تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

Jia Liu; Yuyang Liu; Weidi Chen; Yuzhen Ding; Xiaoru Lan; Wei Liu

doi:10.3791/63260

مقالة منهجية

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

DOI:

10.3791/63260

⸱

ديسمبر 28, 2021

Jia Liu^*¹ , Yuyang Liu^*¹ , Weidi Chen¹ , Yuzhen Ding¹ , Xiaoru Lan¹ , Wei Liu¹

¹Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استنادا إلى آلية تجميع مركب البروتين INAD ، في هذا البروتوكول ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة Drosophila TRP الذاتية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد النقل الضوئي لذبابة الفاكهة أحد أسرع مسارات الإشارات المقترنة ببروتين G المعروفة. لضمان خصوصية وكفاءة هذا الشلال ، ترتبط قناة كاتيون الكالسيوم (Ca²⁺) القابلة للنفاذ ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) ، بإحكام ببروتين السقالة ، وتعطيل D بدون جهد لاحق (INAD) ، وتشكل مركبا كبيرا من بروتين الإشارات مع كيناز البروتين C (ePKC) الخاص بالعين والفوسفوليباز Cβ / بدون مستقبلات المحتملة A (PLCβ / NORPA). ومع ذلك ، فإن الخصائص البيوكيميائية لقناة ذبابة الفاكهة TRP لا تزال غير واضحة. استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD ، تم تطوير استراتيجية معدلة لتنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لتنقية قناة TRP الذاتية. أولا ، كان جزء الهيستيدين النقي (له) الموسوم NORPA 863-1095 مرتبطا بحبات Ni ويستخدم كطعم لسحب مركب بروتين INAD الداخلي المنشأ من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة. بعد ذلك ، تمت إضافة جزء من الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسوم باسم TRP 1261-1275 إلى حبات Ni للتنافس مع قناة TRP. وأخيرا ، تم فصل قناة TRP في supernatant عن الببتيد TRP 1261-1275 المفرط بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هذه الطريقة تجعل من الممكن دراسة آلية بوابة قناة ذبابة الفاكهة TRP من كل من الزوايا الكيميائية الحيوية والهيكلية. يمكن أيضا قياس خصائص الفيزيولوجيا الكهربية لقنوات ذبابة الفاكهة TRP النقية في المستقبل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقل الضوئي هو عملية يتم فيها تحويل الفوتونات الممتصة إلى رموز كهربائية للخلايا العصبية. وهو ينقل حصريا الأوبسينات وسلسلة الإشارات التالية المرتبطة ببروتين G في كل من الفقاريات واللافقاريات. في ذبابة الفاكهة ، باستخدام مجالات PDZ الخمسة ، ينظم تعطيل بروتين السقالة - بدون إمكانات لاحقة D (INAD) مجمع إشارات فوق جزيئي ، والذي يتكون من قناة محتملة للمستقبلات العابرة (TRP) ، و phospholipase Cβ / No receptor potential A (PLCβ / NORPA) ، وكيناز البروتين C (ePKC) (ePKC) ¹. يضمن تكوين مجمع الإشارات فوق الجزيئية هذا التوطين الصحيح تحت الخلوي والكفاءة العالية وخصوصية آلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. في هذا المعقد ، تعمل قنوات TRP الحساسة للضوء كمؤثرات في المصب ل NORPA وتتوسط تدفق الكالسيوم وإزالة الاستقطاب من المستقبلات الضوئية. أظهرت الدراسات السابقة أن فتح قناة ذبابة الفاكهة TRP يتم بوساطة البروتونات ، أو تعطيل بيئة الدهون المحلية ، أو القوة الميكانيكية²^،³^،⁴. تتفاعل قناة Drosophila TRP أيضا مع calmodulin⁵ ويتم تعديلها بواسطة الكالسيوم عن طريق كل من ردود الفعل الإيجابية والسلبية ^6,7,8.

