 1 لإزالة Na2SO4. اغسل ورق الترشيح بكمية صغيرة من خلات الإيثيل. ضع محلول خلات الإيثيل المصفى في قارورة مستديرة القاع وقم بإزالة المذيب على مبخر دوار تحت ضغط منخفض للحصول على ماساريميسين كزيت بمجرد إزالة جميع خلات الإيثيل.
  14. يذوب زيت ماساريميسين الذي تم الحصول عليه أعلاه بكمية دنيا (1-2 مل) من الهكسان 9: 1: الأيزوبروبانول ويحرك على صفيحة تحريك مغناطيسية حتى يذوب كل المركب.
  15. قم بتنقية الماساريميسين المذاب بواسطة كروماتوغرافيا الفلاش باستخدام عمود فلاش سيليكا عادي الطور 12 جم.
    1. قم بموازنة عمود الفلاش مع 10 أحجام أعمدة من المرحلة المتنقلة (99: 1 هيكسان: isopropanol) مع ضبط الأداة بمعدل تدفق يبلغ 15 مل / دقيقة.
      ملاحظة: بعد اكتمال التوازن، أوقف التدفق وافصل الجزء العلوي من العمود عن النظام.
    2. ارسم ماساريميسين المذاب باستخدام حقنة 5 مل. قم بتوصيل المحقنة مباشرة بالجزء العلوي من عمود الفلاش المتوازن وحقن المحلول في العمود. أعد توصيل العمود الذي تم تحميله بنظام كروماتوغرافيا الفلاش وابدأ إزالة التدرج.
    3. إلوت ماساريميسين من العمود باستخدام التدرج إلى تركيز المرحلة المتنقلة النهائي من 10:90 الهكسان: الأيزوبروبانول على 12 وحدة تخزين العمود. راقب إزالة الماساريميسين عن طريق الامتصاص عند 230 و 254 نانومتر.
    4. اجمع المركبات التي تم إخراجها من العمود بواسطة جامع الكسور الذي يجمع 20 مل من المذيب لكل كسر.
      ملاحظة: في حالة عدم توفر نظام كروماتوغرافيا فلاش، يمكن إجراء تنقية ماساريميسين عبر عمود سيليكا الجاذبية مع مرحلة متنقلة 3: 1 (الهكسان: خلات الإيثيل). يمكن تحديد الكسور التي تحتوي على ماساريميسين بواسطة TLC باستخدام نفس المرحلة المتنقلة. تم تصور بقع TLC إما باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية أو بخار I2 أو تلطيخ برمنجنات البوتاسيوم.
    5. حدد الكسور التي تحتوي على ماساريميسين بواسطة TLC (الخطوات 2.5-2.9) أو قياس الطيف الكتلي على مطياف كتلة مدمج مجهز بمسبار تحليل المواد الصلبة في الغلاف الجوي. جفف المنتج النهائي تحت الفراغ (~ 0.3 مللي بار).
      ملاحظة: يتم الحصول على Masarimycin بشكل روتيني كزيت عديم اللون أو صلب مع عائد يتراوح بين 55٪ و 70٪ فيما يتعلق بمليمول من كربوكسالدهيد السيكلوهيكسيل المضاف إلى التفاعل. احسب العائد النهائي للماساريميسين عن طريق الحصول على كتلة ماساريميسين المنقى وحساب العائد النظري للتفاعل باستخدام الصيغة التالية:
      ٪ العائد = figure-protocol-2 × 100٪
  16. تأكيد هيكل masarimycin بواسطة الرنين المغناطيسي النووي.
    1. تذوب ~ 10 ملغ من عينة ماساريميسين في 0.5 مل من CDCl3. باستخدام ماصة باستور ، انقل المحلول إلى أنبوب NMR 5 مم وقم بتغطية الأنبوب. ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في مطياف.
    2. احصل على أطياف 1H و 13C NMR باستخدام تجارب الشركة المصنعة المعدة مسبقا. وترد تخصيصات التحول الكيميائي والأطياف التمثيلية في الأشكال التكميلية 3-4.
  17. يخزن ماساريميسين جافا أو مذابا في DMSO (التركيز النهائي 25 ملليمتر) عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. إجراء الميكروويف لإعداد ماساريميسين

