يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استكشاف ميثيل أرجينين بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي

1.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63245

⸱

ديسمبر 16, 2021

 ,  ,  , 
1Gottfried Schatz Research Center for Cell Signaling, Metabolism and Aging, Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz, 2Ministry of Education, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory of Gastrointestinal Cancer (Fujian Medical University)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي التحضير والقياس الكمي للأرجينين الحر والمرتبط بالبروتين وميثيل أرجينين بواسطة 1التحليل الطيفي H-NMR.

الملخص

عادة ما يتم ميثيل الأرجينين المرتبط بالبروتين في العديد من البروتينات وينظم وظيفتها عن طريق تغيير الخصائص الفيزيائية والكيميائية ، وتفاعلها مع الجزيئات الأخرى ، بما في ذلك البروتينات الأخرى أو الأحماض النووية. يقدم هذا العمل بروتوكولا سهل التنفيذ لقياس أرجينين ومشتقاته ، بما في ذلك ثنائي ميثيل أرجينين غير المتماثل والمتماثل (ADMA و SDMA ، على التوالي) ومونوميثيل أرجينين (MMA). بعد عزل البروتين من سوائل الجسم البيولوجية أو الأنسجة أو تحلل الخلايا ، يتم وصف طريقة بسيطة للتجانس وترسيب البروتينات والتحلل المائي للبروتين. نظرا لأن التحلل المائي يحتوي على العديد من المكونات الأخرى ، مثل الأحماض الأمينية الأخرى والدهون والأحماض النووية ، فإن خطوة التنقية باستخدام استخراج الطور الصلب (SPE) ضرورية. يمكن إجراء SPE يدويا باستخدام أجهزة الطرد المركزي أو روبوت سحب العينات. تبلغ حساسية ADMA باستخدام البروتوكول الحالي حوالي 100 نانومول / لتر. الحد الأعلى للكشف عن الأرجينين هو 3 مليمول / لتر بسبب تشبع SPE. باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة قوية ، تمتد من إعداد العينات البيولوجية إلى الكشف القائم على الرنين المغناطيسي النووي ، مما يوفر تلميحات ومزالق قيمة للعمل الناجح عند دراسة أرجينين ميثيلوم.

المقدمة

خلال العقدين الماضيين ، تم التعرف على مثيلة بقايا الأرجينين كتعديل أساسي بعد الترجمة للبروتينات. إنه يؤثر على العمليات البيولوجية الأساسية مثل تنظيم النسخ ونقل الإشارات وغيرها الكثير1. البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم مثيلة أرجينين هي بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMTs)2. المشتقات الرئيسية للأرجينين هي ω- (N G، N G) - ثنائي ميثيل أرجينين غير متماثل (ADMA) ، ω- (N G ، N'G) - ثنائي ميثيل أرجينين متماثل (SDMA) ، و ω-N G-monomethylarginine (MMA) 2.

