الصفائح الدموية عبارة عن خلايا دم صغيرة غير نووية ، وهي ضرورية للإرقاء ، والتي تستمد من الخلايا الضخمة (MKs) في نخاع العظام (BM). أثناء تمايزها عن الخلايا الجذعية المكونة للدم ، تتطور MKs إلى خلايا عملاقة في عملية معقدة من التمايز والنضج التي تشمل تعدد الصبغيات والنضوج السيتوبلازمي. في المرحلة الأخيرة من التطور عندما تكون MKs على اتصال بالخلايا البطانية ، فإنها تصل إلى مرحلتها الناضجة وتمتد الامتدادات السيتوبلازمية الطويلة ، والتي تسمى الصفائح الدموية ، إلى الأوعية الدموية ، والتي تتفتت بعد ذلك لتؤدي إلى ظهور الصفائح الدموية في مجرى الدم1،2. لا تزال الآليات التي تنظم نضوج MK وتكوين الصفيحات عبر البطانة غير مفهومة بشكل كامل. الهدف من هذه المجموعة هو الجمع بين الأساليب التكميلية التي ستساهم في فهم بيولوجيا أعضاء الكنيست في المختبر وفي الجسم الحي بشكل أفضل.
يستخدم التوسع والتمايز في المختبر لأعضاء الكنيست على نطاق واسع لدراسة الآليات الكامنة وراء تكوين الصفائح الدموية. في البروتوكول الصادر عن Pongerard et al. ، يصف المؤلفون بروتوكول ثقافة موحد لتمييز MKs عن أسلاف CD34 + المكونة للدم البشرية. يؤكدون بشكل خاص أن مرشحات الكريات البيض المتوفرة في مراكز الدم هي مصدر استثنائي لجمع خلايا CD34 +. تحتوي مقالتهم على العديد من الإرشادات الأساسية حول كيفية استخراج خلايا CD34 + ، وكيفية تقييم نقاوتها وأهمية كثافة البذر. يقترح المؤلفون أيضا طريقة سحب معايرة ، خمس مرات متتالية ، لإطلاق الصفائح الدموية الوظيفية بكفاءة. التطبيقات المثيرة للاهتمام لهذه الطريقة هي إمكانية تقييم المركبات الدوائية أو التلاعب وراثيا بخلايا CD34 + باستخدام طريقة تحرير الجينوم CRISPR-Cas93،4. بالنسبة لدراسات الفئران ، يقدم Kimmerlin et al. استراتيجية فرز الخلايا لتنقية أسلاف MK بأعداد كافية متوافقة مع المقايسات الجزيئية والخلوية. يناقش المؤلفون مزايا استخدام القمة الحرقفية كمصدر لنخاع العظام الذي يحتوي على عدد كبير من أسلاف المكونة للدم وإجراء استنفاد مغناطيسي من خطوتين للخلايا غير المرغوب فيها قبل فرز الخلايا باستخدام مجموعة من علامات سطح الخلية. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في تقليل عدد المطلوبة للحصول على أسلاف MK عالية النقاء والتي ، على سبيل المثال ، قد تكون ذات أهمية للباحثين الذين يدرسون التسلسل الهرمي للأسلاف المكونة للدم وتمايزها. في هذا السياق ، Boscher et al. يصف طريقة لزراعة الأسلاف في وسط ثلاثي الأبعاد يتكون من 2٪ ميثيل سلولوز لتقليد البيئة في الجسم الحي بشكل أفضل. في الواقع ، أظهر هؤلاء المؤلفون سابقا أن MKs المزروعة في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد تحقق حالة نضج أكبر وقدرة أكبر على تكوين أسلاف مقارنة بتلك المزروعة في وسط سائل5. يتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول مثل الحجم المناسب من ميثيل السليلوز للحصول على صلابة متوسطة مثالية ، وعدد الخلايا التي يجب أن تكون متكافئة في كل حالة تجريبية ، وخطر التلوث. للتحقق الوظيفي من مستوى النضج ، يشرح المؤلفون كيفية إعادة تعليق الخلايا المزروعة بالهلام في وسط سائل في اليوم