حتى الآن ، استندت دراسات الفيزيولوجيا الكهربية على آلية بوابات ذبابة الفاكهة TRP والقنوات الشبيهة ب TRP (TRPL) إلى بقع غشاء تم استئصالها ، وتسجيلات الخلايا الكاملة من المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة من النوع البري المنفصل ، والقنوات المعبر عنها بشكل غير متجانس في S2 أو SF9 أو HEK الخلايا²،⁹،10،¹¹،^12،¹³ ^، ولكن ليس على القنوات النقية. كما أن المعلومات الهيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP الكاملة الطول لا تزال غير واضحة. من أجل دراسة الخصائص الكهروفسيولوجية للبروتين النقي في بيئة غشائية معاد تشكيلها والحصول على معلومات هيكلية لقناة ذبابة الفاكهة TRP كاملة الطول ، فإن الحصول على قنوات TRP كاملة الطول النقية هو الخطوة الأولى الضرورية ، على غرار المنهجيات المستخدمة في دراسات قناة TRP للثدييات¹⁴،¹⁵،¹⁶^،¹⁷.

في الآونة الأخيرة ، استنادا إلى آلية تجميع مركب بروتين INAD^18,19,20 ، تم تطوير استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة لأول مرة لتنقية قناة TRP من متجانسات رأس ذبابة الفاكهة بواسطة حبات الستربتافيدين⁵. بالنظر إلى السعة المنخفضة والتكلفة الباهظة لخرز الستربتافيدين ، يتم تقديم بروتوكول تنقية محسن هنا يستخدم بروتين الطعم الموسوم والخرز النيفي منخفض التكلفة المقابل بسعة أعلى بكثير. ستساعد الطريقة المقترحة على دراسة آلية بوابات قناة TRP من الزوايا الهيكلية وقياس الخصائص الكهروفسيولوجية لقناة TRP باستخدام البروتينات النقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنقية شظايا TRP الموسومة بضريبة السلع والخدمات وشظايا NORPA الموسومة به