  1. تحضير محاليل 0.6 M من سيكلوهيكسيلامين ، سيكلوهكسيل كاربوكسالدهيد ، سيكلوهيكسيل إيزوسياند ، وحمض أو-يودوبنزويك في الأسيتونيتريل.
  2. أضف قضيب تحريك و 10 مل من الأسيتونيتريل إلى قارورة تفاعل ميكروويف زجاجية.
  3. أضف 2 مل من سيكلوهيكسيلامين (0.6 متر في الأسيتونيتريل)، و2 مل من كربوكسالدهيد السيكلوهكسيل (0.6 متر في الأسيتونيتريل)، و7 مل من الأسيتونيتريل إلى القارورة.
  4. ضع قارورة تفاعل الميكروويف في دوار الميكروويف. حرك الخليط، وقم بتسخينه لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية عند إعداد طاقة يبلغ 400 واط، واتركه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  5. أضف 2 مل من حمض o-iodobenzoic (0.6 M في الميثانول) و 2 مل من إيزوسيانيد السيكلوهكسيل (0.6 M في acetonitrile) إلى القارورة. حرك الخليط ، وقم بتسخينه إلى 100 درجة مئوية في الميكروويف لمدة 40 دقيقة عند إعداد طاقة 400 واط واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  6. راقب تقدم التفاعل بواسطة TLC (90:10 الهكسان: الأيزوبروبانول) باستخدام بخار I2 بعد الانتهاء من الخطوة 3.5.
    ملاحظة: إذا أظهر TLC أن التفاعل غير مكتمل (أي بقع متعددة على TLC)، فضع قارورة التفاعل مرة أخرى في الميكروويف واضبط شروط الميكروويف الموضحة في الخطوة 3.5.
  7. بمجرد اكتمال التفاعل ، صب المحلول في قارورة مستديرة القاع سعة 100 مل وتبخرها حتى تجف باستخدام مبخر دوار.
  8. اتبع الخطوات 2.6-2.16 أعلاه لإكمال العمل المائي وتنقية وتوصيف ماساريمايسين.

4. اختبار التآزر والعداء

  1. تنمو المكورات العقدية الرئوية R6 على لوحات أجار مولر-هينتون (MH) التي تحتوي على 5٪ (v / v) دم الأغنام عند 37 درجة مئوية في ظل الظروف اللاهوائية. في جميع التجارب ، استخدم خلايا المرور الثانية المزروعة في 5 مل من مرق MH عند 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية حتى OD600 هو ~ 0.4.
  2. إخضاع المثبطات masarimycin و optochin للتخفيف التسلسلي 1: 2 في المذيبات المعنية ، مع التركيزات الناتجة المحيطة بقيم الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) لكل مثبط.
    1. قم بإجراء التخفيف الأولي للماساريميسين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) حتى يتم الوصول إلى تركيز 100 ميكرومتر. من هذه النقطة ، قم بعمل تخفيفات masarimycin في مرق MH. قم بإعداد محلول مخزون الأوبتوشين (3.5 ملليمتر) عن طريق إذابة الأوبتوشين المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في مرق MH المعقم.
      ملاحظة: تم تصنيع حلول مخزون Masarimycin عند 25 mM في DMSO.
  3. إلى صفيحة ميكروتيتر معقمة من 96 بئرا ، أضف 2 ميكرولتر من كل تخفيف أوبتوشين إلى كل صف من الصفيحة. إلى نفس اللوحة، أضف 2 ميكرولتر من كل تخفيف ماساريميسين إلى كل عمود لإنشاء مجموعة من تركيزات الأوبتوتشين والماساريميسين على اللوحة (الشكل 2).
  4. أضف مرق MH المعقم (93 ميكرولتر) إلى كل بئر يحتوي على المثبطات المذكورة أعلاه. قم بتلقيح ألواح الميكروتيتر ب 5 ميكرولتر من الثقافة (OD600 ~ 0.4) من الخطوة 4.1.
    ملاحظة: عادة ما يتم تلقيح لوحة 96 بئرا في ظل ظروف لاهوائية في محطة عمل لاهوائية. الحجم النهائي في البئر هو 100 ميكرولتر.
  5. تنمو الثقافات لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت الظروف اللاهوائية ، تليها إضافة 30 ميكرولتر من محلول 0.01٪ (م / v) من ملح الصوديوم ريسازورين. احتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح بتكوين اللون وتثبيته.
    ملاحظة: يتم تحضير محلول ريسازورين عن طريق إذابة المركب في الماء المقطر ويمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  6. اقرأ مباشرة قيم التركيز من اللوحة وقم بتعيين أدنى تركيز مثبط لم يلاحظ له نمو بكتيري (اللون الأزرق) على أنه [X] (انظر الخطوة 4.7.1) ، أي أدنى تركيز مثبط للدواء في وجود الدواء المساعد.
    ملاحظة: يتم تحديد النمو البكتيري الإيجابي في الآبار بواسطة صبغة ريسازورين التي تتحول إلى اللون الوردي. يتم تحديد قيم MIC لكل دواء بمفرده (أي في حالة عدم وجود دواء مشترك) بطريقة مماثلة باستخدام اختبار RESSAURIN MIC35 مع كل دواء على حدة (الشكل التكميلي 5). MICs في S. pneumoniae هي 7.8 ميكرومتر و 15.85 ميكرومتر للماساريميسين وأوبتوشين ، على التوالي.
  7. أوجد التركيز المثبط الكسري (FIC) ومؤشر FIC (FICI) باستخدام المعادلات التالية.
    1. FIC = [X] / MIC x ، حيث [X] (من الخطوة 4.6) هو أدنى تركيز مثبط للدواء في وجود الدواء المشترك ، و MICx هو أدنى تركيز مثبط للدواء في غياب الدواء المساعد.
    2. FICI = FICmasarimycin +FIC مضاد حيوي
      ملاحظة: FIC I < 0.5 = تآزري ، 0.5 < FIC I < 1 = مضاف ، 1 < FIC I < 4 = غير مبال ، FIC I > 4 = عدائي.

