تصور الاتجار المعتمد على الهيكل الخلوي للعضيات المحتوية على الدهون في أجنة ذبابة الفاكهة

Summary

في جنين ذبابة الفاكهة المبكر ، تكون العديد من العضيات متحركة. من حيث المبدأ ، يمكن تصويرها مباشرة عبر تحقيقات فلورسنت محددة ، لكن قشر البيض يمنع التطبيق المباشر على الجنين. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مثل هذه المجسات عن طريق الحقن المجهري ، ثم تحليل حركة العضيات السائبة عبر قياس سرعة صورة الجسيمات.

Abstract

أجنة ذبابة الفاكهة المبكرة هي خلايا كبيرة تحتوي على مجموعة واسعة من العضيات التقليدية والخاصة بالجنين. خلال الساعات الثلاث الأولى من التكوين الجنيني ، تخضع هذه العضيات لحركات دراماتيكية مدعومة بتدفق السيتوبلازم القائم على الأكتين والاتجار المدفوع بالمحرك على طول الأنابيب الدقيقة. إن تطوير العديد من مجسات الفلورسنت الصغيرة الخاصة بالعضيات (FPs) يجعل من الممكن تصور مجموعة واسعة من الهياكل المختلفة المحتوية على الدهون في أي نمط وراثي ، مما يسمح بالتصوير الحي دون الحاجة إلى فلوروفور مشفر وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيفية حقن الأصباغ الحيوية والمجسات الجزيئية في أجنة ذبابة الفاكهة لمراقبة الاتجار بعضيات معينة عن طريق التصوير الحي. ويتضح هذا النهج من خلال وضع علامات على قطرات الدهون (LDs) ومتابعة حركتها السائبة عن طريق قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV). يوفر هذا البروتوكول استراتيجية قابلة لدراسة العضيات الأخرى ، بما في ذلك الليزوزومات والميتوكوندريا وحويصلات صفار البيض و ER ، ولتتبع حركة LDs الفردية على طول الأنابيب الدقيقة. إن استخدام الأصباغ المتاحة تجاريا يجلب فوائد الفصل إلى المناطق البنفسجية / الزرقاء والحمراء البعيدة من الطيف. من خلال الوسم المشترك المتعدد للعضيات و / أو العناصر الخلوية الهيكلية عن طريق الحقن المجهري ، تتوفر جميع الموارد الوراثية في ذبابة الفاكهة لدراسات الاتجار دون الحاجة إلى إدخال بروتينات موسومة بالفلورسنت. على عكس الفلوروفورات المشفرة وراثيا ، والتي لها غلات كمية منخفضة وتبييض بسهولة ، فإن العديد من الأصباغ المتاحة تسمح بالتقاط سريع ومتزامن لعدة قنوات ذات عوائد فوتونية عالية.

Introduction

الأصباغ الحيوية والمجسات الجزيئية هي أدوات قوية لتصوير هياكل خلوية محددة والعضيات الحية. في جنين ذبابة الفاكهة ، تعرض العديد من العضيات المختلفة توطينا مدفوعا بالهيكل الخلوي¹،^2،3،^{4 ،} لكن تطبيق هذه الجزيئات الصغيرة يمثل تحديا لأن قشر البيض غير منفذ للعديد منها. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخدام مجسات الفلورسنت (FPs) في الأجنة الحية عن طريق الحقن المجهري من أجل الكشف عن الاتجار واسع النطاق بالعضيات. يغطي الإجراء إعداد محلول الحقن ، وجمع البيض وإعداد الأجنة ، والحقن المجهري ، والتصوير ، وتحليل الصور.

إعادة الترتيب المكاني الدراماتيكي للعضيات شائعة في العديد من البويضات الحيوانية والبيض والأجنة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الحجم الكبير لهذه الخلايا. في جنين ذبابة الفاكهة ، على سبيل المثال ، تتحرك قطرات الدهون (LDs) وحويصلات صفار البيض نحو مركز الجنين قبل الخلية⁵. تعتمد هذه الحركة على الأنابيب الدقيقة وتترك منطقة ~ 40 ميكرومتر في جميع أنحاء محيط الجنين مستنفدة من العضيتين. خلال مراحل الانقسام المبكرة ، يتم نقل العديد من العضيات عن طريق تدفقات السيتوبلازم التي تحركها الانقباضات القائمة على الأكتين الميوسين على سطح الجنين⁶. على الرغم من أن أجنة العديد من الأنواع تظهر عمليات إعادة ترتيب مماثلة ، إلا أن جنين ذبابة الفاكهة مناسب بشكل خاص لمتابعة هذه العمليات عن طريق التصوير لأنه يتطور خارجيا في "درجة حرارة الغرفة" القياسية في المختبر ، وهو شفاف نسبيا ، وصغير بما يكفي ليتناسب مع معظم إعدادات المجهر ، ويمكن التلاعب به باستخدام أدوات وراثية قوية.

بالنسبة لبعض العضيات ، تتوفر البروتينات الموسومة بالفلورسنت التي تضع علامات على هذه الهياكل على وجه التحديد. على سبيل المثال ، LSD-2 (المعروف أيضا باسم dPLIN2) هو بروتين يستهدف في الأجنة LDs⁷ على وجه التحديد. تتوفر خطوط الذباب التي تحمل إما جينات متحولة قابلة للحث تشفر اندماجا بين بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) و LSD-2⁸ أو فخ جيني يتم فيه إدخال بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP) في منطقة ترميز جين LSD-2 الداخلي ^9,10. ومع ذلك ، فإن هذا النهج له قيود ، بما في ذلك أن هذه البروتينات الاندماجية لها عوائد كمية منخفضة وتميل إلى التبييض بسهولة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون وضع العلامات على هياكل مختلفة متعددة في وقت واحد تحديا: بالنسبة للعديد من العضيات ، يتوفر حاليا نوع واحد فقط من علامات الفلورسنت (غالبا GFP أو mCherry) ، لذلك قد يتطلب تصوير عضيتين في نفس الوقت جينات أو إدخالات جديدة ؛ أيضا ، حتى لو كانت العلامات المتوافقة متوفرة ، فإن إدخالها في سلالة واحدة يمكن أن يتطلب تقاطعات تستغرق وقتا طويلا. كما أنه يجعل استخدام العديد من الموارد الوراثية القوية أقل ملاءمة، على سبيل المثال، إذا كان يجب أن تكون علامتا عضيتين، وبرنامج تشغيل Gal4، وبناء RNAi قابل للتحريض موجودة في نفس الأم.

من حيث المبدأ ، يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام FPs ، بما في ذلك الأصباغ الحيوية (على سبيل المثال ، LysoTracker لوضع علامة على الليزوسومات) ، والمجسات الجزيئية (على سبيل المثال ، SiR-tubulin لتسمية microtubules) ، والجزيئات البيولوجية المصنفة بالفلورسنت (على سبيل المثال ، C12 BODIPY للتحقيق في استقلاب الأحماض الدهنية¹¹). من الاستخدام في الخلايا المستزرعة ، عادة ما يتم التحقق من صحتها جيدا كأدوات قوية لفحص البيولوجيا الخلوية. FPs متعددة الاستخدامات ، ولها خصائص صور فائقة ، ومتوافقة مع البروتينات الفلورية. يمكن خلط أصباغ متعددة وتطبيقها في وقت واحد ، وغالبا ما يكون ذلك مع فوائد الفصل في المناطق البنفسجية / الزرقاء والحمراء البعيدة من الطيف وتحولات ستوكس الصغيرة ، مما يمنع نزيف القناة من خلالها. تسمح تحولات ستوكس الصغيرة بالتقاط قنوات تصوير متعددة في وقت واحد، مما يتيح تتبع العديد من العضيات في وقت واحد. وأخيرا ، يمكن تطبيقها بنفس القدر على وضع العلامات على العضيات في أجنة أنواع ذبابة الفاكهة الأخرى أو حتى الحشرات الأخرى حيث قد لا تتوفر بروتينات موسومة بالفلورسنت.