تنقية جزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات
1. حول بلازميد pGEX 4T-1 TRP 1261-1275¹⁰ إلى خلايا الإشريكية القولونية (E. coli ) BL21 (DE3) باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية CaCl₂ ²¹. قم بتلقيح مستعمرة واحدة في 10 مل من وسط لوريا بيرتاني (LB) وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ثم ، قم بتضخيم 10 مل من ثقافة البذر في 1 لتر من وسط LB عند 37 درجة مئوية.
2. بعد أن تصل الكثافة البصرية (OD₆₀₀) للخلايا إلى 0.5 ، قم بتبريد الخلايا إلى 16 درجة مئوية وإضافة 0.1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ؛ التركيز النهائي) للحث على التعبير الزائد عن البروتين المستهدف واحتضانه عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
3. بعد الإفراط في التعبير، كريات 1 لتر من الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي في 3,993 × غرام لمدة 20 دقيقة وإعادة تعليق في 40 مل من المخزن الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
4. قم بتحميل الخلايا المعاد تعليقها في مجانس عالي الضغط مبرد مسبقا عند 4 درجات مئوية. زيادة ضغط المجانس ببطء إلى 800 بار. افتح صنبور المدخل واسمح للخلايا المعاد تعليقها بالمرور بشكل دائري عبر صمام ذي شقوق ضيقة للغاية.
  ملاحظة: يتم تجانس الخلايا بواسطة قوى القص العالية الناجمة عن انخفاض الضغط الكبير والتجويف.
5. قم بتحميل 5 مل من حبات الجلوتاثيون إلى عمود تدفق الجاذبية واغسل الخرز ب 50 مل من المخزن المؤقت PBS لما مجموعه ثلاث مرات.
6. جهاز طرد مركزي للخلية من مجانس الضغط العالي عند 48,384 × جم. أضف المادة الفائقة من محللات الخلايا بالطرد المركزي (40 مل) إلى حبات الجلوتاثيون المتوازنة في عمود تدفق الجاذبية واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبات الجلوتاثيون كل 10 دقائق.
7. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، افتح صنبور مخرج العمود لفصل الخرز وجزء التدفق من خلال. تجاهل جزء التدفق من خلال. شطف حبات الجلوتاثيون المتبقية مرتين مع 50 مل من المخزن المؤقت PBS.
8. أضف 15 مل من المخزن المؤقت للتخفيف إلى حبات الجلوتاثيون واحتضنها لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق.
9. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، قم بإلغاء جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وتحميله في عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير) ، والذي يتم توازنه باستخدام 50 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 100 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 1 mM DTT) المخزن المؤقت.
10. حافظ على معدل تدفق الاستخلاص لعمود استبعاد الحجم إلى 3 مل / دقيقة. جمع البروتينات المطفأة بمعدل 5 مل / أنبوب.
11. حدد ذروة البروتين المستهدف في عمود استبعاد الحجم عن طريق تحليل إشارات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وتحقق من خلال تحليل SDS-PAGE gel (معلمات الرحلان الكهربائي: 150 فولت لهلام التراص ؛ 200 فولت لهلام الحل). وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق R250.
12. ركز الجزء TRP 1261-1275 المنقى الموسوم بعلامة GST من عمود استبعاد الحجم إلى 1 مل باستخدام عمود دوران فائق الترشيح سعة 15 مل يتم طرده مركزيا عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد على سطح المكتب.
13. تحديد تركيز البروتين المركز باستخدام قانون بير لامبرت. قم بقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لجزء TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
14. احصل على معامل الانقراض عند 280 نانومتر عن طريق استيراد تسلسلات البروتين إلى برنامج Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). عادة ، تنتج زراعة 1 لتر من TRP 1261-1275 الموسومة بضريبة السلع والخدمات 1 مل من 600 ميكرومتر من البروتين (6 × ^10-7 مول). انظر الجدول 1 للاطلاع على المواد اللازمة.
تنقية جزء NORPA 863-1095 الموسوم
1. قم بتحويل البلازميد pETM.3C NORPA 863-1095²⁰ إلى خلايا E. coli BL21 (DE3) باستخدام طريقة تحويل الصدمة الحرارية CaCl₂ ²¹. تطعيم مستعمرة واحدة في 10 مل من وسط LB وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. ثم ، قم بتضخيم ثقافة البذر 10 مل في 1 لتر من وسط LB عند 37 درجة مئوية.
2. بعد أن يصل OD₆₀₀ من الخلايا إلى 0.5 ، قم بتبريد الخلايا إلى 16 درجة مئوية وإضافة 0.1 mM IPTG (التركيز النهائي) للحث على الإفراط في التعبير عن البروتين المستهدف واحتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
3. بعد الإفراط في التعبير، بيليه 1 لتر من الخلايا المستزرعة عن طريق الطرد المركزي في 3,993 × غرام لمدة 20 دقيقة وإعادة تعليق في 40 مل من العازلة ملزمة. بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا المعاد تعليقها في مجانس عالي الضغط عند 4 درجات مئوية كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
4. قم بتحميل 5 مل من حبات Ni-beads في عمود تدفق الجاذبية واغسلها ثلاث مرات باستخدام 50 مل من المخزن المؤقت للربط.
5. جهاز طرد مركزي للخلية من مجانس الضغط العالي عند 48,384 × جم. أضف المادة الفائقة من محللات الخلايا بالطرد المركزي إلى حبات Ni-beads المتوازنة في عمود تدفق الجاذبية واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق حبات Ni كل 10 دقائق.
6. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، افتح صنبور مخرج العمود لفصل الخرز وجزء التدفق من خلال. تخلص من الجزء المتدفق واغسل حبات Ni-Beads المتبقية مرتين باستخدام 50 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
7. أضف 15 مل من المخزن المؤقت للإزالة إلى حبات Ni-beads واحتضنها لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق حبات Ni كل 10 دقائق.
8. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اجمع جزء NORPA 863-1095 الموسوم بعلامة His-1095 في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وقم بتحميله في عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير) ، والذي يتم توازنه باستخدام 50 mM Tris (الرقم الهيدروجيني 7.5 ، 100 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 1 mM DTT).
9. حافظ على معدل تدفق الاستخلاص لعمود استبعاد الحجم إلى 3 مل / دقيقة. جمع البروتين المطفأ بمعدل 5 مل / أنبوب.
10. حدد ذروة البروتين المستهدف في عمود استبعاد الحجم عن طريق تحليل إشارات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر وتحقق من خلال تحليل SDS-PAGE gel (معلمات الرحلان الكهربائي: 150 فولت لهلام التراص ؛ 200 فولت لهلام الحل). وصمة عار الجل باستخدام Coomassie الأزرق R250.
11. ركز الجزء NORPA 863-1095 المنقى من عمود استبعاد الحجم إلى 1 مل باستخدام عمود دوران فائق الترشيح سعة 15 مل يتم طرده مركزيا عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد على سطح المكتب.
12. تحديد تركيز البروتين المركز باستخدام قانون بير لامبرت. قم بقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لجزء NORPA 863-1095 الموسوم عليه عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
13. احصل على معامل الانقراض عند 280 نانومتر عن طريق استيراد تسلسلات البروتين إلى برنامج Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). عادة ، تنتج زراعة 1 لتر من شظية NORPA 863-1095 الموسومة 1 مل من 600 ميكرومتر من البروتين (6 × ^10-7 مول). انظر الجدول 2 للاطلاع على المواد اللازمة.