تستخدم PRMTs S-adenosyl-l-methionine لنقل مجموعات الميثيل إلى مجموعة guanidino الطرفية (مع مجموعتين أمينيتين مكافئتين) من أرجينينالمرتبط بالبروتين 1. يمكن التمييز بين اثنين من الإنزيمات الرئيسية: يحفز كل من الإنزيمات من النوع الأول والنوع الثاني خطوة المثيلة الأولى لتشكيل MMA (والتي تفقد بالتالي تناسقها). بعد هذه الخطوة ، تستخدم إنزيمات النوع الأول (على سبيل المثال ، PRMT1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 6 ، 8) MMA كركيزة لتشكيل ADMA ، بينما تنتج إنزيمات النوع الثاني (بشكل أساسي PRMT5 و PRMT9) SDMA. كان PRMT1 أول بروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز يتم عزله من خلايا الثدييات3. ومع ذلك ، تم الحفاظ على PRMTs تطوريا4 في أخرى مثل الفقاريات غير الثديية ، والحبال اللافقارية ، وشوكيات الجلد ، والمفصليات ، والديدان الخيطيةcnidarians 5 ، والنباتات6 ، والأوليات ، بما في ذلك الفطريات مثل الخميرة7. في كثير من الحالات ، يؤدي خروج المغلوب من أحد PRMTs إلى فقدان الجدوى ، مما يكشف عن الدور الأساسي لأنواع الأرجينين الميثيلي المشاركة في العمليات الخلوية الأساسية مثل النسخ والترجمة ونقل الإشارات وموت الخلايا المبرمج وفصل الطور السائل عن السائل (بمعنى تكوين عضيات بدون غشاء ، على سبيل المثال ، النواة) ، والتي تتضمن بانتظام المجالات الغنية بالأرجينين8،9،10 . وهذا بدوره يؤثر على علم وظائف الأعضاء وحالات المرض ، بما في ذلك السرطان11،12،13 ، الورم النقويالمتعدد 14 ، أمراض القلب والأوعية الدموية 15 ، المرضية الفيروسية ، ضمور العضلات الشوكي16 ، داء السكري 17 ، والشيخوخة1. يعتقد أن زيادة مستويات ADMA في مجرى الدم ، على سبيل المثال ، المستمدة من الرئة18 بسبب انهيار البروتين ، مرتبطة بالخلل البطاني ، والمرض الرئوي المزمن19 ، ومتلازمات أخرى لأمراض القلب والأوعية الدموية20. تم العثور على الإفراط في التعبير عن PRMTs لتسريع تكوين الورم ويرتبط بسوء التشخيص21,22. إلى جانب ذلك ، يؤدي استئصال PRMT6 و PRMT7 إلى النمط الظاهري للشيخوخة الخلوية23. تم العثور على انخفاض كبير في ADMA و PRMT1 أثناء شيخوخة الخلايا الليفية WI-3824.

يتمثل التحدي في فهم كيفية عمل المثيلة في العمليات الفسيولوجية (المرضية) وتحديد وقياس مثيلة البروتين أرجينين. تستخدم معظم الأساليب الحالية الأجسام المضادة للكشف عن أرجينين الميثيلي. ومع ذلك ، لا تزال هذه الأجسام المضادة خاصة بالسياق وقد تفشل في التعرف على أشكال مختلفة من البروتينات المثيلية للأرجينين25,26. في البروتوكول الموصوف ، يمكن قياس جميع مشتقات الأرجينين المذكورة أعلاه بشكل موثوق عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، أي بمفردها ، مجتمعة ، أو ، كما هو الحال في معظم الحالات ، داخل المصفوفات البيولوجية المعقدة مثل الخلايا حقيقية النواة (على سبيل المثال ، من الخميرة أو الفأر أو الأصل البشري) والأنسجة27 ، وكذلك المصل28. بالنسبة للبروتينات وتلك المصفوفات المعقدة ، يعد التحلل المائيللبروتين 29 شرطا أساسيا لتوليد الأحماض الأمينية الحرة (المعدلة) ، مثل الأرجينين و MMA و SDMA و ADMA. يتيح استخراج المرحلة الصلبة (SPE)30 إثراء المركبات ذات الأهمية. أخيرا ، يسمح التحليل الطيفي 1H-NMR بالكشف المتوازي عن الأرجينين وجميع مشتقات الميثيل الرئيسية للأرجينين. يأتي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي مع ميزة أنه كمي حقا ، وقابل للتكرار بدرجة كبيرة ، وتقنية قوية31،32. يمكن إجراء قياسات الرنين المغناطيسي النووي النهائية بعد ذلك عندما يتم جمع العديد من العينات وإعدادها. أخيرا ، يركز هذا البروتوكول بشكل أساسي على تحضير العينات لأن هذا لا يتطلب مطياف الرنين المغناطيسي النووي الخاص به. يمكن إجراؤه في معظم مختبرات الكيمياء الحيوية. ومع ذلك ، يتم توفير بعض التلميحات التي يجب إجراء قياسات التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي بشأنها في هذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

واستخدمت تحلل بروتين الخميرة كعينات للنتائج التمثيلية لهذا العمل. يتم تلخيص البروتوكول بأكمله في الشكل 1.