ومع ذلك ، فإن معظم هذه FPs لا يمكنها اجتياز قشر البيض المتقن لجنين ذبابة الفاكهة . وهو يتألف من خمس طبقات: ثلاث طبقات مشيمية خارجية (كوريون) تمنع التلف الميكانيكي بالإضافة إلى طبقة شمعية تحيط بغشاء الفيتلين الذي يخلق حاجزا كيميائيا¹². من أجل البساطة ، سيشار إلى مزيج من الطبقة الشمعية وغشاء vitelline باسم "غشاء vitelline" أدناه. لتجاوز قشر البيض ، يقوم هذا البروتوكول بتكييف نهج الحقن المجهري للأجنة المعمول به لإدخال FPs في جنين ذبابة الفاكهة . يصف البروتوكول كيفية مراقبة التدفق السيتوبلازمي ل LDs في أجنة مرحلة الانقسام. ويشمل إعداد إبر الحقن وأقفاص جمع البيض ، وعملية جمع البيض ، والإزالة الميكانيكية للكوريون. ويتناول كيفية الحقن الدقيق للأجنة وتصويرها وكيفية تحليل التدفق الأكبر ل LDs باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV ، مقتبس من⁶). ويقدم المشورة بشأن استكشاف الأخطاء وإصلاحها لضمان بقاء الجنين على قيد الحياة وإنشاء أفضل نظام للتصوير. كما نوقشت كيفية تعديل البروتوكول لتصوير LDs و microtubules في وقت واحد أو لتطبيقه على دراسة العضيات الأخرى ، بما في ذلك الليزوسومات والميتوكوندريا وحويصلات صفار البيض والشبكة الإندوبلازمية (ER).

Protocol

1. إعداد المواد اللازمة

ملاحظة: من الأفضل القيام بهذه الاستعدادات قبل أيام أو أسابيع من الموعد المحدد.

1. تحضير إبر الحقن.
   ملاحظة: يمكن تخزين الإبر إلى أجل غير مسمى في حاوية مغطاة. يجب أن تكون الإبر جيدة بما يكفي لتقديم ~ 700 fL بينما تكون قوية بما يكفي لاختراق غشاء vitelline.
   1. ضع شعيرة شعرية في حامل الشعيرات الدموية على مجتذب الإبرة. تأمين الشعيرات الدموية مع الجناحين. قم بمحاذاة مركز الشعيرات الدموية مع عنصر التسخين بحيث يتم إنشاء إبرتين متماثلتين.
   2. اختر الإعدادات المناسبة على مجتذب الإبرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. إجراء مراقبة الجودة باستخدام نطاق تشريح.
      ملاحظة: يجب أن تكون أطراف الإبرة على ما يرام قدر الإمكان. يتم التخلص من أطراف الإبرة المتشققة أو الخشنة أو ذات التجويف الكبير.
   4. تحضير دفعات من 10 إبر (5 شعيرات دموية) في وقت واحد.
   5. ضع معجون قابل للتشوه ، تم لفه في أسطوانة ، في وسط الجزء السفلي من الحاوية بغطاء. اضغط بعناية على الإبر في المعجون بحيث تمسكها أفقيا مع تعليق أطراف الإبرة بأمان في الهواء لمنع التلف. يغطى بالغطاء ويخزن حتى الاستخدام.
2. إعداد لوحات جمع البيض. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: أطباق جمع البيض هي أطباق أجار صغيرة تستكمل بعصير الفاكهة لتشجيع وضع البيض. يتم وصف كيفية إعدادها في العديد من البروتوكولات ، بما في ذلك¹³.
3. إعداد الغراء الهيبتان.
   ملاحظة: يتم استخراج هذا الغراء من شريط على الوجهين ويستخدم لربط الأجنة بإحكام بغطاء خشبي. يمنع الجنين من الطفو خارج التركيز أثناء الحقن والتصوير. يمكن تحضير الغراء قبل أيام أو أسابيع من الموعد المحدد.
   1. قم برفع الشريط على الوجهين إلى حجم أكبر من كرة الجولف وضعه في الجزء السفلي من حاوية زجاجية ~ 50 مل مع غطاء مغلق بإحكام. قم بتعبئة الشريط بإحكام حتى يكون هناك ما يكفي من المواد اللاصقة.
   2. في غطاء الدخان ، املأ الحاوية الزجاجية بالسباعي لتغطية جميع الشريط. حافظ على الحاوية مغلقة بإحكام عندما لا تكون قيد الاستخدام.
      تحذير: الهيبتان قابل للاشتعال كسائل وبخار. يمكن أن يسبب تهيج العين والجلد والجهاز التنفسي. قد تسبب أبخرة التنفس النعاس والدوخة وتلف الرئة. احفظ الهيبتان بعيدا عن مصادر الاشتعال وخزنه في منطقة جيدة التهوية مخصصة للمواد القابلة للاشتعال وبعيدا عن المواد غير المتوافقة.
   3. دع غراء السباتين يجلس بين عشية وضحاها أو لفترة أطول. للحصول على أفضل النتائج، ضع الحاوية على شاكر أو محرض آخر طوال الليل للمساعدة في إذابة المادة اللاصقة.
      ملاحظة: سيبقى الشريط نفسه ، ولكن سيتم إذابة المادة اللاصقة في الهيبتان. في الخطوة 5.1.2 ، يتم تطبيق الغراء على غطاء ؛ يتبخر الهيبتان ، تاركا الغراء وراءه.
   4. اختبر إعداد غراء الهيبتان عن طريق وضع قطرة منه على شريحة زجاجية والتأكد من بقاء بقايا لزجة بمجرد تبخر الهيبتان. إذا لم تكن بقايا المادة اللاصقة مرئية بعد ذلك ، فأضف المزيد من الشريط إلى الحاوية الزجاجية وكرر الخطوة السابقة.
      ملاحظة: بمجرد إعداده ، يمكن استخدام الغراء لعدة أشهر أو حتى سنوات.
4. تحضير محلول مخزون BODIPY493/503 1 ملغم/مل (3.8 ملليمتر) عن طريق تخفيف المستحضر الذي تم الحصول عليه تجاريا في DMSO اللامائي النقي. احتفظ بها مغطاة لحمايتها من الضوء والماء. يخزن إلى أجل غير مسمى عند -20 درجة مئوية أو على المدى القصير عند 4 درجات مئوية.

2. إعداد أقفاص جمع البيض

ملاحظة: قم بذلك قبل يوم واحد على الأقل (يفضل 2 أو 3 أيام) من الحقن (الحقن) المخطط لها.

1. تحضير معجون الخميرة.
   ملاحظة: مكملات معجون الخميرة البروتين والمواد المغذية الحيوية الأخرى غير المتوفرة في أطباق عصير التفاح. يعزز إنتاج البيض ووضع البيض.
   1. أضف 2-10 غرام من خميرة الخباز الجاف ، ثم 1 مل من ماء الصنبور إلى كوب صغير. اخلط باستخدام ملعقة.
   2. استمر في إضافة ماء الصنبور بزيادات قدرها 1 مل حتى يتم الوصول إلى الاتساق المطلوب الذي يشبه معجون الأسنان.
   3. غطي الخليط وخزنيه على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. إعداد أقفاص ذبابة لجمع البيض.
   ملاحظة: مطلوب ذكور وإناث الذباب من النمط الوراثي المطلوب: 10-50 أنثى أقل من 2 أسابيع من العمر وعدد مماثل من الذكور. يتوفر عدد من الخيارات المختلفة لأقفاص الذباب ، بما في ذلك الخيارات محلية الصنع^14,13. من المهم أن يتطابق حجم ألواح عصير التفاح مع حجم أقفاص الذبابة.
   1. ضع مسحة صغيرة من معجون الخميرة على طبق عصير التفاح. احتفظ به مغطى واتركه يصل إلى درجة حرارة الغرفة لأن الذباب لن يضع البيض على الطبق إذا كان الجو باردا جدا.
   2. انقل الذباب إلى قفص جمع الأجنة ، وختم مع طبق عصير التفاح المخمر ، وتأمين اللوحة إلى قفص جمع الأجنة.
   3. اسمح للذباب المنقول حديثا بالتأقلم مع القفص لمدة 1-2 أيام ، واستبدل الطبق بآخر طازج يوميا. إذا تم تناول كل الخميرة بحلول اليوم التالي ، فقم بزيادة كمية معجون الخميرة للمجموعات المستقبلية.
      ملاحظة: هذه خطوة مهمة لزيادة غلة البيض حيث تضع الإناث اللواتي يتغذين جيدا المزيد من البيض.