2. إعداد رؤوس ذبابة الفاكهة

جمع الذباب البالغ في أنابيب طرد مركزي مخروطية 50 مل باستخدام طريقة التخدير CO_{2 22,23} ؛ تجمد على الفور في النيتروجين السائل لمدة 10 دقائق وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية.
بعد جمع عدد كاف من الذباب ، هز بقوة الأنابيب المخروطية المجمدة سعة 50 مل باليد لفصل أرجل الذباب ورؤوسه وأجنحته وأجسامه. انقل الخليط إلى ثلاثة غربال من الفولاذ المقاوم للصدأ مكدسة مسبقا مكدسة مسبقا (حجم شبكة 20/30/40 ، على التوالي) وهز المناخل.
بعد ذلك ، نظرا لأن الرؤوس لا يمكنها المرور عبر غربال 40 شبكيا ، استخدم فرشاة لكنس رؤوس الذبابة من غربال 40 شبكيا ، ونقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
جمع الذباب ورؤوسهم باستمرار وتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية حتى تصل إلى الكمية المطلوبة اللازمة للتجريب (0.5 جم). عادة ، لجمع 0.5 غرام من الرؤوس ، هناك حاجة إلى 35 مل من الذباب في أنبوب مخروطي 50 مل. انظر الجدول 3 للاطلاع على المواد اللازمة.