الثالث من الثقافة وكيفية إصلاح الخلايا للتحليل المستقبلي عن طريق الحفظ المناعي أو قياس التدفق الخلوي أو الفحص المجهري الإلكتروني. الفحص المجهري الإلكتروني الناقل (TEM) هو نهج التصوير المفضل لتوفير بنية فوقية عالية الدقة لأعضاء الكنيست هنا ، Scandola et al. يشترك في بروتوكول لتحليل البنية الفائقة ل MKs في بيئة BM الطبيعية الخاصة بهم ، وتحديد كثافة الخلايا وتسجيل مراحل النضج المختلفة. يستخدم المؤلفون TEM لتحليل الأحداث الخلوية التي تحدث عندما يتفاعل MKs مع الجدار الجيبي ، مثل نتوءاتهم القصيرة الغازية الشبيهة ببودوجوم التي تخترق البطانة6. يتمثل أحد قيود الطريقة في أنه لا يمكن تحليل المرحلة الأولية من مشاركة MK بسبب عدم وجود ميزات بنية فوقية محددة لهذه الخلايا غير الناضجة. كما لوحظ ، يتمتع نهج التصوير هذا بميزة استخدام عينات BM صغيرة تسمح بإجراء دراسات متعددة باستخدام ماوس واحد. على سبيل المثال ، يمكن استخدام عينات نخاع العظم الأخرى لتقنية استئصال نخاع العظم التي تم تقديمها في هذه المجموعة بواسطة Guinard et al. لدراسة الامتداد الديناميكي للصفيحات من MKs. تكمن قوة هذه الطريقة في استخدام MKs التي تطورت في BM ، وبالتالي تجنب أي سوء تفسير محتمل ناتج عن القطع الأثرية لتمايز الخلايا في الثقافة. في الواقع ، تم توثيق هذا سابقا في الفئران التي تعاني من تعطيل MYH9 المقيد ب MK ، حيث تم العثور على نتائج متباينة في المختبر و ex vivo7. يسلط المؤلفون الضوء أيضا على الطبيعة البسيطة والقابلة للتكرار والسريعة لهذا النهج. ملاحظة مثيرة للاهتمام لبروتوكولهم هي القدرة على استخدام المجاهر المجهزة ببرامج الملاحة لتسهيل تتبع / قياس كمية MKs التي تمتد الصفائح الدموية. الطريقة التكميلية لنموذج explant هي التصوير ثنائي الفوتون ل MKs في جمجمة الفأر. تفرد هذه التقنية هو القدرة على دراسة السلوك الديناميكي لأعضاء الكنيست المسمى بالفلورسنت في نخاع العظم وتصور امتداد الصفيحات. يتميز هذا البروتوكول بكونه طفيف التوغل ، مع تدخلات جراحية محدودة ، وبالتالي تجنب التفاعلات الالتهابية التي تم الإبلاغ عن تأثيرها على تكوين الصفيحات. كما لاحظ بورنيرت وآخرون ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو العمق الضيق الذي يمكن تصويره بسبب كثافة العظام ، والتي تفرض أيضا استخدام الفئران الأصغر سنا. يمكن تطبيق هذه التقنية على الفئران المعدلة وراثيا لدراسة دور الجينات ذات الأهمية في تكوين الصفائح الدموية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، استخدم المؤلفون هذه التقنية لإثبات أن دور الأنابيب الدقيقة في استطالة الصفيحات يختلف بين الظروف في المختبر وفي الجسم الحي 8.
يمكن أن يؤدي التطور غير الطبيعي لعضو الكنيست وإنتاج الصفائح الدموية إلى قلة الصفيحات أو كثرة الصفيحات ، مما يزيد من خطر النزيف أو تجلط الدم ، على التوالي. ستؤدي الجهود المستمرة لتشريح الآليات الجزيئية التي تحكم تكوين الصفائح الدموية إلى زيادة قدرتنا على تطوير استراتيجيات جديدة لعلاج قلة الصفيحات ونقص الصفيحات. في مجال أبحاث نقل الدم ، ستضع هذه الجهود الأساس لإنتاج الصفائح الدموية المستنبتة كبديل لنقل الدم في حالات مختارة9.