1. تحضير المواد والكواشف

  1. الميثانول / الماء: قم بإعداد خليط من جزأين من 99٪ ميثانول (MeOH) وجزء واحد من H 2 O، المسمى MeOH / H 2 O. قم بتخزين MeOH النقي و MeOH / H2O عند -20 درجة مئوية لتقليل تبخر الكحول وزيادة استقرار العينة.
  2. حمض الهيدروكلوريك (HCl): يخفف 9 مول / لتر من حمض الهيدروكلوريك المركز (12.0 مول / لتر أو 37٪) وكذلك 0.1 مول / لتر من حمض الهيدروكلوريك. يستخدم المحلول الأعلى تركيزا (9 مول / لتر) للتحلل المائي للبروتين ، بينما يستخدم المحلول الأقل تركيزا (0.1 مول / لتر) لاستخراج المرحلة الصلبة.
    تنبيه: العمل داخل غطاء الدخان.
  3. تحضير محلول بديل ل SPE يحتوي على 10٪ من محلول الأمونيا المشبعة (المخزون: 30٪ وزن / وزن الأمونيا) ، و 50٪ من الميثانول ، و 40٪ من الماء (v / v).
  4. المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي: إذابة 5.56 جم من فوسفات هيدروجين ثنائي الصوديوم (Na 2 HPO 4 ، 0.08 مول / لتر) ، 0.4 جم من 3- (ثلاثي ميثيل سيليل) حمض البروبيونيك - 2،2،3،3-d4 ملح الصوديوم (TSP ، 5 مليمول / لتر) ، 0.04٪ (وزن / حجم) من أزيد الصوديوم (NaN3) في 500 مل من ثاني أكسيد الديوتيريوم (D2O) والتكيف مع الرقم الهيدروجيني7.4 (باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم ، على التوالي) (انظر جدول المواد). تحقق من نقاء كل دفعة عازلة جديدة بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
    ملاحظة: يجب أن تكون كمية أي ملوثات (مثل الإيثانول) منخفضة قدر الإمكان.
  5. املأ أنابيب اللب بخرز أكسيد الزركونيوم (أنابيب 2 مل وخرز 1.4 مم مناسبة لمعظم التطبيقات ، ولكن تتوفر أنواع مختلفة) (انظر جدول المواد). املأ ما يقرب من 10-20 حبة يدويا أو اشتر أنابيب مملوءة مسبقا ، والتي تتوفر أيضا.
  6. حافظ على الماصات والنصائح ذات الصلة جاهزة في حدود 10-1000 ميكرولتر.
    ملاحظة: تم استخدام المياه عالية النقاء ، المعينةباسم H 2 O ، المحددة بمقاومة عالية تبلغ ≥18.2 MΩ · cm-1 ، طوال العمل. يتوافق مع الماء المقطر المزدوج.

2. جمع العينات وتخزينها

  1. قم بتجميد العينات السائلة (المصل / البلازما ، طاف زراعة الخلايا ، إلخ) بالنيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تحضير المواد الصلبة كما هو مذكور أدناه.
    1. اجمع الخلايا من مزارع الخلايا (3-5 ملايين خلية) إما عن طريق جمع الخلايا الملتصقة ، بعد غسلها بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات ، أو كشط وطرد مركزي ، أو طرد مركزي مباشر للخلايا المزروعة في التعليق.
    2. قم بإزالة المواد الطافية الخلوية (التي يمكن جمعها لمزيد من التحليل ، إما عن طريق القياس المباشر المتتالي ، انظر الخطوة 6 ، أو بعد ترسيب البروتينات القابلة للذوبان ، انظر الخطوة 3.1) ، ثم قم بتجميد الكريات بالنيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. لمزيد من المعالجة، راجع الخطوة 3.2.
    3. تخزين وجمع الأنسجة حسب الهدف من الدراسة. بالنسبة للأنسجة المتجانسة للغاية ، مثل الكبد أو العضلات ، قم بتحليل أي جزء منها. على سبيل المثال ، في حالة دماغ الفأر ، حدد مثيلة الأرجينين العالمية للدماغ بأكمله أو أقسام الدماغ.
      ملاحظة: الوزن المثالي للأنسجة المراد معالجتها هو 30-60 ملغ. من المستحسن تجميد وسحق الدماغ بأكمله واستخدام القسمة منه. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أجزاء معينة من الدماغ (على سبيل المثال ، مناطق أمامية ، مخيخ ، مناطق قذالية ، أو نصف كرة واحد ، يزن ~ 250 مجم).