5. الدراسة الصرفية

  1. تنمو عصية subtilis 11774 على لوحات أجار لوريا بيرتاني (LB) (10 جم / لتر من التريبتون ، ومستخلص الخميرة 5 جم / لتر ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم) تحتوي على 1.5٪ باكتو أجار عند 37 درجة مئوية. في جميع التجارب ، استخدم خلايا المرور الثانية المزروعة في 5 مل من مرق LB عند 37 درجة مئوية حتى OD600 = 1. تنمو S.pneumoniae بنفس الطريقة كما في الخطوة 4.1.
  2. بعد الحصول على كثافة زراعة الخلايا مع OD 600nm = 1 ل B. subtilis ، أو OD600nm = 0.4 ل S. pneumoniae ، أضف masarimycin باستخدام ماصة إلى أنبوب الزرع المسمى "المعالج" إلى تركيز نهائي قدره 3.8 μM (0.75x MIC ل B.subtilis) ، أو 5.85 μM (0.75x MIC ل S.pneumoniae). إلى أنبوب الثقافة الثاني المسمى "التحكم" ، أضف حجما مكافئا من DMSO.
  3. بالنسبة ل B.subtilis ، ضع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة. بالنسبة ل S. pneumoniae ، احتضن الخلايا دون أن تهتز في ظل ظروف لاهوائية.
  4. بعد 90 دقيقة ، قم بإصلاح الثقافات كيميائيا في خليط 1:10 (v / v) من وسائط الثقافة وتثبيت المخزن المؤقت (20 mM HEPES ، 1٪ الفورمالديهايد (الرقم الهيدروجيني 6.8)) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد اكتمال التثبيت ، ضع 10-20 ميكرولتر من العينات على شرائح المجهر الزجاجية باستخدام ماصة واتركها تجف في الهواء. قم بإصلاح العينات المجففة بالهواء عن طريق تسخين الشرائح الزجاجية باستخدام موقد بنسن.
  5. بعد تثبيت الحرارة ، صبغ العينات مع إضافة 100 ميكرولتر من 0.1 ٪ (م / v) الميثيلين الأزرق (محلول في 20 ٪ (v / v) الإيثانول). احتضن الشرائح الملطخة لمدة 10 دقائق واغسل الصبغة الزائدة باستخدام dH2O. ثم ، سخني الشرائح الملطخة بلطف إلى 60 درجة مئوية في فرن لمدة 15-20 دقيقة لجلب الخلايا إلى مستوى بؤري مشترك.
  6. قم بإغلاق العينات الملطخة عن طريق وضع غطاء مجهري فوق الخلايا الملطخة. ثم ، قم بإغلاق الحواف باستخدام أسمنت شريحة المجهر. ضع شريحة المجهر المختومة على مرحلة المجهر واجعل الصورة في بؤرة التركيز عند تكبير 100x باستخدام المجهر ذي المجال الساطع.
  7. ضع قطرة من زيت الغمر على شريحة المجهر واجعل مجال الرؤية يركز باستخدام التكبير 1000x. الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر والبرامج المرتبطة به. احصل على صور باستخدام توازن اللون الأبيض التلقائي وإعدادات فتحة العدسة على البرنامج.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن معالجة الصور باستخدام برنامج ImageJ مفتوح المصدر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

Masarimycin هو مثبط للجراثيم جزيء صغير من B. subtilis و S. pneumoniae وقد ثبت أنه يثبط GlcNAcase LytG المفعول في B. subtilis 35,37 ويستهدف جدار الخلية في S. pneumoniae 37. يمكن تحضير Masarimycin بكفاءة إما عن طريق التوليف العضوي الكلاسيكي أو بمساعدة الميكروويف مع غلة في نطاق 55٪ -70٪. يتميز التوليف بمساعدة الميكروويف بانخفاض كبير في الوقت اللازم لتوليف المركب. يعمل التوليف بمساعدة الميكروويف على تقصير ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

Masarimycin هو مثبط واحد للجراثيم الدقيقة مولار لنمو B. subtilis35 و S. pneumoniae37. في B. subtilis ، ثبت أن masarimycin يثبط GlcNAcase LytG35 ، في حين لم يتم تحديد الهدف الجزيئي الدقيق في جدار الخلية من S. pneumoniae 37. يوفر تخليق ماساريميسين باستخدام إما التوليف العضوي الكلاسيكي أو إجراء الميكروويف المثبط في عائد جيد ونقاء عال. يمكن أن يعزى انخفاض غلة ماساريميسين عادة إلى أكسدة كربوكسالدهيد سيكلو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لدى Reid, C. W. ملكية فكرية تنطوي على تطبيقات محددة من ماساريميسين.