3. في يوم الحقن ، قم بإعداد محلول الحقن وتحميله في الإبرة

1. استخدم محلول المخزون من BODIPY 493/503 (3.8 mM في DMSO) كمحلول حقن.
2. قم بتحميل إبرة واحدة مع 1 ميكرولتر من محلول الحقن باستخدام أطراف تحميل الإبرة.
   ملاحظة: اجتهد في توصيل السائل إلى الطرف دون حبس فقاعات الهواء. كن مستعدا لاستبدال الإبرة المحملة بسرعة في حالة الكسر العرضي.
   1. قم بإرفاق طرف تحميل بماصة دقيقة وارسم 1 ميكرولتر من محلول الحقن في الحافة. باستخدام القفازات، أمسك الإبرة بيد واحدة مع توجيه طرفها بعيدا لتقليل خطر الكسر.
   2. أدخل طرف التحميل بعناية في الإبرة وادفعه بالقرب من طرف الإبرة. الاستغناء عن السائل بالقرب من طرف الإبرة. بعد إزالة الماصة ، أمسك الإبرة عموديا بطرفها لأسفل حتى يتدفق السائل إلى الطرف.
3. قم بتخزين الإبر المحملة في حاوية منفصلة مع المعجون على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 1.1.5).
   ملاحظة: يجب تحضير الإبر مسبقا (حتى عدة ساعات) من الحقن ولكن لا ينبغي استخدامها بعد أكثر من يوم.
4. احفظ الإبر بعيدا عن الضوء المحيط لمنع تبييض الأصباغ. قم بتغطية حاوية التخزين بورق الألومنيوم دون الإضرار بأطراف الإبرة. تأكد من حجب كل الضوء.

4. جمع الأجنة للحقن

ملاحظة: يعتمد توقيت الجمع على مرحلة الأجنة التي يجب إجراء الحقن فيها. مع مخطط التوقيت أدناه ، سيكون عمر الأجنة في وقت التحضير للحقن 0-90 دقيقة ، وهو ما يتوافق مع مراحل الانقسام¹⁵.

1. في يوم الحقن ، قم بإعداد أطباق عصير التفاح مع الخميرة ، كما هو الحال في الخطوة 2.2.1. إذا تم التخطيط لجولات N من الحقن ، فقم بإعداد لوحات N + 2. احتفظ بهذه اللوحات في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: بالإضافة إلى لوحات N لجمع الأجنة للحقن ، هناك حاجة إلى لوحة واحدة كلوحة ما قبل التجميع وأخرى لإطعام الذباب في القفص بمجرد الانتهاء من المجموعات.
2. استبدل اللوحة الموجودة على القفص بلوحة خميرة طازجة (لوحة ما قبل التجميع) واتركها على القفص لمدة 1-2 ساعة.
3. استبدل اللوحة الموجودة على القفص بلوحة جديدة (لوحة تجميع). تخلص من لوحة ما قبل التجميع ، لأنها ستحتوي على أجنة أقدم من المطلوب. ثم ، اسمح للذباب بوضع البيض لمدة 1.5 ساعة.
   ملاحظة: نظرا لأن الذباب الذي يتغذى جيدا عادة ما يضع بيضه بعد فترة وجيزة من تخصيب البويضات ، فإن وقت جمع 1.5 ساعة يضمن أنه في نهاية المجموعة ، يبلغ عمر معظم الأجنة الموجودة على اللوحة 0-90 دقيقة ، أي أنها في مراحل الانقسام. تميل إناث الذباب التي لم يتم إطعامها الخميرة الطازجة منذ اليوم السابق إلى الاحتفاظ بالبيض المخصب لفترة غير محددة من الوقت قبل وضعها. وبالتالي ، قد تحتوي لوحة ما قبل التجميع على أجنة تم تخصيبها قبل بدء الجمع ، وبالتالي فهي أقدم من 60 دقيقة ، وأحيانا أكبر من ذلك بكثير.
4. استبدل اللوحة الموجودة على القفص بطبق خميرة طازج. قم بتغطية لوحة التجميع حتى لا يضع الذباب الضال البيض عليها.

5. تحضير الأجنة للحقن المجهري

1. تجميع المواد اللازمة.
   1. قم بإرفاق قطعة من الشريط على الوجهين بشريحة زجاجية. تجنب لمس الشريط بالأصابع لأن ذلك يقلل من لزوجته.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه الشريحة لإزالة المشيمية وليس للتصوير.
   2. باستخدام ماصة نقل أو ماصة دقيقة (p200 أو p1000) ، ضع قطرة صغيرة (200 ميكرولتر أو أقل) من غراء الهيبتان تقريبا في وسط غطاء مستطيل (60 × 25 مم). اسمح للهيبتان بالتبخر (وهذا يستغرق أقل من دقيقة).
      ملاحظة: سيتم استخدام هذا الغطاء لتركيب الأجنة للحقن والتصوير. يتم اختيار الأبعاد لتتناسب مع حامل معدني قابل للتعديل على المجهر البؤري.
   3. قم بتجميع غرفة تجفيف ، غرفة مغلقة (على سبيل المثال ، صندوق شطيرة Tupperware) تحتوي على حبات الجفاف. استخدم فقط حبات التجفيف التي لم ترطب بعد.
      ملاحظة: لضمان تناول الأجنة لمحلول الحقن، يجب تجفيف الجنين قليلا لتقليل الضغط الداخلي. ويتم ذلك عن طريق وضع الغطاء مع الأجنة المنزوعة الهوريون المعرضة للهواء في غرفة الجفاف.
2. إزالة الميكانيكية المشيمة.
   1. غطي صفيحة الجنين المسنة بشكل مناسب بطبقة رقيقة من زيت الهالوكربون 27 لتحويل قشر البيض شفافا.
      ملاحظة: تصبح الأجنة شفافة في غضون عشرات الثواني¹⁵. إذا لم تحدث هذه الخطوة بكفاءة ، فقد تكون ألواح عصير التفاح رطبة جدا ويجب تجفيفها قبل الاستخدام.
   2. عرض اللوحة تحت نطاق تشريح مع إضاءة (أي الضوء الذي يمر عبر الصفيحة إلى العدسات) لتأكيد مرحلة الأجنة.
   3. حدد الأجنة في مراحل الانقسام.
      ملاحظة: أجنة مرحلة الانقسام مبهمة تماما. يمكن التعرف على مراحل الأديم الأرومي اللاحقة بواسطة شريط من السيتوبلازم الشفاف في جميع أنحاء المركز غير الشفاف¹⁵. تتوفر مقدمة جيدة حول كيفية التعرف على المراحل الجنينية المختلفة على الموقع الإلكتروني (الوارد في المرجع¹⁶) الذي تحتفظ به جمعية البيولوجيا التنموية.
   4. باستخدام ملاقط دقيقة ، أمسك بجنين من المرحلة المطلوبة من زوائده الظهرية وانقله إلى شريحة زجاجية محضرة مغطاة بقطعة من الشريط على الوجهين. ضع الجنين على الشريط. تقليل نقل النفط.
   5. بلطف قدر الإمكان ، لف الجنين عبر سطح الشريط عن طريق دفع الجنين بلطف مع جانب طرف الملقط. لا تكز الجنين مباشرة بأطراف الملقط الحادة.
      ملاحظة: إذا كانت القوة المطبقة منخفضة جدا، فلن يتدحرج الجنين. إذا كان مرتفعا جدا ، فسوف ينفجر. يتطلب العثور على القوة الوسيطة المناسبة خبرة ، وبالتالي ، يجب ممارسة هذه الخطوة مسبقا.
   6. استمر في لف الجنين حتى تلتصق المشيمة بشكل عابر بالشريط والشقوق.
   7. بمجرد أن تتشقق المشيمة ، استمر في التدحرج لفصل الجنين (لا يزال داخل غشاء الفيتيلين) عن المشيمة حيث تظل المشيمية عالقة بالشريط.
   8. تأكد من إزالة المشيمية بالكامل من خلال ملاحظة فقدان الزوائد الظهرية من الجنين.
   9. لف الجنين مرة أخرى على الوتر ، وهو أقل لاصقة من الشريط. افركي الجنين بلطف باستخدام الملقط حتى يعلق على الملقط لنقله.
   10. انقل الجنين إلى الغطاء مع غراء السباتان واجعله على اتصال بالغراء ، والذي عادة ما يفصله عن الملقط.
   11. اضبط اتجاه الجنين على الغطاء.
       1. تضمين السطح الجانبي للجنين في الغراء.
          ملاحظة: سطح الجنين المضمن في الغراء هو السطح الذي سيتم تصويره. يعد تضمين السطح الجانبي هو الأبسط ، ولكن يمكن تعديل ذلك اعتمادا على التفضيل الشخصي أو السؤال البيولوجي المراد الإجابة عليه.
       2. توجيه المحور الطويل للجنين عموديا على المحور الطويل للغطاء.
       3. إذا لم يكن الجنين مستلقيا في الاتجاه المفضل ، فقم بتنظيف الملقط لإزالة أي زيت من شأنه فصل الجنين عن الغراء. ثم، حاول بلطف لف الجنين في موضعه.
   12. تحضير العدد المطلوب من الأجنة للحقن بالطريقة الموضحة أعلاه.
       ملاحظة: مع مرور الوقت بعد إزالة الكوريون ، سيبدأ الهواء المحيط في تجفيف الأجنة ، وبالتالي سيكون تأثير الخطوة 5.3 غير متساو بالنسبة للأجنة الموجودة على الغطاء ، والتي تم تفكيكها في أوقات مختلفة. عادة ما يكون 1-3 أجنة هي الأكثر قابلية للإدارة.
3. تجفيف الأجنة.
   1. ضع الغطاء مع الأجنة في غرفة التجفيف المعدة وختمها.
   2. اسمح للأجنة بالتجفيف لمدة 5-12 دقيقة.
      ملاحظة: يعتمد توقيت هذه الخطوة على درجة الحرارة والرطوبة المحيطة وبالتالي يجب تحديدها تجريبيا.
   3. قم بإزالة الغطاء من الغرفة ووضع قطرة من زيت الهالوكربون 700 عليه ، مع تغطية الأجنة بالكامل ، لمنع المزيد من الجفاف.
   4. افحص الأجنة على نطاق تشريح للحكم على الجفاف المناسب.
   5. إذا كانت الأجنة مقلصة قليلا ، ولكن لم يتم تفريغها ، فانتقل إلى الحقن المجهري (الخطوة 6).
   6. إذا لم تكن الأجنة مجففة بشكل كاف أو مفرط ، فارجع إلى الخطوة 5.2 وقم بإعداد مجموعة جديدة من الأجنة حيث لا يمكن إزالة زيت الهالوكربون 700. إذا كانت الأجنة مجففة بشكل مفرط ، فقم بتقصير وقت الجفاف للدفعة التالية من الأجنة بمقدار 3 دقائق ؛ إذا كانت مجففة بشكل ناقص ، فقم بزيادة وقت التجفيف بمقدار 3 دقائق.

