يصف البروتوكول طريقة تحميل صبغة الكالسيوم الفلورية من خلال العصب المقطوع إلى أطراف العصب الحركي للفأر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة فريدة لتسجيل انتقالات الكالسيوم السريعة في النهايات العصبية الطرفية باستخدام المجهر البؤري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تسجيل انتقالات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية للفأر بدقة زمنية عالية باستخدام المجهر البؤري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد تقدير مستوى الكالسيوم قبل المشبكي مهمة رئيسية في دراسة انتقال المشبكية لأن دخول الكالسيوم إلى الخلية قبل المشبكي يؤدي إلى سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى إطلاق الناقل العصبي. علاوة على ذلك ، فإن التغيرات في مستويات الكالسيوم قبل المشبكي تتوسط نشاط العديد من البروتينات داخل الخلايا وتلعب دورا مهما في اللدونة المتشابكة. دراسة إشارات الكالسيوم مهمة أيضا لإيجاد طرق لعلاج الأمراض العصبية التنكسية. التقاطع العصبي العضلي هو نموذج مناسب لدراسة اللدونة المشبكية ، لأنه يحتوي على نوع واحد فقط من الناقل العصبي. توضح هذه المقالة طريقة تحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال حزمة الأعصاب المقطوعة في النهايات العصبية الحركية للفئران. تسمح هذه الطريقة بتقدير جميع المعلمات المتعلقة بتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ، مثل مستوى الكالسيوم القاعدي والكالسيوم العابر. نظرا لأن تدفق الكالسيوم من خارج الخلية إلى الأطراف العصبية وربطه / فك ارتباطه بالصبغة الحساسة للكالسيوم يحدث في حدود بضعة ميلي ثانية ، يلزم وجود نظام تصوير سريع لتسجيل هذه الأحداث. في الواقع ، تستخدم الكاميرات عالية السرعة بشكل شائع لتسجيل تغييرات الكالسيوم السريعة ، ولكن لديها معلمات دقة صورة منخفضة. يسمح البروتوكول المقدم هنا لتسجيل الكالسيوم العابر بدقة مكانية وزمنية جيدة للغاية يوفرها المجهر البؤري.
المقدمة
تعد مشكلة قياس موجات الكالسيوم السريعة في الخلايا القابلة للإثارة واحدة من أهم الجوانب وأكثرها تحديا لدراسة انتقال الإشارة في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تلعب أيونات الكالسيوم دورا مهما في تحفيز إطلاق الناقل العصبي ، واللدونة المشبكية ، وتعديل نشاط البروتينات المختلفة داخل الخلايا1،2،3،4،5. دراسة إشارات الكالسيوم مهمة أيضا لإيجاد طرق لعلاج الأمراض العصبية التنكسية6. لقياس التغيرات في مستويات الكالسيوم ، يشيع استخدام الأصباغ الحساسة للكالسيوم الفلورسنت ، ويتم تحليل التغيرات في مست....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت التجارب على المستحضرات العصبية العضلية المعزولة للرافع أوريس لونغوس (m. LAL) من الفئران BALB / C (20-23 جم ، 2-3 أشهر)41. تم تنفيذ الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية لاستخدام المختبر في جامعة قازان الفيدرالية وجامعة قازان الطبية ، وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. يفي البروتوكول التجريبي بمتطلبات توجيه مجلس الجماعات الأوروبية 86/609/EEC وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة قازان الطبية.
1. إعداد حلول الرنين والإيداع
- تحضير محلول رينجر لعضلات الثدييات عن طريق خلط المكونات التالية: كلوريد الصوديوم (137 ملليمتر)، KCl (5 ملليمتر)، كاكل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد تحميل المستحضر بالصبغة وفقا للتقنية المقدمة ، كان لمعظم نقاط الاشتباك العصبي الموجودة بالقرب من جذع العصب مستوى كاف من التألق (انظر الشكل 2). بعد تحميل التحضير بالصبغة وتطبيق الطريقة الموصوفة للتسجيل ومعالجة الصور ، تم الحصول على انتقالات الكالسيوم بالدقة المكانية والزمانية المطلوبة (انظر الشكل 4). تم استرداد الكالسيوم العابر بالطريقة المقترحة (انظر الشكل 3).