3. إعداد العينة الأولية

ملاحظة: قم بأداء العمل على الثلج ، مع الحفاظ على برودة MeOH. يجب أيضا حفظ العينات على الجليد لتجنب تدهور البروتين.

  1. بالنسبة للعينات السائلة ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول المثلج إلى 200 ميكرولتر من العينة. تابع مع الخطوة 3.3.
    ملاحظة: في حالة توفر عينة أقل ، اضبط وحدات التخزين وفقا لذلك ؛ عادة ما تكون حساسية الرنين المغناطيسي النووي عالية بما يكفي لكميات العينات الأصغر ، ولكن يجب اختبارها بشكل فردي.
  2. في حالة المواد الصلبة ، قم بإعداد ما يكفي من أنابيب 1.5 مل للمحللات (تستخدم للطرد المركزي بعد التجانس).
    1. بعناية, ولكن بدقة, إعادة تعليق كريات الخلية في 600 ميكرولتر من MeOH / H2O ونقل المرحلة السائلة بأكملها إلى أنابيب اللب.
    2. ضع الأنسجة في أنابيب اللب (يمكنك وزنها مباشرة في الأنابيب) وأضف 600 ميكرولتر من MeOH / H2O (ل 30-60 مجم ؛ اضبط إذا كان الوزن يختلف اختلافا كبيرا).
    3. ضع الأنابيب في خالط الأنسجة (انظر جدول المواد) وقم إما بالتجانس مرة واحدة لمدة 20 ثانية مع اهتزاز شديد (لكريات الخلايا والأنسجة الرخوة) أو مرتين لمدة 20 ثانية لكل منهما (أو أطول إذا لزم الأمر) بفاصل 5 دقائق بينهما (للأنسجة المتيبسة).
    4. بعد التجانس ، ضع العينات على الفور على الجليد مرة أخرى وانقل المحللين بالكامل إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مل.
  3. قم بتخزين العينات لمدة 30 دقيقة على الأقل (حتى عدة أيام) عند -20 درجة مئوية قبل المعالجة الإضافية.
  4. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. في غضون ذلك ، قم بإعداد ما يكفي من أنابيب 1.5 مل لجمع المواد الطافية.
    ملاحظة: قد يتم التخلص من هذا الطافي (المسمى "(1)" في الشكل 1) ، أو تجفيفه بالتجميد ، ومعالجته مباشرة للرنين المغناطيسي النووي (الخطوة 6) أو تحليله بطريقة أخرى.
  5. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام راسب MeOH (= الحبيبات التي تم الحصول عليها بعد الخطوة 3.1 أو 3.2.2 ، على التوالي) لمزيد من التحليل الذي يحتوي ، من بين أشياء أخرى ، على مكونات مثل الأحماض النووية والدهون والبروتينات الميثيلية الأرجينينية. استمر في التحلل المائي للبروتين أو قم بتخزين الكريات عند -20 درجة مئوية لبضعة أيام.

