Method Article

عزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم في البكتيريا الزرقاء

DOI:

10.3791/63272

⸱

November 10th, 2021

 , 
1Department of Life Science, National Taiwan University, 2Institute of Plant Biology, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفصل البروتوكول الحالي عزل الفيكوبيليزومات من البكتيريا الزرقاء عن طريق الطرد المركزي من خلال تدرج كثافة السكروز المتقطع. يتم تأكيد أجزاء من الفيكوبيليسومات السليمة من خلال طيف انبعاثات الفلورسنت 77K وتحليل SDS-PAGE. الكسور الفيزيائية الناتجة مناسبة للتلطيخ السلبي ل TEM وتحليل الطيف الكتلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في البكتيريا الزرقاء ، الفيكوبيليسوم هو مركب بروتين هوائي حيوي يحصد الضوء وينقل الطاقة إلى النظام الضوئي الأول والثاني للكيمياء الضوئية. دراسة بنية وتكوين الفيكوبيليسوم هي ذات أهمية كبيرة للعلماء لأنها تكشف عن تطور واختلاف التمثيل الضوئي في البكتيريا الزرقاء. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفصلة ومحسنة لكسر خلايا البكتيريا الزرقاء بتكلفة منخفضة بواسطة مضرب الخرز بكفاءة. يمكن بعد ذلك عزل الفيكوبيليسوم السليم من مستخلص الخلية عن طريق الطرد المركزي الفائق لتدرج السكروز. وقد أثبتت هذه الطريقة أنها مناسبة لكل من البكتيريا الزرقاء النموذجية وغير النموذجية مع أنواع الخلايا المختلفة. كما يتم توفير إجراء خطوة بخطوة لتأكيد سلامة وخصائص البروتينات الفيزيائية بواسطة التحليل الطيفي الفلوري 77K و SDS-PAGE الملطخ بكبريتات الزنك و Coomassie Blue. يمكن أيضا إخضاع الفيكوبيليسوم المعزول لمزيد من التحليلات الهيكلية والتركيبية. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول دليل بداية مفيد يسمح للباحثين غير المطلعين على البكتيريا الزرقاء بعزل وتوصيف الفيكوبيليسوم السليم بسرعة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phycobilisome (PBS) هو مركب ضخم من البروتين الصباغي القابل للذوبان في الماء يرتبط بالجانب السيتوبلازمي من الأنظمة الضوئية في أغشية الثايلاكويد من البكتيريا الزرقاء1. يتكون PBS في المقام الأول من البروتينات الفيزيائية الملونة وبروتينات الروابط عديمة اللون1,2. يمكن تقسيم البروتينات الفيكوبيلية إلى أربع مجموعات رئيسية: فيكويريثرين ، فيكويريثروسيانين ، فيكوسيانين ، وألوفيكوسيانين 3. وتمتص المجموعات الأربع الرئيسية أطوال موجية مختلفة من الطاقة الضوئية في حدود 490-650 نانومتر، والتي يمتصها الكلوروفيل بشكل غير فعال3. يمكن أن يكون PBS بمثابة هوائي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على Synechocystis sp. PCC 6803 ، السلالة النموذجية التي تتحمل الجلوكوز ، من الدكتور تشو ، Hsiu-An في Academia Sinica ، تايوان. تم الحصول على Leptolyngbya sp. JSC-1 ، خيطي غير نموذجي ، من الدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.