6. الأجنة الحقن الدقيق

ملاحظة: تأكد من أن إعداد الحقن المجهري يتضمن مجهرا مقلوبا، ومناورا دقيقا لتثبيت إبرة الحقن ووضعها، وحاقنانا مجهريا تجاريا لتقديم كميات يتم التحكم فيها.

1. قم بتشغيل الحاقن الدقيق وأدخل الإعدادات المفضلة.
   ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، يوصى باستخدام إخراج الحركة الخطية والإعداد السريع ، ولكن العديد من الإجراءات الأخرى ستعمل. يجب على المشغل تحديد التفضيل الشخصي.
2. قم بتحميل الإبرة في المتلاعب الدقيق. لمنع تلف الإبرة أثناء تحميل الغطاء الذي يحتوي على الأجنة ، انقلها بعيدا عن الطريق إلى وضع آمن.
3. ضع الغطاء على المسرح ، مع الأجنة في الأعلى ، نحو الإبرة. ثم ، حرك الإبرة بعناية مرة أخرى إلى موضعها للحقن ، مع بقاء طرفها فوق المرحلة.
4. ضع هدف 4x في مسار الضوء. باستخدام مقبض التركيز على المجهر ، ضع الأجنة في بؤرة التركيز.
   ملاحظة: سيكون هذا هو المستوى البؤري المستخدم للحقن وسيتم تعديله فقط بالحد الأدنى من الآن فصاعدا.
5. باستخدام عناصر التحكم في المرحلة ، حرك الأجنة أفقيا إلى مركز مجال الرؤية.
   1. قم بالتحريك بعيدا عن الأجنة ، مع الاحتفاظ بها على حافة مجال الرؤية ، استعدادا لخفض الإبرة. ابق في نفس المستوى البؤري لضمان خفض الإبرة إلى الموضع الصحيح.
6. اخفض طرف الإبرة إلى المستوى البؤري الصحيح وتأكد من أنها مرئية في مجال الرؤية مع الأجنة.
   1. باستخدام عناصر التحكم في micromanipulator والنظر من الأعلى (ليس بعد من خلال العدسات) ، قم بإسقاط طرف الإبرة ببطء في الزيت ، بهدف المنطقة التي يشير إليها الهدف. نظرا لأن الزيت لزج تماما ، فانتقل ببطء لتجنب إتلاف الإبرة.
   2. بمجرد أن تصبح الإبرة مرئية من خلال النظارات ، استمر في استخدام عناصر التحكم في micromanipulator حتى يصبح طرف الإبرة في بؤرة التركيز وفي مركز مجال الرؤية.
   3. من خلال تحريك المرحلة ، أعد الأجنة إلى مركز مجال الرؤية. استخدم التحكم في المرحلة وعناصر التحكم في micromanipulator ومقبض التركيز البؤري لضبط موضع الجنين وطرف الإبرة بالنسبة لبعضهما البعض أثناء التركيز البؤري. تهدف إلى إجراء الحقن أقرب ما يمكن إلى الغطاء.
7. إجراء مراقبة جودة الإبرة.
   1. للتأكد من أن الإبرة تعمل ، قم بتوزيع بعض محلول الحقن في زيت الهالوكربون 700 المحيط بالجنين ، مرئيا كفقاعة في الزيت.
   2. إذا لم يكن هناك شيء يتدفق من الإبرة ، فقم بزيادة الضغط تدريجيا على الحاقن. إذا لم ينجح ذلك ، فاحصل على إبرة جديدة.
8. حقن الجنين.
   ملاحظة: تتراوح أحجام الحقن المقبولة من ~ 0.06-1 pL. يتم تعيين الحد الأدنى من خلال ما يمكن تصوره وهو يدخل الجنين. يتم تعيين الحد الأعلى من خلال الصدمة التي يمارسها الحقن على الجنين.
   1. حقن على طول الحواف الجانبية للجنين لأن هذا هو الأقل توغلا.
   2. باستخدام ضوابط المرحلة ، حرك الجنين نحو طرف الإبرة حتى يثقب الأخير الجنين بلطف ويدخله.
   3. في الوقت نفسه ، ابدأ تدفق محلول الحقن وراقب ظهور بقعة واضحة عابرة في موقع طرف الإبرة ، مما يشير إلى نجاح نقل السائل إلى الجنين.
   4. راقب الجنين. إذا قاوم الجنين الإبرة وتمزق (يتدفق السيتوبلازم) عند الدخول ، فارجع إلى الخطوة 5 وقم بزيادة وقت الجفاف. إذا كان الجنين مسطحا ضد الغطاء ويظهر مرنا أثناء الحقن ، فارجع إلى الخطوة 5 ، وقم بتقصير وقت الجفاف.
   5. إذا لم تدخل صبغة إلى الجنين ، فتأكد من أن الصبغة لا تزال قادرة على التدفق بحرية من الإبرة كما في الخطوة 6.7. إذا لم تتدفق الصبغة ، فاستبدل الإبرة. إذا تدفقت الصبغة ، فقم بحقن جنين جديد ، وابدأ في إطلاق الصبغة قبل أن تثقب الإبرة الجنين مباشرة.
      ملاحظة: لا ينصح بالحقن المتكرر لنفس الجنين لأنه يمزق موقع الجرح / الحقن السابق.
9. كرر ذلك حتى يتم حقن جميع الأجنة.

7. صورة الأجنة

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مجهرا متحد البؤرة للمسح الضوئي بالليزر.

1. ضع الغطاء في الحامل المعدني على المجهر البؤري بحيث يتم تصوير الأجنة مباشرة من الأسفل من خلال الغطاء ؛ فوق الغطاء ، لا يوجد سوى الزيت ولا يوجد حاجز آخر.
2. كخطوة لمراقبة الجودة ، قم بالتصوير أولا باستخدام وظيفة epifluorescence على المجهر البؤري ، بهدف 40x. تأكد من أن الفلوروفور مرئي في الجنين قبل المتابعة.
3. إذا كان مستوى التصوير المطلوب مختلفا عن موقع الحقن ، فامنح الصبغة وقتا كافيا للانتشار إلى المنطقة المستهدفة.
   ملاحظة: بالنسبة ل BOPIPY 493/503 ، تتراوح هذه المرة عادة من 30-60 دقيقة. نظرا لأن وقت الانتشار يعتمد بشكل كبير على الصبغة ، فقد تتطلب الأصباغ الأخرى تحسين موقع الحقن ووقت الانتظار.
4. استخدم أهدافا مختلفة للتصوير على مستويات مختلفة. استخدم هدفا 40x لتصوير الجنين بالكامل وهدفا 63x لتصوير الأقسام الفرعية للمقاييس الأصغر.
5. بالنسبة للتصوير المباشر خلال المراحل المتزامنة قبل التجميع الخلوي ، استخدم الشروط التالية للبدء: حجم الصورة 512 × 512 بكسل ، متوسط الخط 3 ، معدل الإطارات 0.1 إطار في الثانية (أي إطار واحد يتم الحصول عليه كل 10 ثوان). ضبط الظروف وفقا لقدرات المجهر المستخدمة.
   ملاحظة: تسمح هذه الشروط بالحصول على أكثر من 500 صورة من BOPIPY 493/503 والتقاط معظم الحركة.