4. التحلل المائي للبروتين

  1. أضف 500 ميكرولتر من 9 مول/لتر من حمض الهيدروكلوريك إلى كل عينة. بعد ذلك ، قم باقتطاع أغطية كل أنبوب بالمقص ووضعها في أنابيب الثقافة الزجاجية (الشكل 2 أ). بعناية ، ولكن بإحكام ، أغلق الأغطية الحمراء (وبالتالي التحقق من الختم).
    ملاحظة: قبل الاستخدام ، تحقق دائما من كل مانع تسرب (رقائق PTFE رمادية داخل أغطية اللولب الأحمر) من أجل الشد المناسب وتنظيفها بانتظام بالماء.
  2. عند الانتهاء ، ضع الأنابيب في دورق مملوء جزئيا بالرمل (لنقل الحرارة بشكل أفضل) وقم بتحلل العينات لمدة 16 ساعة عند 110 درجة مئوية في غرفة التجفيف.
  3. بعد التحلل المائي ، قم بتبريد العينات (~ 1 ساعة).
  4. بعد ذلك ، قم بالتجفيد طوال الليل باستخدام جهاز طرد مركزي مع فراغ عالي (أقل من 100 باسكال).
  5. قم بإذابة الكريات - إذا كانت جافة تماما (إذا لم تكن كذلك ، استمر في التجفيد) - في 1 مل من 0.1 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك وأضف 50 ميكرولتر من الكلوروفورم (CHCl3) إلى كل أنبوب ؛ قم بإذابة الحبيبات تماما باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر ، وبالتالي خلط السوائل ، ثم نقل الحجم الكامل إلى أنبوب جديد.
    تنبيه: اعمل دائما بكميات صغيرة لتقليل التبخر الشديد
  6. ثم ، جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. اجمع بعناية المرحلة العليا من السائل ثنائي الطور الذي يحتوي على الجزء القابل للذوبان في الماء (الشكل 2B ، الجزء ذي الكثافة الأقل) باستخدام ماصة واملأه في أنابيب جديدة. استخدم أنابيب سعة 1.5 مل ل SPE اليدوي (القسم 5.2) أو قوارير زجاجية ل SPE الروبوتية (القسم 5.3 والشكل 2D). تجنب انسكاب CHCl3 ومحتوياته (الشكل 2C).

5. استخراج المرحلة الصلبة (SPE)

  1. قبل الاستخدام الأول ، قم بتنظيف خراطيش SPE مرتين باستخدام 1 مل من محلول الاستبدال (الخطوة 1.3) متبوعا بالطرد المركزي عند 800 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (توضع في أنابيب 15 مل). يمكن استخدامها 10-20 مرة لكل منهما.
  2. دليل SPE
    1. قم بتهيئة الخراطيش مسبقا (انظر جدول المواد) في كل تشغيل باستخدام 1 مل من الميثانول النقي و 2 × 1 مل من PBS ، في كل مرة يتبعها الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة (توضع في أنابيب سعة 15 مل).
    2. بعد ذلك ، قم بتحميل العينات (من الخطوة 4.7) على خراطيش SPE وطرد مركزي لها عند 600 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. ثم ، ضع دورة غسيل كما هو مذكور أدناه.
      1. أضف ثلاثة أضعاف 1 مل من H2O (كل منها متبوعا بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 800 × جم في درجة حرارة الغرفة).
      2. أضف خمسة أضعاف 1 مل من 0.1 مول / لتر حمض الهيدروكلوريك (كل منها متبوعا بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 800 × جم في درجة حرارة الغرفة).
      3. أضف مرتين في 1 مل من MeOH (كل منها متبوعا بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 800 × جم في درجة حرارة الغرفة).
    4. بعد ذلك ، قم بشطف الأرجينين ومشتقاته بمحلول بديل 3 × 1 مل (متبوعا بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 800 × جم في درجة حرارة الغرفة) في أنبوب واحد سعة 15 مل.
      ملاحظة: يعمل المحلول البديل كمحلول للأرجينين ومشتقاته ويستخدم أيضا لتنظيف الخراطيش (يتم غسل جميع المواد إما قبل الشطف أو عند قيمة الأس الهيدروجيني الأساسية للمحلول البديل). ومع ذلك ، لتجنب التلوث بمرور الوقت ، يجب أن تكون إعادة الاستخدام محدودة (انظر الخطوة 5.1).
  3. روبوتية SPE
    ملاحظة: هنا ، يتم تزويد روبوت ماصة (الجزء الرئيسي يتكون من إبرة ماصة ، ومحطة غسيل للإبرة ، وإمدادات كاشف ، ومواضع للعينات والشطف ، انظر جدول المواد) بحامل خرطوشة لأعمدة SPE. بالنسبة للأدوات الأخرى ، تأكد من أن تكون مجهزا بالكامل بجميع الأشياء المدرجة.
    1. املأ المادة الطافية (من الخطوة 4.7) مباشرة في قوارير زجاجية بختم PTFE (الشكل 2D) ، وقم بإعداد كواشف كافية (100 مل من كل منها ، أي محلول بديل ، 99٪ من MeOH ، PBS ، H 2 O ، و 0.1 منmol / L HCl) ، 5 مل أنابيب للشطف ومحلول الغسيل لإبرة الروبوت (عادة H2O).
    2. استخدم تطبيقا أو طريقة في برنامج الروبوت بناء على الخطوات الموضحة ل SPE اليدوي (الخطوة 5.2).
      ملاحظة: قد تختلف التفاصيل كثيرا بين موردي الأدوات ، لذا راجع دليل البرنامج الخاص بالروبوت المعني للبرمجة. عادة ما يعمل روبوت السحب عن طريق تطبيق ضغط الهواء على الخراطيش بدلا من الطرد المركزي ، وهو الفرق الرئيسي. إذا تم إنشاء البروتوكول وتشغيله لأول مرة ، فقم بتضمين عناصر تحكم (على سبيل المثال ، L-arginine بتركيز معروف) للتحقق من سير العمل الأمثل.