3. ذبابة الفاكهة TRP تنقية قناة

يزن ما مجموعه 0.5 غرام من الرؤوس ويتجانس تماما في النيتروجين السائل باستخدام مدقة هاون مبردة مسبقا. قم بإذابة الرؤوس المتجانسة في مخزن مؤقت للتحلل 10x v / w (5 mL) ، واحتضنها في شاكر عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بجهاز طرد مركزي عند 20,817 x g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
اجمع المادة الفائقة الدوارة ("20817 g S" ، الشكل 4) وقم بمزيد من الطرد المركزي عند 100000 × g لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استخدم السوبرناتانت الدوار لأسفل ("100,000 g S"، الشكل 4) لإجراء الفحص المنسدل التالي.
أضف 1 مل من حبات Ni إلى عمود تدفق الجاذبية واغسل الخرز ب 10 مل من H₂O (ddH₂O) المقطر المزدوج عند 4 درجات مئوية ليصبح المجموع ثلاث مرات. قم بموازنة الخرز مع 10 أحجام أعمدة من مخزن التحلل المؤقت ثلاث مرات عند 4 درجات مئوية.
أضف 500 ميكرولتر من 600 ميكرومتر من بروتين NORPA 863-1095 الموسوم (3 × ^10-7 مول) إلى عمود Ni واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق.
افتح نقرة مأخذ الأعمدة لفصل الخرز وجزء التدفق. خذ جزء التدفق من خلال تحليل SDS-PAGE (NORPA F ، الشكل 4). في هذا القسم ، يتم تجميد بروتينات الطعم على حبات Ni.
اغسل حبات Ni-beads ب 10 أحجام أعمدة من مخزن التحلل المؤقت (10 مل) عند 4 درجات مئوية واحتفظ بجزء الغسيل لتحليل SDS-PAGE (Wash 1 ، الشكل 4A). كرر الخطوات المذكورة أعلاه واحتفظ بالعينة لتحليل SDS-PAGE (Wash 2 ، الشكل 4A). في هذا القسم ، تتم إزالة بروتينات الطعم المفرطة على حبات Ni.
أضف المادة الفائقة من تجانس رأس ذبابة الفاكهة بعد 100000 × g من الطرد المركزي إلى عمود Ni عند 4 درجات مئوية ، حيث تم تجميد جزء NORPA 863-1095 الموسوم به.
احتضن السوبرناتانت مع حبات Ni-Beads عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق. ثم افتح اضغط على مأخذ الأعمدة لفصل الخرز وكسر التدفق من خلال.
جمع supernatant لتحليل SDS-PAGE (تحلل رأس Dro F ، الشكل 4A). في هذا القسم ، يتم التقاط مجمعات بروتين INAD (INAD / TRP / ePKC) في متجانسات الرأس بواسطة شظايا NORPA 863-1095 المجمدة على حبات Ni.
اغسل حبات Ni-beads ب 10 أحجام أعمدة من مخزن التحلل المؤقت (10 مل) عند 4 درجات مئوية وحافظ على supernatant من هطول الأمطار الجاذبية لتحليل SDS-PAGE (Wash 3 ، الشكل 4A). كرر الخطوات المذكورة أعلاه واجمع الفائق لتحليل SDS-PAGE (Wash 4 ، الشكل 4A). في هذا القسم ، تتم إزالة البروتينات غير المرتبطة على حبات Ni.
أضف 500 ميكرولتر من 600 ميكرومتر من بروتين TRP 1261-1275 الموسوم بضريبة السلع والخدمات (3 × ^10-7 مول) إلى حبات Ni واحتضنها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخرز كل 10 دقائق.
اجمع الكسر المقطوع من عمود الجاذبية (TRP E1 ، الشكل 4B) ، والذي يحتوي على قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية. كرر الخطوات المذكورة أعلاهوجمع كسر الاستخلاص (TRP E2 ، الشكل 4B). في هذه الخطوة، باستخدام شظايا TRP 1261-1275 الموسومة بضريبة السلع والخدمات كمنافس، يتم إخراج قنوات TRP من مجمعات بروتين INAD التي تم التقاطها (INAD/TRP/ePKC) على حبات Ni.
اغسل حبات Ni-beads ب 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للربط (10 مل ؛ الجدول 1) عند 4 درجات مئوية وجمع جزء الغسيل لتحليل SDS-PAGE (Wash 5 ، الشكل 4B).
أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإزالة (الجدول 1) إلى حبات Ni واحتضنها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع كسر الاستخلاص من عمود تدفق الجاذبية (NORPA E1، الشكل 4B). كرر الخطوات المذكورة أعلاه ، وجمع كسر الاستخلاص (NORPA E2 ، الشكل 4B).
باستخدام المخزن المؤقت للإزالة ، قم بإلغاء جزء NORPA 863-1095 الموسوم به مصحوبا بمجمعات البروتين INAD / ePKC. بعد ذلك ، أعد تعليق Ni-beads في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط.
خذ حبات Ni-Beads المعاد تعليقها لتشغيل SDS-PAGE (ملطخة ب Coomassie blue R250) لتحليل كفاءة الإزالة وتقييم ما إذا كان المخزن المؤقت للعود يعمل (الخرز ، الشكل 4B). انظر الجدول 4 للاطلاع على المواد اللازمة.