8. تحليل تدفق LD عن طريق استخدام FIJI أولا لإعداد سلسلة زمنية من الصور ، ثم python لتحليل PIV

1. تحسين الحصول على الصور.
   1. إجراء حقن الصبغة المطلوبة في المرحلة المناسبة. كرر هذه الخطوة حتى يصبح التباين اليومي ضئيلا.
   2. قم بتحسين إعدادات الحصول على الصور بما في ذلك التكبير والتكبير/التصغير والدقة ومعدل الإطارات.
      ملاحظة: هناك مفاضلة بين الصور عالية الجودة (الدقة + متوسط الخط) وسرعة الاكتساب (معدل الإطارات).
2. إعداد البيانات في فيجي.
   1. الحصول على سلسلة زمنية عالية الجودة ليتم تحليلها.
   2. افتح إطارا واحدا من السلسلة الزمنية لإنشاء قناع باستخدام FIJI. تكرار الصورة. قم بتحويل نوع الصورة إلى 8 بت.
   3. حدد حدود الجنين باستخدام أداة اختيار المضلع أو اليد الحرة. استخدم مسح خارج لتعيين قيم البيكسل خارج التحديد إلى 0. قم بمسح ثم عكس داخل التحديد لتعيين قيمة البيكسلات داخل التحديد إلى القيمة القصوى (255).
   4. قم بإلغاء التحديد، ثم استخدم أمر الرسم البياني للتأكد من وجود قيم البكسل 0 و255 فقط.
   5. احفظ قناع الصورة الجديد هذا للسلسلة الزمنية المحددة.
   6. افتح السلسلة الزمنية للاهتمام. اختر الإطارات العشرة التي تلتقط الوقت المناسب بشكل أفضل ، على سبيل المثال ، الدورة النووية 9 في بداية الانكماش القشري. قم بتكرار إطارات الاهتمام العشرة ، وتشكيل مكدس فرعي.
   7. استخدم وظيفة المكدس إلى صور لإنشاء 10 صور لتحليلها باستخدام PIV.
   8. احفظ الملفات الفردية بطريقة تحافظ على ترتيبها (SeriesX_1 ، SeriesX_2 ، SeriesX_3 ...).
3. استخدم القناع المعد والإطارات الفردية لتحليل PIV ، باستخدام نموذج البرنامج النصي بايثون المقدم (البيانات التكميلية) أو برنامج نصي مخصص تم إنشاؤه بواسطة المستخدم.
   ملاحظة: يستند البرنامج النصي المقدم إلى تطبيق python الخاص ب OpenPIV¹⁷. يقوم بإخراج المسافة بالبكسل والتي يمكن تحويلها باستخدام عرض البكسل ومعدل الإطارات لتوليد سرعات أو سرعات.
4. قم بإنشاء نسخ متماثلة عن طريق إكمال الخطوات السابقة للأجنة الإضافية وتجميع قيم المخرجات.

Results

بعد الحقن ، سيتم توطين الصبغة فقط في الموقع الذي تم فيه إدخال طرف الإبرة. ثم تنتشر الصبغة بعيدا عن موقع الحقن اعتمادا على خصائصها المنتشرة. ويبين الشكل 1 حقن BODIPY 493/503، بعد فترة وجيزة من الحقن (اللوحة A) وبعد 24 دقيقة (اللوحة B). بعد 24 دقيقة ، وصلت الصبغة إلى نقطة الوسط تقريبا للمحور الطويل للجنين.

يمكن تحقيق تحليل حركية العضيات من خلال حقن الصبغة والتصوير بفاصل زمني. في الشكل 2 ، تم حقن الجنين بشكل مشترك مع BODIPY 493/503 (الشكل 2A) و LysoTracker Red (الشكل 2B) وتم تصويره باستخدام إثارة الليزر عند 488 و 596 نانومتر ، على التوالي. ثم تم تصوير هذا الجنين بفاصل زمني (إطار واحد كل 30 ثانية لمدة 30 دقيقة ، 5 دقائق تم تحليلها). ثم تم تشغيل السلسلة الزمنية من خلال تحليل PIV ، والذي يتم عرض مخرجاته من خلال الانسيابية في الشكل 2A و B. لاحظ أن الانسيابية لا تمثل مسار الجسيمات الفردية ، ولكن يتم استنتاج التدفق السيتوبلازمي من تحليل جميع الجسيمات الموجودة في تلك المنطقة من السيتوبلازم. من خلال وضع العلامات على اثنين من الهياكل الخلوية المستقلة (LDs والعضيات الحمضية) ، يجد تحليل PIV تدفقات مماثلة ، مع تقارب كلا العلامتين على المنطقة الوسطى من الجنين حيث يتدفق السيتوبلازم إلى داخل الجنين⁶.

تسمح FPs المتاحة حاليا بوضع علامات على العديد من العضيات والهياكل الخلوية الأخرى. يوضح الشكل 3 وضع العلامات على ER عبر متعقب ER Green. يوفر متعقب ER دقة لطيفة للغلاف النووي ، مما يسمح بتصور مراحل دورة الخلية الرئيسية. يتم تصوير متعقب ER Green باستخدام إثارة 488 نانومتر.

يعد وضع العلامات على الميتوكوندريا أمرا صعبا ، حيث يبدو أن معظم الأصباغ التي تم اختبارها محاصرة في الميتوكوندريا الأولى التي تدخلها. من ناحية أخرى ، لم يتم الكشف عن أي علامة على سمية الصبغة ، مما يجعل من الممكن اتباع الميتوكوندريا المسماة من خلال الخلوية والدورة النووية للجلد الخارجي 15. يوضح الشكل 4 خلية جلدية خارجية بعد عدة ساعات من الحقن باستخدام Mitoview 633 (الطول الموجي للإثارة 633 نانومتر).

BODIPY و Lysotracker و LipidSpot قوية ويمكن استخدامها للحصول على أكثر من 500 صورة بدقة 512 × 512 ، ومتوسط الخط 3 ، ومعدلات الإطارات من 1 / s إلى 0.1 / s. تعقب ER Green و SiR-tubulin وأصباغ الميتوكوندريا المذكورة أقل قوة وتنتج ~ 50-200 صورة في ظل نفس الظروف.

بدءا من مراحل الأديم الأرومي ، تتحرك LDs ثنائية الاتجاه على طول الأنابيب الدقيقة ، مدعومة بمحركات القطبية المعاكسة kinesin-1 و dynein السيتوبلازمية⁵. يمكن تصور هذه الحركة عن طريق المشاركة في وضع العلامات LDs والأنابيب الدقيقة عن طريق حقن كل من BODIPY 493/503 و SiR-Tubulin (الشكل 5). نظرا لأن LDs تعكس في كثير من الأحيان اتجاه حركتها (أثناء انتقالها بين kinesin-1 و dynein السيتوبلازمي) ، فإن معدلات الإطارات الأعلى أثناء الاكتساب تلتقط بشكل أفضل التفاصيل المهمة لحركية LD.

التصوير الحي لحويصلات صفار البيض ذاتية الفلورسنت ممكن دون أي شكل من أشكال حقن الصبغة (الشكل 6). ومع ذلك ، فإن التألق الذاتي خافت ، وليزر الإثارة سام للضوء. وبالتالي ، فإن التصوير الحي لصفار البيض الفلوري الذاتي له نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة بالنسبة لحقن الصبغة.

الشكل 1: انتشار BODIPY 493/503 عبر الجنين. تم حقن الصبغة على طول الحافة الجانبية نحو الطرف الأمامي (أعلى اليمين) وتنتشر من موقع الحقن هذا إلى الجنين ، مع وضع علامات LDs. (أ) انتشرت الصبغة عبر أجزاء من الجنين المجاورة لموقع الحقن. (ب) بعد حوالي 24 دقيقة/2 دورة نووية، انتشرت الصبغة بعد نقطة منتصف الجنين. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 ثانية.

الشكل 2: قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV) ل LDs والعضيات الحمضية. تم حقن جنين بكل من BODIPY 493/503 و LysoTracker Red. (أ) قناة BODIPY. (ب) قناة LysoTracker الحمراء. (أ'، ب') تبسيط الرسوم البيانية الناتجة عن تحليل PIV للقناتين المولدتين من 10 إطارات متسلسلة ، بما في ذلك تلك الموضحة في A و B. A ' يتوافق مع تدفق LDs ، و B ' يتوافق مع تدفق العضيات الحمضية. لاحظ أن كلا من A و B يظهران التقاء يسار الوسط حيث تتدفق المحتويات الجنينية من مستوى الرؤية ، إلى مركز الجنين. لاحظ أيضا أن BODIPY قد انتشر أكثر من LysoTracker لأن الأصباغ المختلفة لها خصائص منتشرة مختلفة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 ثانية.

الشكل 3: تسميات تعقب ER للتقسيمات النووية المتزامنة. تم حقن جنين الأديم الأرومي المخلوي مع تعقب ER وتم تصوير جزء من سطحه بمرور الوقت. (أ) تجميع المغزل أثناء التقسيم النووي. (ب) قطع الغلاف النووي أثناء نفس التقسيم. (ج) الطور البيني اللاحق. (دال) يشار إلى بداية التقسيم التالي بمظهر مركزي (حدوث مناطق دائرية خالية من ER ، تتميز برؤوس أسهم). لاحظ تبييض الصبغة التدريجي. الطول الموجي للإثارة: 488 نانومتر. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. A: الإطار الأولي، B: 3 دقائق منقضية، C: 10 دقائق المنقضية، D: 13 دقيقة المنقضية. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 ثانية.

الشكل 4: Mitoview 633 وضع العلامات على الميتوكوندريا. تم حقن الجنين ب Mitoview 633 خلال مرحلة الأديم الأرومي المخلوي وتصويره بعد 4 ساعات ، بعد التزيين. تظهر الصورة خلية عصبية جلدية لجنين في امتداد النطاق الجرثومي. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 ثانية.

الشكل 5: الوسم المشترك ل LDs والأنابيب الدقيقة. تم حقن جنين خلوي بمزيج من BODIPY 493/503 (الأصفر A ، B ، C) و SiR Tubulin (أرجواني A ، B ، C). أ''، ب''، ج'' عرض القنوات المدمجة. تظهر اللوحات A و A و A' الإطار الأولي ، وتعرض اللوحات B و B و B الإطار بعد 5 ثوان ، وتعرض اللوحات C و C و C الإطار بعد 10 ثوان. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 512 × 512 (متوسط الخط 3) كل 2.5 ثانية.

الشكل 6: تصوير التألق الذاتي لحويصلات صفار البيض خلال مراحل الانقسام المتزامن . (أ) في بداية الاكتساب. (ب) بعد 8 دقائق (ج) بعد 16 دقيقة. الطول الموجي للإثارة: 405 نانومتر. تم استخدام كثافة الإثارة المنخفضة للحفاظ على الجنين على قيد الحياة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. تم الحصول على إطار 1024 × 1024 (متوسط الخط 4) كل 30 ثانية.

بيانات تكميلية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

جنين ذبابة الفاكهة هو نموذج قوي ومناسب لدراسة الأسئلة الأساسية في البيولوجيا الخلوية والكائنات الحية. بساطته النسبية ، وعلم الوراثة القوي ، وصغر حجمه يجعلها نظاما ممتازا لتصوير كل من العمليات الخلوية والتنمية. هنا ، يتم تكييف بروتوكول الحقن المجهري القياسي لتمكين استخدام FP في الأجنة. يسمح هذا النهج بالتصوير الفلوري لهياكل خلوية محددة دون الحاجة إلى فلوروفورات مشفرة وراثيا ، مما يفتح العديد من الخلفيات الجينية للتصوير. يمكن أن يؤدي الجمع بين أصباغ متعددة بالإضافة إلى البروتينات المختارة بشكل استراتيجي ذات العلامات الفلورية إلى فتح تصوير مباشر متعدد القنوات يمتد عبر مجموعة كاملة من الضوء المرئي.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول:
يستخدم هذا البروتوكول BODIPY 493/503 لتسمية LDs. يمكن بسهولة تكييف هذا النهج لوضع علامة على الهياكل الخلوية الأخرى. بالنسبة لتحليل الصور اللاحق ، فإن أحد أهم العوامل هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، أي سطوع الصبغة مقارنة بإشارة الخلفية. تم تصوير الليزوسومات بنجاح (LysoTracker Red ، 1 mM) ، وكذلك الميتوكوندريا (Mitoview 633 ، 200 μM) ، و ER (متعقب ER Green ، 10 μM) ، والأنابيب الدقيقة (SiR tubulin ، 200 nM في DMSO) ، كما هو موضح في الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، الشكل 5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حويصلات صفار البيض هي ذاتية الفلورسنت وتعطي ضوءا أزرق عند إثارة الأشعة فوق البنفسجية (الصورة باستخدام 405 نانومتر كطول موجي للإثارة (الشكل 6)). بالنسبة للأصباغ الأخرى ، تهدف إلى أن يكون تركيز الصبغة 100-1000x مما هو مطلوب لتلطيخ الخلايا المستزرعة الحية ؛ هذا مشابه لتركيز محلول المخزون الذي سيتم تخفيفه في وسائط زراعة الخلايا. نظرا لأن هذا البروتوكول يدعو إلى حقن 100 fL وجنين ذبابة الفاكهة هو تقريبا 9 nL في الحجم¹⁸ ، فإن تركيزات الصبغة هذه ستصل في المتوسط إلى تركيز جنيني داخلي أقل من 1/100th مما هو موجود في وسائط زراعة الخلايا. مؤقتا ، سيكون التركيز المحلي أعلى في موقع الحقن ، وهو الأكثر ملاءمة ل FPs التي لا تنتشر بشكل جيد (أي أصباغ الميتوكوندريا و SiR-tubulin). بالنسبة لهذه FPs ، ابدأ بالتركيزات العالية الموصى بها ؛ إذا لوحظ موت غير متوقع ، فقم بالتخفيف على التوالي مرتين حتى يتم التوصل إلى حل وسط مقبول بين البقاء على قيد الحياة وقوة الإشارة.

عند الحقن المشترك لأصباغ متعددة ، يجب أن تكون كلتا الصبغتين إما في نفس المذيب ، أو يجب أن تكون كل من المذيبات والأصباغ متوافقة مع الخليط (لا ينصح بتركيزات الكحول التي تتجاوز ~ 10٪).

تعد جودة الإبر ضرورية لنجاح هذا الإجراء ، حيث يجب أن يكون الطرف جيدا قدر الإمكان. خلاف ذلك ، يمكن أن يؤدي الضرر الناجم عن جرح الحقن إلى الإضرار بالتطور اللاحق للجنين. نظرا لاختلاف مجتذبات الإبرة التجارية ، من المهم اتباع اقتراحات الشركة المصنعة وتجربة معلمات سحب متعددة حتى يتم تحقيق الشكل المطلوب. من الأهمية بمكان تنفيذ خطوة مراقبة الجودة 1.1.3 لأن العمل مع طرف إبرة متصدع أو خشن أو كبير التجويف سيجعل الحقن الناجح أكثر صعوبة أو حتى مستحيلا.

يحتاج الجنين إلى التجفيف جزئيا بحيث يمكن إضافة كميات إضافية من السائل أثناء الحقن. إذا كان الجنين غير جاف ، فلن تدخل الإبرة بسهولة ، وسوف ينفث السيتوبلازم مع اختراق الإبرة أو عند حقن المحلول. إذا كان الجنين مجففا بشكل مفرط ، فسيبدو مفرغا ولن يتطور بشكل صحيح. يعتمد وقت التجفيف الدقيق على الظروف المحلية ، على سبيل المثال ، رطوبة الهواء ، ويمكن أن يتغير من يوم لآخر. ويجب تحديده تجريبيا لكل دورة.

تعتمد قدرة الجنين على البقاء على قيد الحياة بعد الحقن المجهري بشكل حاسم على جودة الإبرة ، والتجفيف المناسب ، والحد من حجم الحقن إلى أقل من 1 pL (من الناحية المثالية 100 fL). طالما تم تحسين هذه المعلمات ، لا تظهر سمية كبيرة عند حقن الأصباغ الموصوفة بالتركيزات الموصى بها. إذا نجت الأجنة من خطوات التجفيف والحقن ، فإنها عادة ما تتطور بنجاح جيد في امتداد النطاق الجرثومي ، باستثناء مجسات الأنابيب الدقيقة و ER التي تسببت في عيوب الخلوية بمستويات عالية (حقن 100 fL من تركيز المخزون لكل منهما). لم يجد الاختبار أي عيوب تنموية واضحة عندما تم حقن DMSO والماء ومخاليط الاثنين بالكميات الموصى بها ، مع معدل بقاء الجنين من خلال تمديد النطاق الجرثومي بنسبة ~ 75٪ أو أكثر. تسببت أحجام الحقن التي تزيد عن 1 pL في حدوث عيوب وأجنة تم حقنها بأحجام ~ 4 pL تم تطويرها لمدة تقل عن 1 ساعة. لذلك ، يجب أن تبقى أحجام الحقن منخفضة ، مما يعني أن تركيزات الصبغة يجب أن تكون عالية.

بشكل عام ، يوصى بالحقن على طول الحافة الجانبية للجنين لأن ذلك يؤدي إلى أقل ضرر. ومع ذلك ، قد يلزم تعديل موقع الحقن اعتمادا على الخصائص المنتشرة ل FPs المستخدمة. ينتشر BODIPY 493/503 و LysoTracker بشكل أسرع عبر الجنين بأكمله من Lipid Spot 610 (صبغة أخرى لتمييز LDs) ، في حين أن SiR-Tubulin و Mitoview 633 لا ينتشران بالكامل عبر الجنين (التصوير في وقت متأخر من 7 ساعات بعد الحقن). وبالتالي ، قد يكون الحقن في أو بالقرب من موقع الاهتمام ضروريا. عند الحقن في المناطق الأمامية أو الخلفية ، يوصى باستخدام إبرة دقيقة بشكل خاص.

يعتمد الحصول على الصور على الفحص المجهري البؤري لتقسيم العضيات الصغيرة وجميع مكونات الهيكل الخلوي وحلها بصريا. لن تنجح التقنيات التي تتطلب تحليل العديد من الصور (مثل STORM أو PALM) لأن المحتويات الجنينية في حالة حركة ولم يتم تحسين الفلوروفورات للتبديل الضوئي. يفتقر المجهر Epifluorescence إلى الدقة الجانبية والمحورية لصنع معظم العضيات والهياكل الخلوية الأصغر. لهذه الأسباب ، يوصى بشدة باستخدام المجهر البؤري أو استخدام تقنية ورقة الضوء.

تعتمد قابلية تحليل الصور للتكرار بشكل كبير على بيانات التصوير المتسقة. للحصول على أكبر فرصة للنجاح ، يلزم تحسين تقنية الحقن والحصول على الصور. إن إنشاء وممارسة تقنية تكون فيها الصبغة (الصبغات) ذات الأهمية ، وموقع الحقن ، وعمر الجنين ، وحجم الحقن ، وإعداد الاكتساب كلها متسقة ستولد أقوى البيانات لتحليل الصور.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الطريقة
يوضح هذا البروتوكول طريقة لتحليل التدفق الأكبر ل LDs في أجنة مرحلة الانقسام باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات. يمكن استخدام نفس النهج للعضيات الأخرى ، ومراحل النمو الأخرى ، وطرق التحليل الأخرى. على سبيل المثال، يوضح الشكل 2 تحليل LDs والعضيات الحمضية المتدفقة في المراحل المخلوية من التكوين الجنيني، والتي تم تصورها عن طريق الحقن المشترك BODIPY 493/503 و LysoTracker Red. وقد تحقق مزيد من التصوير الناجح لحركة LD في الأجنة حتى 7 ساعات بعد الإخصاب؛ تحتفظ هذه الأجنة بجرح الحقن ولكنها قادرة على التطور لعدة ساعات.

تم استخدام البيانات التي تم جمعها باستخدام هذا البروتوكول لقياس سرعة صورة الجسيمات ، ولكن تتوفر العديد من تقنيات التحليل الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن استخدام برامج تتبع الجسيمات مثل تلك الموجودة في ImageJ أو Imaris أو التتبع اليدوي للحصول على سرعات واتجاهات الهياكل المتحركة. لاحظ أن معظم برامج التتبع هذه مصممة للعمل مع البيانات من أنظمة زراعة الخلايا المستوية ولا تتكيف دائما بشكل جيد مع هياكل 3D مثل جنين ذبابة الفاكهة . وعلاوة على ذلك، ومن أجل توليد أفضل بيانات تتبع الجسيمات جودة، ستحتاج إلى تصوير طائرات Z متعددة؛ يجب أن يكون هذا ممكنا إذا كانت أوقات اكتساب مكدس الصور أقل من ~ 2 ثانية. يجب أن يكون هذا المعيار قابلا للوصول إليه على قرص الدوران ، وورقة الضوء الشبكية ، والأنظمة البؤرية الحديثة للمسح بالليزر. ومع ذلك ، فإن جدوى تتبع الجسيمات للعضيات الوفيرة مثل LDs والميتوكوندريا والليزوسومات منخفضة لأن كمية الإشارة الإيجابية في مجال الرؤية مرتفعة للغاية بالنسبة لطرق التتبع الحالية. قد يكون من الممكن تتبع الهياكل الأقل وفرة مثل النوى أو حويصلات صفار البيض. يعمل PIV لتحليل التدفق بشكل جيد مع LDs والعضيات الحمضية في مراحل الانقسام لأن كلا العضيتين تتحركان بحرية. ترتبط العضيات مثل النوى و ER والميتوكوندريا بهياكل خلوية أخرى وبالتالي لا تتحرك بحرية ولا تتناسب مع تحليل البرامج الذي يفترض حرية الحركة. يجب على المحقق اختيار التقنيات الأنسب للعضية المثيرة للاهتمام.

خلال مرحلتي الأديم الأرومي المخلوي والخلوي ، تتحرك LDs (وكذلك بعض العضيات الأخرى) على طول الأنابيب الدقيقة الموجهة شعاعيا⁵. لذلك من الممكن العثور على مناظر مقطعية مستعرضة (كما هو الحال في الشكل 5) حيث تكون الأنابيب الدقيقة المفردة في بؤرة التركيز لمسافات طويلة ، مما يسمح بتتبع الجسيمات في 2D. نظرا لأن هذه الطائرات البصرية عميقة داخل الجنين ، فإن قوة الإشارة الإجمالية تتضاءل ، ويتم تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء.

لتحليل التتبع ، يمكن أن يكشف التصوير في أسرع وقت ممكن عن تفاصيل حاسمة للحركة وبالتالي للآلات المتحركة. على سبيل المثال ، حركة قطرات الدهون هي مزيج من حالتين متحركتين ، حركة بطيئة قصيرة (~ 200 نانومتر / ثانية ؛ متوسط مسافة السفر ~ 100 نانومتر) وحركة سريعة طويلة (~ 450 نانومتر / ثانية ؛ متوسط مسافة السفر ~ 1000 نانومتر)¹⁹ ؛ وبالتالي ، إذا تم التقاط الصور كل ثانية أو حتى أقل تكرارا ، تصبح الحالة البطيئة القصيرة غير قابلة للاكتشاف. ومع ذلك ، فإن التصوير المتكرر يحفز أيضا تبييض الفلوروفور والسمية الضوئية. لذلك ، يجب تعديل ظروف التصوير اعتمادا على السؤال الدقيق الذي يجب معالجته.

قيود الطريقة
اعتمادا على الصبغة المطلوبة ، يمكن أن تكون الطريقة محدودة بالتوافق بين ذوبان الصبغة وسمية محلول الحقن. من الصعب التعامل مع الكحوليات مثل الأيزوبروبانول والإيثانول داخل إبرة بسبب انخفاض لزوجتها ويبدو أنها تتلف المكونات الخلوية وتقتل الجنين.

كما أن هذه الطريقة ليست مناسبة تماما لتصور الخطوات الأولى في تكوين الأجنة لأن الأمر يستغرق أكثر من 30 دقيقة لإعداد الأجنة للحقن. في درجة حرارة الغرفة ، تكون دورات الخلية الأولية للجنين ~ 10 دقائق فقط لكل منها ؛ لذلك ، حتى لو اختار المرء بويضة مخصبة حديثا في الخطوة 5.2.3 ، فإن دورات الخلايا القليلة الأولى ستكتمل بالفعل بحلول الوقت الذي يكون فيه الجنين جاهزا للتصوير.

الإضاءة مع الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية / الزرقاء هي أكثر سمية للضوء بكثير من الأطوال الموجية الأطول. في ظل هذه الظروف (على سبيل المثال ، لمتابعة حويصلات صفار البيض ذاتية الفلورسنت ؛ الشكل 6) ، يتعين على المرء الحد من وقت التصوير (مما يؤدي إلى سلسلة زمنية أقصر) أو استخدام طاقة ليزر أقل (مما يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء).

بعد التجميع الخلوي ، تميل الأصباغ التي يتم حقنها في موقع معين إلى الانتشار بشكل سيئ ، حيث يجب أن تجتاز العديد من أغشية الخلايا. هذا يحد من منطقة الملاحظة في مراحل النمو اللاحقة.

أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق القائمة / البديلة
يمكن تصور حركة LDs وغيرها من العضيات المحتوية على الدهون في الأجنة المبكرة باستخدام الفلوروفورات المشفرة وراثيا ، والتقنيات الخالية من الملصقات ، وإدخال FPs. يمكن تحقيق هذا الأخير عن طريق اختراق غشاء vitelline¹² أو نهج الحقن المجهري الذي تمت مناقشته هنا.

الفلوروفورات المشفرة وراثيا هي علامات متعددة الاستخدامات تكون مستوياتها عادة قابلة للتكرار بشكل كبير من جنين إلى جنين. ومع ذلك ، لديهم عوائد كمية أقل وتبييض بسهولة أكبر من FPs. عادة ، فهي متوفرة فقط في إصدار واحد أو اثنين من الإصدارات الموسومة (على سبيل المثال ، GFP أو mCherry) ، مما يحد من اختيار الهياكل التي يمكن تصويرها في وقت واحد. من ناحية أخرى ، غالبا ما توجد FPs في مجموعة كبيرة ومتنوعة ؛ على سبيل المثال ، تتوفر العديد من الأصباغ الخاصة بقطرات الدهون مع أطياف الانبعاثات من Autodot في طيف الأشعة فوق البنفسجية / الزرقاء إلى Lipidtox و LipidSpot 610 في الطيف الأحمر البعيد. يمكن أيضا تطبيق FPs مباشرة على أي سلالة من الاهتمامات ، وبالتالي لا تتطلب بناء سلالة ، على سبيل المثال ، إدخال علامة العضية المطلوبة في سلالة متحولة من الاهتمام. وهذه الميزة واضحة بشكل خاص عندما يتم تصنيف هياكل متعددة في وقت واحد؛ بدلا من الصلبان المستهلكة للوقت التي تمتد عبر أجيال متعددة ، يمكن تحقيق ذلك في يوم واحد عن طريق خلط الأصباغ ذات الصلة وتقديمها في نفس الوقت. أخيرا ، إذا كان سيتم فحص العمليات الخلوية باستخدام تثبيط دوائي ، فيمكن إدخال الأدوية والأصباغ معا.

الطرق الخالية من الملصقات هي طرق قوية جدا للكشف عن هياكل خلوية محددة. على سبيل المثال ، يمكن اكتشاف LDs على وجه التحديد في الأجنة المبكرة عن طريق المجهر التوافقي الثالث²⁰ أو عن طريق المجهر²¹ لفقدان الفيمتو ثانية المحفز من الفيمتو ثانية. مثل FPs ، يمكن تطبيق هذه الأساليب في أي خلفية وراثية ، ولأنها لا تسبب التبييض ، فمن المحتمل أن تسمح بالحصول على الصور بشكل أسرع. ومع ذلك ، فإنها تقتصر عادة على عضيات محددة ، وبالتالي لا تدعم في حد ذاتها التصوير متعدد الإرسال ؛ كما أنها تتطلب مجاهر متخصصة.

هناك استراتيجيتان عامتان لإدخال جزيئات صغيرة في الأجنة. أحدهما هو نهج الحقن المجهري المستخدم هنا. والآخر هو العلاج الكيميائي (التربين) لاختراق غشاء الفيتيلين. النهج الأخير¹² أقل مشاركة من الحقن المجهري ، ولكنه أيضا أكثر تنوعا من جنين إلى جنين. بالإضافة إلى ذلك ، بعد النفاذية ، يتم اختراق الحماية التي يوفرها غشاء vitelline ويكون الجنين المناسب متاحا للوسط الخارجي ، مما يجعل من الصعب إبقائه على قيد الحياة. الحقن المجهري أقل احتمالا بكثير لإخراج التطور الجنيني عن مساره من النفاذية. ومع ذلك ، يوصى بالنفاذية إذا كان هناك حاجة إلى مراقبة العديد من الأجنة في وقت واحد ، على سبيل المثال ، لأغراض فحص الأدوية. لمتابعة حركة الهياكل الخلوية والحصول على سلسلة صور قابلة للتكرار مناسبة لتحليل الصور ، فإن الحقن المجهري هو الطريقة المفضلة.

أهمية والتطبيقات المحتملة للطريقة في مجالات بحثية محددة
جنين ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي مهم لدراسة العديد من العمليات الخلوية البيولوجية والتنموية¹،^5،6. وقد ساهم وسم العضيات بالبروتينات الفلورية إسهاما كبيرا في فهم كيفية تطور الجنين المبكر، وكيفية حركة العضيات المختلفة، وكيف يتم تعديل هذا الاتجار من الناحية التنموية والوراثية. ومع ذلك ، فإن ميلها إلى التبييض وتحديات توليد سلالات يتم فيها تصنيف عضيات متعددة بألوان مختلفة تحد من تطبيق هذا النهج. إن استخدام FPs التي يتم إدخالها عن طريق الحقن المجهري يحل العديد من هذه التحديات ويمكن حتى دمجه مع البروتينات الموسومة بالفلورسنت. تسمح هذه التقنية بتصوير عضيات متعددة وهياكل خلايا ومكونات هيكلية خلوية في أي خلفية وراثية. ونتيجة لذلك، يمكن مقارنة العديد من الأنماط الجينية عن طريق التصوير الحي، مما يجعل من الممكن تحديد تأثير الطفرات على الاتجار بالعضيات المتعددة.

يوضح هذا البروتوكول نهج حقن FP لأجنة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، ولكن من حيث المبدأ ، ينطبق هذا النهج على أي بيض حشرات تم إنشاء تقنيات الحقن المجهري لها ، بما في ذلك الأنواع الأخرى من ذبابة الفاكهة ، الصراصير²² ، وحشرات المن²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	بقع قطرات الدهون باللون البنفسجي / الأزرق
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	بقع قطرات الدهون في
الخرز المجفف الأخضر & ndash ؛ المجفف اللامائي يشير إلى Drierite	WA Hammond Drierite Company	21001
مجهر تشريح SteREO DiscoveryV20 مع قاعدة إضاءة	Zeiss	4350030000000000
شريط مزدوج الوجهين شريط لاصق دائم على الوجهين	سكوتش (3M)	-	يباع من قبل العديد من البائعين
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	يلطخ ER / المغلف النووي
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	الزجاجية جاهزة للاستخدام
- Glass Thinw w / fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	يجب سحب
غطاء زجاجي	-		قم بشراء معامل الانكسار المناسب لعدستك
الموضوعية شرائح زجاجية - شرائح مجهر بلوري مزدوجة تم تنظيفها مسبقا	FisherBrand	12-550-343
زيت الهالوكربون 27	سيجما ألدريتش	H8773-100ML
زيت الهالوكربون 700	سيجما ألدريتش	H8898-50ML
هيبتان بديل أكثر اخضرارا لامائي ، 99٪	Sigma-Aldrich	246654-1L	يعتبر Heptane ساما من قبل
المجهر متحد البؤر	Leica	Sp5	العديد من الأنواع المختلفة من البؤر المتحد سوف تعمل المجاهر.
LipidSpot 610	Biotium	# 70069	بقع قطرات الدهون باللون الأحمر البعيد
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	بقع الليزوزومات باللون الأحمر
MitoView 633	Biotium	# 70055	بقع الميتوكوندريا
أطراف ماصة تحميل الإبرة - نصائح محمل دقيق 20uL	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000 ، الجيل التالي من مجتذب	الماصات الدقيقةأدوات سوتر	P-1000	الإعدادات المستخدمة هي الحرارة -470 ، السحب -70 ، السرعة -60 ، التأخير -90 ، الضغط -200 ، المنحدر -479 عند 1 × 1. تشير إلى شدة وطول التسخين ، وتوقيت قوة السحب وما إذا كانت القوة تطبق خطيا. باستخدام هذه الظروف ، تولد إحدى الشعيرات الدموية إبرتين قابلتين للاستخدام مع فتحات دقيقة عند الحافة.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	التي أدلى بها Spirochrome ؛ شركة Cytoskeleton Inc. هي الموزع في أمريكا الشمالية. بقع الأنابيب الدقيقة باللون الأحمر البعيد
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	# 70064	بقع الأنابيب الدقيقة باللون البنفسجي / الأزرق