6. التحضير النهائي للرنين المغناطيسي النووي

  1. تجفيف العينات بالتجميد بين عشية وضحاها لاستكمال الجفاف للتخلص من الأمونيا و H2O.
  2. قم بإذابة كل عينة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي (الخطوة 1.4) وانقلها إلى أنابيب الرنين المغناطيسي النووي. الأهم من ذلك ، يجب أن يكون الحجم هو نفسه في جميع الأنابيب ، ويجب أن تكون العينات متجانسة (خالية من المخلفات والدهون ، والتي تميل إلى التجميع).
    ملاحظة: تتجاوز تفاصيل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي مراجعة الطريقة هذه ويتم وصفها بمزيد من التفصيل في مكان آخر27. هنا ، يتم شرح المتطلبات والخطوات الرئيسية فقط. يتم إجراء القياس الكمي للأرجينين ومستقلباته على مطياف الرنين المغناطيسي النووي 600 ميجاهرتز (انظر جدول المواد). من حيث المبدأ ، يمكن استخدام أي شدة مجال أخرى لمقياس الطيف NMR / NMR ، بشرط أن يتم الكشف عن إشارات الرنين المغناطيسي النووي للأرجينين والأرجينين الميثيلي بحساسية كافية وبدون تداخل الإشارة. يمكن استخدام أي رأس مسبار مع تدرجات المحور z قادرة على تسجيل 1أطياف H ، بشرط أن يتم إعداد تسلسل النبض وفقا لذلك.
  3. سجل طيفا 1D باستخدام تسلسل نبض CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)33,34 (cpmgpr1d ، 512 عملية مسح ، حجم FID 73728 ، عرض طيفي 11904.76 هرتز على 600 ميجاهرتز NMR ، تأخير إعادة التدوير 4 ثوان) مع قمع إشارة الماء باستخدام التشبع المسبق.
  4. في هذه التجارب ، قم بإزالة أدوات التوصيل العددية 1H عن طريق الفصل الافتراضي ، مما يقلل من تداخل الإشارة. سجل إضافية لأسئلة محددة و / أو عينات أو مصفوفات معقدة ، على سبيل المثال ، 1 H-13C-heteronucleocore أحادي التماسك الكمي (HSQC) أطياف27.
    ملاحظة: بالنسبة للمصفوفات الأكثر تعقيدا التي يمكن فيها تداخل إشارات الرنين المغناطيسي النووي 1 H للأرجينين الميثيلي جزئيا مع إشارات الرنينالمغناطيسي النووي 1 H من المستقلبات الأخرى (مثل الليسين) ، يلزم وجود أطياف 1H متجانسة النواة J (JRES)35.
  5. قم بإجراء القياس الكمي المطلق من خلال دمج شدة الذروة ذات الصلة لمعايير التركيز المعروف ، على سبيل المثال ، 100 ميكرومول / أرجينين.
    ملاحظة: بشكل روتيني ، يتم الإبلاغ عن ADMA و SDMA و MMA (انظر جدول المواد) كنسبة بالنسبة إلى الأرجينين. هذا له ميزة كبيرة أنه لا يلزم إجراء تطبيع منفصل (على سبيل المثال ، رقم الخلية ، كتلة الأنسجة ، تركيزات البروتين). في هذه الحالة ، يعمل الأرجينين كمعيار داخلي ، والقياس الكمي النسبي كاف للحصول على معلومات ذات صلة بيولوجيا.
  6. للتمييز بين SDMA و MMA ، يتم تجفيف العينات بالتجميد مرة أخرى للتخلص من D2O (إذا تم إعادة تعليقها في المخزن المؤقت NMR من قبل) ، والذي يتم استبداله بعد ذلك بثنائي ميثيل سلفوكسيد منزوع التثبيط (d6-DMSO) ، مما يتيح حل رنين الميثيل27. لذلك ، قم بشفط العينات من أنابيب الرنين المغناطيسي النووي باستخدام ماصات باستور ، lyophilize ، وحلها في 500 ميكرولتر من d6-DMSO.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بشكل روتيني ، يتم استخدام إسقاطات 1H 1D ل 2D J-resolved (JRES) ، وأطياف الرنين المغناطيسي النووي المنفصلة فعليا لمهام الذروة والقياس الكمي في مختبرنا36. يوضح الشكل 3 أطياف JRES التمثيلية لتحلل بروتين الخميرة المنقى باستخدام بروتوكول SPE الحالي. على الرغم من اختلاف تركيزات كلتا المادتين ، يمكن فصلهما وقياسهما في مصفوفة خلوية. استنادا إلى عدد البروتونات من مجموعة الميثيل المحددة (-CH3) أو الميثيلين (-CH2-) عند التحول الكيميائي المعني ، ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في القسم التالي ، ينصب التركيز الأساسي على الطريقة نفسها ؛ يتم وصف الآثار البيولوجية لمثيلة الأرجينين في قسم المقدمة.

أولا ، قد تحتاج الأنسجة ذات الصلابة المختلفة إلى تعديل تحلل العينة: يمكن تجانس الخلايا من زراعة الخلايا (بما في ذلك البكتيريا والخميرة وما إلى ذلك) والأنسجة مثل الدماغ والكبد الشاب والعضلات الملساء وما إلى ذلك. بالنسبة للأنسجة ذات الصلابة العالية (بما في ذلك كبد كبار السن والشرايين والعظام وما إلى ذلك) ، يجب إجراء التجانس مرتين (انظر الخطوة 3.2.3). ومع ذلك ، لا ينبغي أن تستمر ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم العمل من قبل منح صندوق العلوم النمساوي (FWF) P28854 ، I3792 ، doc.funds BioMolStruct DOC 130 ، DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (المشروع الرئيسي DYNIMO) ، وكالة ترويج البحوث النمساوية (FFG) منح 864690 و 870454 ، مركز أبحاث الأيض التكاملي غراتس. برنامج البنية التحتية النمساوي 2016/2017 ، حكومة ستيريا (Zukunftsfonds) وصندوق بدء التشغيل للمواهب رفيعة المستوى بجامعة فوجيان الطبية (XRCZX2021020). نشكر مركز البحوث الطبية على الوصول إلى مرافق زراعة الخلايا. تم تدريب FZ في إطار برنامج الدكتوراه في الطب الجزيئي ، جامعة غراتس الطبية. تم تدريب Q.Z. في إطار برنامج الدكتوراه في أمراض التمثيل الغذائي والقلب والأوعية الدموية ، جامعة غراتس الطبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب 15 ملGreiner Bio One188271
3- (ثلاثي ميثيل سيليل) حمض البروبيونيك -2،2،3،3-d4 ملح الصوديوم (TSP)أنابيبAlfa AesarA1448
5 مل ، مستدير القاعGreiner Bio One115101
محلول الأمونيا 32٪RothA990.1
Bruker 600 MHz مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، مزود برأس مسبار TXIBruker-
أجهزة الطرد المركزي ، المبردة ، على سبيل المثال 5430 REppendorf5428000010
Chloroform & ge ؛ 99٪ سنوياRoth3313.1
CryocoolThermo ScientificSCC1لنظام SpeedVac
أكسيد الديوتيريوم (D2< / sub>O)مختبرات كامبريدج للنظائرDLM-10-PK
ثنائي ميثيل سلفوكسيد-d6 (d6-DMSO)مختبرات كامبريدج للنظائرDLM-6-1000
التجفيفالموثق9090-0018
أنابيب استزراع DURAN ، 13 × 100 مم ، GL 14 ، 9 ملVWR International212-0375
زيت التفريغ العميق Edwards RV5ThermoScientific 16234611جزء من نظام SpeedVac
أنابيب Eppendorf 1.5 مل روبوتماصة Greiner Bio One616201
Gilson GX-241 AspecGilson Inc.26150008
L-arginineAppliChemA3675
الميثانول & ge; 99٪روث8388.4
ملي كيو ماء أباراتوسميليبورZIQ7000T0
واحة MCX 1 سم مكعب / 30 مجم ، 1 مل خراطيشمياه186000252https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)لونزاLONBE17-512F
Precellys 24 مجانس الأنسجةبيرتين الأدواتP000669-PR240-Ahttps://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/
أنابيب Precellys (أنابيب اللب)VWR International432-0351
Precellyse 1.4 مم حبات أكسيد الزركونيومVWR International432-0356
Reacti-Therm / ReactiVap وحدات التسخين والتحريك والتبخرالحرارية الدوار العلميTS-18820https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820
لأنابيب 1.5 مل ، FA-45-30-11Eppendorf5427753001
Savant Coold CoolingTrap ThermoScientific 15996161جزء من نظام SpeedVac
مكثف الفراغ Savant SpeedVac SPD210Thermo Scientific15906181 جزء من نظام SpeedVac ؛ مجهزة مع دوار لأنابيب 1.5 مل
أغطية لولبية لقوارير الزجاج مع ختم PTFE ، DN9Dr. R. Forche ChromatographieCT11B3011
SeasandRoth8441.3
قوارير زجاجية قصيرة الخيط 1.5 مل ، ND9Dr. R. Forche ChromatographieVT1100309
أزيد الصوديوم (NaN3< / sub>) RothK305.1
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)VWRBDH7363-4
ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (Na 2< / sub>HPO4< / sub>)VWR80731-078
TopSpin 4.0 (البرنامج)Bruker-https://www.bruker.com
& omega ؛ -NG ثنائي ميثيل أرجينين غير المتماثل (ADMA) سانتاكروز التكنولوجيا الحيويةsc-208093
& أوميغا ؛ -NG-monomethylarginine (MMA)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-200739A
& omega ؛ -NG-NG '- ثنائي ميثيل أرجينين متماثل (SDMA)سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-202235A
سائل نقل الحرارة غرفة مضخة