شكر وتقدير

تم دعم البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم المنحة 2009522. تم دعم تحليل NMR ل masarimycin من قبل جائزة برنامج الأجهزة البحثية الرئيسية للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم المنحة 1919644. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-حمض اليودوبنزويكSIGMA-ALDRICHI7675-25Gمسحوق أصفر فاتح إلى برتقالي بني
2-PropanolSIGMA-ALDRICH109827-4Lسائل قابل للاشتعال ، مهيج ، عديم اللون
AcetonitrileSIGMA-ALDRICH34851-4Lسائل قابل للاشتعال ، مهيج ، عديم اللون
سائل ألواح السيليكا المدعومة من الألومنيومSorbtech4434126هلام السيليكا XG F254 على ألواح الألمنيوم المدعومة
بالكلوروفورم-dSIGMA-ALDRICH151823-50Gمذيب
لمطياف الكتلة المضغوطAdvion-InterchimCMSمجهز بمصدر APCI ومسبار تحليل المواد الصلبة في الغلاف الجوي
Corning Costar 96 ألواح سفلية مسطحة جيدا -مادة كيميائية معقمة07-200-90لمقايسات التآزر / العداء
زلات الغطاءفيشر الكيميائية12-547للفحص المجهري
CyclohexanecarboxaldehydeCHEM-IMPEX INT'L INC.24451قابل للاشتعال ، مهيج ، عديم اللون إلى سائل
وردي سيكلوهكسيل إيزوسيانيدSIGMA-ALDRICH133302-5Gمهيج ، سائل عديم اللون ، رائحة كريهة للغاية
CyclohexylamineSIGMA-ALDRICH240648-100MLسائل تآكل ، قابل للاشتعال ، مهيج ، عديم اللون ما لم يكن ملوثا
أسيتات الإيثيلSIGMA-ALDRICH537446-4Lقابل للاشتعال ، مهيج ، عديم اللون
خرطوشة سيليكا فلاش سائل (12 جم)عبوة Advion-InterchimPF-50SIHP-F0012من أعمدة السيليكا الفلاش (12 جم) لتنقية الماساريميسين
فورمالديهايدSIGMA-ALDRICHF8775-25MLعامل تثبيت للفحص المجهري
HEPESSIGMA-ALDRICHH8651-25Gعازلة لمحلول تثبيت الفحص المجهري
الهكسان ، خليط من الأيزومراتSIGMA-ALDRICH178918-4Lضار بيئيا ، قابل للاشتعال ، مهيج ، مخاطر صحية ، سائل عديم اللون
مطياف الكتلة المضغوط عالي الأداءمسبارتحليل المواد الصلبة في الغلاف الجوي (في أسرع وقت ممكن) ، تفريغ
eppendorfعاليبالإضافةفراغ بمساعدة قوة الطرد المركزي ودرجة
الحرارة حمض الهيدروكلوريكSIGMA-ALDRICH258148-2.5Lحمض الهيدروكلوريك السائل المسبب للتآكل ، المهيج ، عديم اللون
SIGMA-ALDRICH320331-2.5Lالحمضي القوي
فيشر الكيميائية12-365-19للفحص المجهري
اليود ، بلورات معاد تصعيها AlfaAesar41955ضارة بيئيا ، مهيجة ، مخاطر صحية ، بلورات رمادية داكنة / أرجوانية
Mestre MnovaMestreLab Researchبرنامج لمعالجة أطياف الرنين المغناطيسي النووي
الميثانولSIGMA-ALDRICH439193-4Lقابلة للاشتعال ، سامة ، مخاطر صحية ، عديم اللون سائل
الميثيلين الأزرقSIGMA-ALDRICHM9140-25Gصبغة مجهرية لتلوين جدران الخلايا
لوحات meuller-hinton agar + 5٪كيميائية لصيادB21176Xوسائط النمو للعقدية الالتهاب الرئوي
مرق مولر هينتونفيشر كيميكالDF0757-17-6وسائط النمو لشرائح مجهر العقدية الرئوية
فيشركيماويك22-310397للفحص
المجهري محطة مختبر التوليف بالميكروويفMILESTONESTARTSYNTH الذي يتطلب تهوية غطاء الدخان ، ومجهز بأنابيب
الرنين المغناطيسيللتوليف SIGMA-ALDRICHZ562769-5EA5 مم أنابيب الرنين المغناطيسي النووي 600 ميجا هرتز
الرنين المغناطيسي النووي (NMR)BrukerAscend 400مغناطيس كبير فائق التوصيل (400 ميجا هرتز)
أوبتوشينفيشر كيميائيAAB21627MCإيثيل هيدروكوبرين هيدروكلوريد
لوحات بتريCelltreat229695لإعداد ألواح أجار لنمو البكتيريا
بريمو ستار ساطع المجال / مجهر تباين المرحلة مع كاميرا ERc5sZeissل دراسات التشكل
puriFlashinterchimXS520plusنظام تنقية كروماتوغرافيا الفلاش
resazurinSIGMA-ALDRICHR7017-1Gلمقايسات التآزر / العداء
المبخر الدوارHeidolphHei-VAP قيمة "The Collegiate"مبخر المذيبات
بيكربونات الصوديومSIGMA-ALDRICHS6014-500Gمهيج ، أبيض مسحوق
كلوريد الصوديومفيشر الكيميائيةS271-1بلوري ، عديم اللون
كلوريد الصوديومSIGMA-ALDRICHS5886-500Gلنمو B.subtilis وإعداد وسائط LB
كبريتات الصوديومSIGMA-ALDRICH7985592-500Gاللامائية ، الحبيبية ، بيضاء
التربتونفيشر الكيميائيةBP1421-500لنمو B.subtilis و إعداد محطة العمل اللاهوائية LB media
Whitney DG250 Workbiology InternationalDG250. خليط الغاز اللاهوائي المستخدم: 5٪ هيدروجين ، 10٪ ثاني أكسيد الكربون ، توازن
خميرة النيتروجين مستخلصفيشر الكيميائيةBP1422-500لنمو B.subtilis وإعداد LB media
Zen Lite (الأزرق) البرمجياتZeissللحصول على الصور المجهرية
بالرنين النووي Advion-Interchim CMS مطياف الكتلة المضغوط الدقة منخفض الدقة إلى زيت الغمر مواد دم الأغنام النووي الدائري

المراجع

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660(2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015(2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74(2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630(2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331(2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652(2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541(2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80(2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1(2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117(2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198(2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Bacillus subtilis Streptococcus pneumoniae
تخليق ماساريميسين ، وهو مثبط جزيء صغير للنمو البكتيري الإيجابي الجرام
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.