1. زراعة الخلايا والحصاد

  1. قم بتلقيح خلايا Syn6803 أو JSC-1 باستخدام حلقة تلقيح معدنية في قارورة مخروطية سعة 100 مل تحتوي على 50 مل من وسط B-HEPES28. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية تحت فوتونات 50 ميكرومول m-2 s-1 (الضوء الأبيض LED) في 1٪ (v / v) CO2 مع التحريك المستمر ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت زراعة خلايا Syn6803 و JSC-1 في قوارير مخروطية مع تحريك مستمر في وسط B-HEPES عند 30 درجة مئوية ، تحت ضوء أبيض LED (فوتونات 50 ميكرومول m-2s-1) في غرفة نمو مليئة ب 1٪ (v / v) CO2. في مرحلة النمو الأسي (OD750 = ~ 0.5) ، تم زرع الخلايا في وسط جديد مع كثافة بصرية نهائية OD750 = ~ 0.2. بعد الوصول إلى مرحلة النمو الأسي المتأخر (OD750 = 0.6-0.8) ، تم جمع الثقافات وطردها مركزيا (10000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة). تم التخلص من المادة الفائق.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقياسية لعزل PBS سليم في نوعين من البكتيريا الزرقاء، النموذج أحادي الخلية Syn6803، والخيطي غير النموذجي JSC-1. الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي تجانس الخلايا والطرد المركزي الفائق على تدرج الكثافة المتقطعة للسكروز. بشكل عام ، يكون اضطراب الخلايا الخيطية أكثر تعقيدا من الخلايا أحادية الخلية. كانت زيادة كمية المواد الأولية (الوزن الرطب لحبيبات الخلية) وتكرار ضرب الخرز مفيدة لزيادة غلة PBS من خلايا البكتيريا الزرقاء الخيطية. بالنسبة للبكتيريا الزرقاء الخيطية ، JSC-1 ، تم استخدام ثلاثة أضعاف الخلا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ أي مصلحة متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون Technology Commons ، كلية علوم الحياة ، جامعة تايوان الوطنية على الاستخدام المريح لجهاز الطرد المركزي الفائق. تم إهداء سلالات البكتيريا الزرقاء Synechocystis sp. PCC 6803 و Leptolyngbya sp. JSC-1 من الدكتور تشو ، Hsiu-An في Academia Sinica ، تايوان ، والدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ، على التوالي. تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (تايوان) (109-2636-B-002-013- و 110-2628-B-002-065-) ووزارة التعليم (تايوان) برنامج يوشان للباحثين الشباب (109V1102 و 110V1102).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 مم الخرز الزجاجيBioSpec11079101لاستخراج PBS
13 مل أنبوب الطرد المركزيهيتاشي13PAالطرد المركزي الفائق
40 مل أنبوب الطرد المركزيهيتاشي40PAالطرد المركزي الفائق
حمض الخليكميرك8.1875.2500ل Coomassie Blue تلطيخ
B-HEPES المتوسطةوسط بكتيريا زرقاء معدل من BG-11 متوسط
أزرق لامع R-250SigmaB-0149ل Coomassie Blue تلطيخ
Bromophenol أزرقWako الصناعات الكيماوية النقية2-291مخزن مؤقت لتحميل
البروتين الميزان الإلكترونيRadwagWLC 2 / A2 / C / 2لقياس الوزن الرطب لحبيبات الخلية
مقياس الطيف الضوئي الفلوريهيتاشيF-7000مقياس الطيف الضوئي
GlycerolBioShopGly001.500عازلة تحميل البروتين
طرد مركزي مبرد عالي السرعةهيتاشيCR22Nللتبادل العازلة
Leptolyngbya < / em>sp. JSC-1من الدكتور دونالد أ. براينت في جامعة ولاية بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
ملحق قياس درجة الحرارةالمنخفضة هيتاشي5J0-0112يشتمل الملحق على حاوية Dewar شفافة للتحليل الطيفي الفلوري 77K.
الميثانولميرك1.07018،2511دقيق للطرد المركزي الأزرق Coomassie
Blue Thermo FisherPico 21لاستخراج PBS
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607لاستخراج PBS
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةPanReac AppliChem121512.121لاستخراج PBS
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةPanReac AppliChem141509.121لاستخراج PBS
قارورة غطاء لولبيBioSpec10832لاستخراج PBS
SmartView Pro ImagerMajor ScienceUVCI-2300للكشف عن إشارة تلطيخ الزنك
كبريتات دوديسيل الصوديومZymesetBSD101عازلة تحميل البروتين
السكروزZymesetBSU101لعزل
PBSSynechocystis < / em>sp. سلالة PCC 6803المقاومة للجلوكوز من الدكتور تشو ، Hsiu-An في أكاديميا سينيكا ، تايوان
TrisBioShopTRS 011.1عازلة تحميل البروتين
Triton X-100BioShopTRX 506.500لاستخراج PBS
مرشح الطرد المركزي الغشائي Ultra 10 KMilliporeUFC901024لتبادل
العازلةمرشح الطرد المركزي الغشائي Ultra 3 KMilliporeUFC500324لتبادل العازلة
جهاز طرد مركزي فائقهيتاشيCP80WXالطيف الضوئي
الفائق للأشعة فوق البنفسجية / فيس مقياس الطيفAgilentCary 60مقياس الطيف
كبريتات الزنكPanReac AppliChem131787.121لتلوين Znic
& beta - MercaptoethanolBioBasicMB0338عازلة تحميل البروتين
جهاز لجهاز طرد مركزي الضوئي الضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
  2. Glazer, A. N. Phycobilisomes: Structure and dynamics. Annual Review of Microbiology.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phycobilisome IsolationCyanobacteriaSucrose GradientUltracentrifugationBead BeaterPhycobiliproteinsSDS PAGE77K FluorescenceCell LysisProtein Composition

Related Articles