4. تنقية عمود استبعاد الحجم لقناة ذبابة الفاكهة TRP

قم بتثبيت عمود استبعاد الحجم (الدرجة التحليلية) على نظام تنقية البروتين. قم بموازنة العمود مع المخزن المؤقت للعمود (50 mM Tris-HCl pH 7.5 ، 150 mM NaCl ، 2 mM DTT ، 0.75 mM DDM) ، والذي يتم ترشيحه بواسطة مرشح 0.45 ميكرومتر.
ركز جزء TRP E1 و E2 من الخطوة 3.14 باستخدام عمود دوران فائق الترشيح سعة 4 مل ، يتم طرده مركزيا عند 3000 × g عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي مبرد.
شطف حلقة العينة باستخدام المخزن المؤقت للعمود وتحميل العينة في حلقة العينة. حقن العينة في عمود استبعاد الحجم وتخلص من البروتينات بمعدل تدفق مناسب (0.5 مل / دقيقة).
حدد ذروة البروتين المستهدف عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر وقم بتشغيل جل SDS-PAGE للكشف عن قناة ذبابة الفاكهة TRP الداخلية المنقاة (الشكل 5). انظر الجدول 5 للاطلاع على المواد اللازمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، يتم توضيح طريقة تنقية البروتين لتنقية قناة ذبابة الفاكهة TRP الذاتية المنشأ (الشكل 1).

أولا ، يتم تطبيق التعبير عن البروتين المؤتلف وتنقيته للحصول على الطعم والبروتينات المنافسة. بعد ذلك ، يتم التعبير عن جزء TRP 1261-1275 الموسوم ب GST في خلايا E. coli BL21 (DE3) في وسط LB ويتم تنقيته باستخدام حبات الجلوتاثيون وعمود استبعاد الحجم (الشكل 2). تم التحقق من العينات باستخدام تحليل SDS-PAGE مع تلطيخ Coomas...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