كما تم تحليل السعة ومعلمات الوقت للإشارات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم تقديم طريقة تحميل صبغة حساسة Ca2 + في النهايات العصبية للفأر من خلال الجذع العصبي ولتسجيل عابر سريع للكالسيوم باستخدام المجهر البؤري في هذه المقالة. نتيجة لتنفيذ طريقة التحميل هذه ، كان لدى معظم نقاط الاشتباك العصبي الموجودة بالقرب من جذع العصب مستوى كاف من التألق لتمكين تسجيل دخول الكالسيوم إلى النهايات العصبية استجابة للتحفيز منخفض التردد للعصب الحركي.
على عكس البروتوكولات المقدمة سابقا لتحميل أصباغ الكالسيوم من خلال الجذع ، تم تصميم هذا البروتوكول للاستخدام على نقاط الاشتباك .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم إجراء دراسات التألق لهذا العمل بدعم مالي من منحة مؤسسة العلوم الروسية (المشروع رقم 19-15-00329). تم تطوير هذه الطريقة بتمويل من مهمة حكومية لمركز FRC قازان العلمي التابع ل RAS АААА-А18-118022790083-9. تم تطوير البحث باستخدام معدات مركز البحوث الفيدرالي "مركز قازان العلمي التابع ل RAS". يود المؤلفان أن يشكرا الدكتور فيكتور إيلين على قراءته النقدية لهذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
أدوات منتج 40 مم محلي محلي
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلارك الطبية الكهروحرارية الشعرية | ، المملكة المتحدة | GC150-10 | |
| نظام المجهر متحد البؤر ومتعدد الفوتون Leica TCS SP5 MP | Leica Microsystems ، هايدلبرغ ، ألمانيا | ||
| مشتعل / مجتذب ماصة دقيقة براون P 97 | أداة Sutter ، الولايات المتحدة الأمريكية | P-97 | |
| منظم التدفق | KD Medical GmbH منتجات المستشفيات ، ألمانيا | KD REG | مجموعة التسريب القابل للتصرف مع منظم التدفق |
| HEPES | Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية | H0887 | نظام إضاءة 100 مل |
| Leica CLS 150X | Leica Microsystems ، ألمانيا | ||
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| برنامج Las AF | Leica Microsystems ، هايدلبرغ ، ألمانيا | ||
| Las X software | Leica Microsystems ، هايدلبرغ ، ألمانيا | https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/ | |
| حامل مغناطيسي مع أنابيب شفط | BIOSCIENCE TOOLS ، USA | MTH-S | |
| Microspin FV 2400 | Biosan ، لاتفيا | BS-010201-AAA | |
| Minutien Pins | أدوات العلوم الدقيقة ، كندا | 26002-20 | |
| متعدد الدوران MSC 3000 | Biosan ، لاتفيا | BS-010205-AAN | |
| أوريغون جرين 488 BAPTA-1 ملح خماسي البوتاسيوم | المجسات الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية | O6806 | 500 & mu ؛ g |
| Pipette | Biohit ، روسيا | 720210 | 0.5-10 & micro ؛ L |
| طرف الماصة | Biohit ، روسيا | 781349 | 10 & micro ؛ L |
| محلي | للبلاستيسين | ||
| إبر تحت الجلد للاستخدام مرة واحدة | Bbraun | 100 Sterican | 0.4 & مرات ؛ |
| برنامج جداول بيانات | مايكروسوفت ، الولايات المتحدة الأمريكية | مايكروسوفت أوفيس إكسل | |
| مجهر مجسم ، لايكا M80 | لايكا مايكروسيستمز ، ألمانيا | ||
| قطب شفط | كازاكوف أ. قطب شفط بسيط للتحفيز الكهربائي للأجسام البيولوجية / أ. كازاكوف ، م. ألكسندروف ، إن في زيلياكوف وآخرون // مجلة الأبحاث الدولية. - 2015. - رقم 9 (40) الجزء 3. - ص. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/ | |
| سيلجارد 184 مطاط مطاطي | داو كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| حقنة | منتج | 0.5 مل | |
| حقنة | منتج | 60 مل |
المراجع
- Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