المراجع

  1. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  2. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  3. Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).
  4. Bachand, F. Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans. Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).
  5. Wang, Y. C., Li, C. Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems. FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).
  6. Ahmad, A., Cao, X. Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation. Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).
  7. Fisk, J. C., Read, L. K. Protein arginine methylation in parasitic protozoa. Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).
  8. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  9. Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation. Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).
  10. Nott, T. J., et al. Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles. Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).
  11. Fong, J. Y., et al. Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation. Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).
  12. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  13. Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies. Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).
  14. Gulla, A., et al. Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma. Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).
  15. Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).
  16. Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).
  17. Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus. Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).
  18. Bulau, P., et al. Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).
  19. Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases. BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).
  20. Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).
  21. Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives. Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).
  22. Chiang, K., et al. PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression. Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).
  23. Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity. Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).
  24. Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts. Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).
  25. Bhatter, N., et al. Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping. FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).
  26. Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).
  27. Zhang, F., et al. Global analysis of protein arginine methylation. Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).
  28. Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation. Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).
  29. Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins. Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).
  30. Davids, M., et al. Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).
  31. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  32. Vignoli, A., et al. High-throughput metabolomics by 1D NMR. Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).
  35. Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).
  36. Stryeck, S., et al. Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients. Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).
  37. Zhang, F., et al. Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing. Biomolecules. 11 (2), (2021).
  38. Zhang, F., et al. Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming. Cancers. 13 (8), (2021).
  39. Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis. Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).
  40. Habisch, H. J., et al. Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation. Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).
  41. Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases. Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).
  42. Hevel, J. M., Price, O. M. Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min. Methods. 175, 3-9 (2020).
  43. Altincekic, N., et al. Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR. Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).
  44. Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD. The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استكشاف ميثيل أرجينين بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.