INAD ، الذي يحتوي على خمسة نطاقات PDZ ، هو المنظم الأساسي لآلات النقل الضوئي ذبابة الفاكهة. أظهرت الدراسات السابقة أن INAD PDZ3 يرتبط بذيل قناة TRP C-terminal مع خصوصية رائعة (K_D = 0.3 μM)¹⁸. يتفاعل الترادف INAD PDZ45 مع جزء NORPA 863-1095 مع تقارب ربط عال للغاية (K_D = 30 nM). وتوفر هذه النتائج أساسا كيميائيا حيويا متينا لتصميم استراتيجية تنقية التقارب بالإضافة إلى المنافسة، التي تمكن من استخدام جزء NORPA CC-PBM كطعم منسدل، في حين يعمل ذيل TRP C-terminal (الجزء 1261-...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870746) ، ومنح شنتشن للبحوث الأساسية (JCYJ20200109140414636) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم 2021A1515010796) إلى W. L. نشكر LetPub (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوية >سلالات بكتيرية < / قوية >
< م > BL21 (DE3) الخلايا المختصة < / م >	نوفاجين	69450	الإفراط في التعبير عن البروتين
< قوي > نماذج التجربة < / قوي >
D.melanogaster: W^{1118 < / sup> سلالة}	مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة	BDSC: 3605	<>ذبابة الفاكهة < / م > إعداد
الرأس <قوي > مادة < / قوي >
20/30/40 شبكة غرابيل الفولاذ المقاوم للصدأ شركة	Jiufeng شبكة معدنية	شركة GB / T6003.1	ذبابة الفاكهة < / م > تحضير الرأس
30٪ أكريلاميد-N ، N & Prime ؛ -Methylenebisacrylamide (29: 1)	Lablead	A3291	SDS-PAGE تحضير جل
الأمونيوم بيرسولفات	Invitrogen	HC2005	SDS-PAGE تحضير جل
مثبط البروتياز كوكتيل	Roche	05892953001	مثبط البروتياز
Coomassie الأزرق اللامع R-250	Sangon Biotech	A100472-0025	SDS-PAGE تلطيخ
جل DL-Dithiothreitol (DTT)	Sangon Biotech	A620058-0100	إعداد
العازلة لعمود استبعاد الحجمملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	سانجون للتكنولوجيا الحيوية	A500838-0500	إعداد العازلة لعمود استبعاد الحجم
الجلايسين	سانجون للتكنولوجيا الحيوية	A610235-0005	SDS-PAGE إعداد العازلة
الجلوتاثيون سيفاروز 4 حبات التدفق السريع	Cytiva	17513202	كروماتوغرافيا التقارب
Imidazole	Sangon Biotech	A500529-0001	Elution buffer التحضير لعمود النيكل
الأيزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)	سانجون بيوتك	A600168-0025	تحريض البروتين المفرط
التعبير LB مرق مسحوق	سانجون للتكنولوجيا الحيوية	A507002-0250	E.coli.< / em> ثقافة الخلية
L-Glutathione المخفضة (GSH)	إعداد عازلة Sigma-aldrich	G4251-100G	لحبات الجلوتاثيون
Ni-Sepharose excel الخرز	Cytiva	17371202	تقارب اللونيات
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM)	Sangon Biotech	A610424-001	منظف لتنقية البروتين
N ، N ، N '، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)	Sigma-aldrich	T9281-100ML	SDS-PAGE تحضير جل
PBS	Sangon Biotech	E607008-0500	مخزن مؤقت للتجانس ل E.coli.< / em> خلية
PMSF	Lablead	P0754-25G	مثبط البروتياز
البروتين المصبغة	مسبقا Thermo Scientific	26619/26616	سلم البروتين الملون
عمود استبعاد الحجم (درجة التحضير)	Cytiva	28989336	HiLoad 26/60 Superdex 200 PG
عمود استبعاد الحجم (درجة تحليلية)	Cytiva	29091596	Superose 6 زيادة 10/300 GL عمود
كلوريد الصوديوم	Sangon Biotech	A501218-0001	تحضير عازلة تنقية البروتين
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)	Sangon Biotech	A500228-0001	SDS-PAGE هلام / إعداد العازلة
تريس	Sigma-aldrich	T1503-10KG	عازلة تنقية البروتين
تدور الترشيح الفائق عمود	Millipore	UFC901096 / 801096	تركيز البروتين
<قوي > المعدات < / قوي >
الميزان التحليلي	دنفر	APX-60	Metage من ذبابة الفاكهة < / em> رأس
طرد مركزي مبرد عالي السرعة على سطح المكتب لأنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 مل و 50 مل	البروتين	Eppendorf	5810R
أجهزة الطرد المركزي المبردة عالية السرعة على سطح المكتب 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي	Eppendorf	5417R	الطرد المركزي ذبابة الفاكهة< / em> محللة الرأس بعد التجانس
عمود تدفق الجاذبية الفارغة (القطر الداخلي = 1.0 سم)	Bio-Rad	738-0015	تنقية البروتين TRP
عمود تدفق الجاذبية الفارغ (القطر الداخلي = 2.5 سم)	Bio-Rad	738-0017	تنقية البروتين الطعم والمنافس من E.coli.< / em>
نظام التوثيق	Bio-Rad	Universal Hood II Gel Doc XR	System SDS-PAGE التصوير
جهاز طرد مركزي مبرد عالي	السرعة Beckman coulter	Avanti J-26 XP	الطرد المركزي من E.coli.< / em> الخلايا / الخلية المحلل
الخالط عالي الضغط	UNION-BIOTECH	UH-05	تجانس خلايا E.coli.< / em>
خزان النيتروجين السائل	Taylor-Wharton	CX-100	ذبابة الفاكهة < / em> تحضير الرأس
نظام تنقية البروتين	Cytiva	AKTA	لتنقية البروتين
ثلاجة (-80 درجة ؛ ج)	Thermo	900GP	em>ذبابة الفاكهة < / em> إعداد الرأس
مقياس الطيف الضوئي	MAPADA	UV-1200	OD600 لخلايا E.coli.< / em>
مقياس الطيف	الضوئي الحراري العلمي	NanoDrop 2000c	تحديد تركيز البروتين
جهاز الطرد المركزي الفائق	بيكمان كولتر	أوبتيما XPN-100 أجهزة الطرد	المركزي الفائقالطرد المركزي الفائق

في علامة مسبقا قاعدة تحضير جهاز تركيز <

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).
Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075(2019).
Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191(2020).
Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TRP Drosophila INAD Cryo EM

تنقية القنوات المحتملة لمستقبلات ذبابة الفاكهة العابرة الذاتية المنشأ

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة