يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تسجيل انتقالات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية للفأر بدقة زمنية عالية باستخدام المجهر البؤري

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63308

⸱

ديسمبر 1, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول طريقة تحميل صبغة الكالسيوم الفلورية من خلال العصب المقطوع إلى أطراف العصب الحركي للفأر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة فريدة لتسجيل انتقالات الكالسيوم السريعة في النهايات العصبية الطرفية باستخدام المجهر البؤري.

الملخص

يعد تقدير مستوى الكالسيوم قبل المشبكي مهمة رئيسية في دراسة انتقال المشبكية لأن دخول الكالسيوم إلى الخلية قبل المشبكي يؤدي إلى سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى إطلاق الناقل العصبي. علاوة على ذلك ، فإن التغيرات في مستويات الكالسيوم قبل المشبكي تتوسط نشاط العديد من البروتينات داخل الخلايا وتلعب دورا مهما في اللدونة المتشابكة. دراسة إشارات الكالسيوم مهمة أيضا لإيجاد طرق لعلاج الأمراض العصبية التنكسية. التقاطع العصبي العضلي هو نموذج مناسب لدراسة اللدونة المشبكية ، لأنه يحتوي على نوع واحد فقط من الناقل العصبي. توضح هذه المقالة طريقة تحميل صبغة حساسة للكالسيوم من خلال حزمة الأعصاب المقطوعة في النهايات العصبية الحركية للفئران. تسمح هذه الطريقة بتقدير جميع المعلمات المتعلقة بتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ، مثل مستوى الكالسيوم القاعدي والكالسيوم العابر. نظرا لأن تدفق الكالسيوم من خارج الخلية إلى الأطراف العصبية وربطه / فك ارتباطه بالصبغة الحساسة للكالسيوم يحدث في حدود بضعة ميلي ثانية ، يلزم وجود نظام تصوير سريع لتسجيل هذه الأحداث. في الواقع ، تستخدم الكاميرات عالية السرعة بشكل شائع لتسجيل تغييرات الكالسيوم السريعة ، ولكن لديها معلمات دقة صورة منخفضة. يسمح البروتوكول المقدم هنا لتسجيل الكالسيوم العابر بدقة مكانية وزمنية جيدة للغاية يوفرها المجهر البؤري.

المقدمة

تعد مشكلة قياس موجات الكالسيوم السريعة في الخلايا القابلة للإثارة واحدة من أهم الجوانب وأكثرها تحديا لدراسة انتقال الإشارة في الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. تلعب أيونات الكالسيوم دورا مهما في تحفيز إطلاق الناقل العصبي ، واللدونة المشبكية ، وتعديل نشاط البروتينات المختلفة داخل الخلايا1،2،3،4،5. دراسة إشارات الكالسيوم مهمة أيضا لإيجاد طرق لعلاج الأمراض العصبية التنكسية6. لقياس التغيرات في مستويات الكالسيوم ، يشيع استخدام الأصباغ الحساسة للكالسيوم الفلورسنت ، ويتم تحليل التغيرات في مستوى التألق7،8،9.

يمكن تحقيق تحميل أصباغ الكالسيوم في الخلايا بطرق مختلفة. في الغالب ، يتم استخدام الأصباغ الخلوية10,11. ومع ذلك ، في مثل هذه الحالة ، ليس من الصعب فقط التحكم في تركيز الصبغة داخل الخلية ، ولكن من الصعب أيضا تحديد الخلايا المستهدفة للتحميل. هذه الطريقة غير قابلة للتطبيق لدراسة النهايات العصبية الطرفية لأن الصبغة تدخل الخلايا ما بعد المشبكي. بدلا من ذلك ، تكون الأصباغ الخلوية غير المقصودة أكثر ملاءمة لمثل هذه المستحضرات. في هذه الحالة ، يتم تسليم الأصباغ إلى الخلايا عن طريق الحقن المجهري أو من خلال ماصة التصحيح12،13،14. هناك أيضا طريقة للتحميل من خلال جذع الأعصاب. الطريقة الأخيرة هي الأنسب لمستحضرات الوصلة العصبية العضلية15،16،17،18،19،20. يسمح بإجراء تلطيخ للخلايا ذات الاهتمام فقط. على الرغم من أن هذه الطريقة لا توفر تقييما دقيقا لتركيز الصبغة في الخلية المستهدفة ، إلا أنه يمكن تقدير التركيز تقريبا من خلال مقارنة مستوى تألق الخلايا في حالة السكون في المحاليل ذات التركيز المعروف للكالسيوم21. في هذه الدراسة ، يتم تقديم تعديل لهذه الطريقة المطبقة على نقاط الاشتباك العصبي للثدييات.

دخول الكالسيوم خلال مرحلة إزالة الاستقطاب من إمكانات العمل هو عملية سريعة ، وخاصة في التقاطع العصبي العضلي. لذلك ، لتسجيلها ، هناك حاجة إلى المعدات المناسبة1. أظهرت دراسة حديثة باستخدام صبغة فلورسنت حساسة للجهد أن مدة جهد العمل في المشبك المحيطي للفأر تبلغ حوالي 300 ميكروثانية22. الكالسيوم العابر ، الذي يتم تقييمه باستخدام أصباغ حساسة للكالسيوم في نقاط الاشتباك العصبي الطرفية للضفدع ، له مدة أطول: وقت الارتفاع حوالي 2-6 مللي ثانية ووقت الاضمحلال حوالي 30-90 مللي ثانية ، اعتمادا على صبغة الكالسيوم المستخدمة23,24. لقياس العمليات السريعة بمساعدة الأصباغ الفلورية ، يتم استخدام كاميرات CCD أو CMOS بشكل عام ، مع مصفوفات CCD سريعة وحساسة. ومع ذلك ، فإن هذه الكاميرات لها عيب الدقة المنخفضة ، محدودة بحجم العناصر الحساسة للمصفوفة25،26،27،28. أسرع الكاميرات ذات الحساسية الكافية لتسجيل كل من إمكانات الحركة وانتقالات الكالسيوم استجابة للتحفيز منخفض التردد للخلايا لديها تردد مسح ضوئي يبلغ 2000 هرتز ، ومصفوفة ببعد 80 × 8029. للحصول على إشارات ذات دقة مكانية أعلى ، يتم استخدام المجهر البؤري ، خاصة إذا كان من الضروري تقييم بعض التغيرات الحجمية في الإشارة 30،31،32. ولكن يجب أن نضع في اعتبارنا أن المجهر البؤري لديه سرعة مسح عالية في وضع المسح الضوئي الخطي ، ولكن لا تزال هناك قيود كبيرة على سرعة تسجيلات العمليات السريعة عند بناء صورة مكانية33. هناك مجاهر متحدة البؤرة تعتمد على أقراص Nipkow الدوارة (المجهر المجهري للمسح الشقي) والماسحات الضوئية متعددة النقاط ، والتي تتمتع بسرعة مسح أعلى. في الوقت نفسه ، فهي أدنى من المجاهر البؤرية الكلاسيكية في تصفية الصور البؤرية (الثقوب المتقاطعة للمجاهر مع قرص Nipkow)32،34،35. يمكن أن يوفر التصوير البؤري مع المسح الضوئي بالرنين أيضا دقة مكانية وزمنية عالية مطلوبة للقياسات الزمنية العالية36. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن تسجيل استجابات الفلورسنت الضعيفة بسرعة مسح عالية عند استخدام الماسحات الضوئية بالرنين يتطلب كاشفات حساسة للغاية مثل أجهزة الكشف الهجينة36.

تقدم هذه المقالة طريقة لزيادة الدقة الزمنية للإشارات المسجلة باستخدام المجهر البؤري للمسح الضوئي بالليزر (LSCM) مع الحفاظ على الدقة المكانية37. الطريقة الحالية هي تطوير إضافي للطرق الموضحة سابقا ونقلها إلى منصة LSCM38,39,40. لا يتطلب هذا النهج تغييرات في أجهزة المجهر ويستند إلى تطبيق خوارزمية لتسجيل إشارات الفلورسنت المستحثة بشكل دوري مع تحول زمني بالنسبة للحظة التحفيز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت التجارب على المستحضرات العصبية العضلية المعزولة للرافع أوريس لونغوس (m. LAL) من الفئران BALB / C (20-23 جم ، 2-3 أشهر)41. تم تنفيذ الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية لاستخدام المختبر في جامعة قازان الفيدرالية وجامعة قازان الطبية ، وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. يفي البروتوكول التجريبي بمتطلبات توجيه مجلس الجماعات الأوروبية 86/609/EEC وتمت الموافقة عليه من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة قازان الطبية.

1. إعداد حلول الرنين والإيداع

  1. تحضير محلول رينجر لعضلات الثدييات عن طريق خلط المكونات التالية: كلوريد الصوديوم (137 ملليمتر)، KCl (5 ملليمتر)، كاكل 2 (2 ملليمتر)، MgCl 2 (1 ملليمتر)، NaH2PO4 (1 ملليمتر)، ناهكو3 (11.9 ملليمتر)، والجلوكوز (11 ملليمتر). قم بفقاعة من خلال المحلول مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 واضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.4 عن طريق إضافة HCl / NaOH إذا لزم الأمر.
  2. تحضير حل تحميل الصبغة.
    1. تحضير محلول HEPES (10 mM) مع درجة الحموضة في نطاق 7.2-7.4. 500 ميكروغرام من الصبغة التجارية تأتي في قارورة 500 ميكرولتر. قم بإذابة الصبغة في 14 ميكرولتر من محلول HEPES للحصول على تركيز صبغة 30 mM. يرج جيدا وجهاز الطرد المركزي حتى يذوب تماما.
    2. قم بتخفيف محلول مؤشر Ca2+ باستخدام محلول HEPES حتى تركيز 1 mM. احتفظ به في الفريزر (-20 درجة مئوية) وتجنب التعرض للضوء.

2. إجراء تحميل الصبغة

ملاحظة: يتم تنفيذ إجراء تحميل الصبغة وفقا لبروتوكول التحميل من خلال جذع العصب ، مقتبس من البروتوكولات المنشورة سابقا19،42،43،44،45،46.

  1. تشريح عضلة LAL وفقا لإجراء تشريح لهذا التحضير كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا47,48.
    1. ثبت الأنسجة الممتدة قليلا (لا تزيد عن 30٪ من الطول الأولي) في طبق بتري المطلي بالمطاط الصناعي مع دبابيس ناعمة من الفولاذ المقاوم للصدأ وأضف محلول رينجر حتى يتم تغطية العضلات بالكامل.
      ملاحظة: تم ملء طبق بتري مسبقا بالمطاط الصناعي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. تحضير ماصة الحشو
    1. باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة (انظر جدول المواد) ، قم بإعداد ماصة دقيقة ذات طرف دقيق يكون حادا قدر الإمكان للتسجيلات داخل الخلايا. استخدم الشعيرات الدموية بدون خيوط داخلية (1.5 مم في القطر الخارجي و 0.86 أو 1.10 مم في القطر الداخلي).
    2. اقطع طرف الماصة الدقيقة بعد تسجيلمستدق مع مادة كاشطة ، وترك الطرف مفتوحا لحوالي 100 ميكرومتر في القطر. قم بتلميع الطرف لأسفل للحد من تقلص القطر الداخلي من >80 ميكرومتر إلى 12-13 ميكرومتر. قم بتوصيل أنبوب سيليكون بجانب واحد من ماصة التعبئة ومحقنة (بدون إبرة) إلى الجانب الآخر.
  3. تحت المجهر المجسم، ابحث عن المكان الذي يتحول فيه جذع العصب إلى فروع عصبية منفصلة. ضع ماصة الحشو مع الأنبوب المثبت والمحقنة على طبق بتري باستخدام الشمع. حرك طرف الماصة حتى يقف فوق العصب.
  4. باستخدام مقص ناعم ، اقطع العصب بالقرب من الألياف العضلية ، تاركا قطعة صغيرة من الجذع العصبي يبلغ طولها حوالي 1 مم. استنشق الجذع العصبي بلطف مع بعض محلول رينجر ، دون قرصه ، في طرف ماصة التعبئة. قم بإزالة أنبوب السيليكون من ماصة التعبئة.
  5. ارسم كمية من محلول تحميل الصبغة (~ 0.3 ميكرولتر) باستخدام حقنة ذات خيوط طويلة. هذا الحجم يتوافق مع حوالي 3 سم من الخيوط.
    ملاحظة: في البداية ، من الضروري عمل خيوط من طرف ماصة بحجم 10 ميكرولتر عن طريق سحب النار باستخدام مصباح كحول أو موقد غاز.
  6. أدخل طرف الشعيرة برفق مع محلول التحميل في ماصة التعبئة. حرر الخليط مباشرة على جذع العصب. احتضان التحضير في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  7. بعد ذلك ، اشطف المستحضر بمحلول Ringer الطازج واحتضنه عند 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 ساعة في كوب زجاجي مع محلول Ringer سعة 50 مل (أو أكثر) (يجب تغطية المستحضر بالمحلول). خلال هذا الوقت ، ستصل الصبغة إلى نقاط الاشتباك العصبي.

3. التقاط الفيديو باستخدام المجهر البؤري

ملاحظة: يتم تسجيل عابرات الكالسيوم باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر (LSCM) (انظر جدول المواد). ولتسجيل انتقالات الكالسيوم السريعة، استخدم بروتوكول أصلي يسمح بتسجيل الإشارات بدقة مكانية وزمنية كافية. وقد وصفت هذه الطريقة بدقة في المنشور الذي أصدره أرخيبوف وآخرون37. تم تجهيز المجهر بهدف غمر الماء 20x (1.00 NA). تم تخفيف خط الليزر 488 نانومتر إلى كثافة 10٪ وتم جمع تألق الانبعاثات من 503 إلى 558 نانومتر.

  1. قم بتركيب المستحضر في الغرفة التجريبية المطلية بالمطاط الصناعي السيليكوني وقم بإصلاحه ، ممتدا قليلا ، مع مجموعة من الإبر الدقيقة الفولاذية. شطف التحضير على نطاق واسع مع حل رينجر.
    ملاحظة: تم استخدام غرفة تجريبية بسيطة مخصصة للإرواء مصنوعة من الزجاج العضوي مع تغطية الجزء السفلي من الغرفة بمطاط صناعي (تم إعداده وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ؛ انظر جدول المواد). تحتوي الغرفة على أنبوب إمداد بالحل. يتم ضخ المحلول عبر إبرة حقنة ، مثبتة على حامل مغناطيسي (انظر جدول المواد). كغرفة تجريبية ، يمكن استخدام طبق بتري (مثل الطبق المستخدم لحضانة المستحضر) ولكن مع أنابيب الإمداد والشفط المرفقة.
  2. تثبيت قطب الشفط الذي سيتم استخدامه لتحفيز العصب.
    ملاحظة: يشبه بناء القطب الكهربائي ما تم نشره في ورقة 2015 بواسطة Kazakov et al49. ضع القطب الكهربائي وأصلحه عن طريق إزالة الشعر بالشمع بجانب الحمام. حرك الطرف بالقرب من جذع العصب وقم بشفطه في القطب الكهربائي.
  3. قم بتركيب غرفة التحضير على مسرح المجهر وضع تركيبات المدخل والمخرج في الغرفة.
  4. للاطلاع على التحضير ، استخدم نظاما بسيطا يحركه تدفق الجاذبية. قم بتشغيل مضخة شفط التروية لإزالة المحلول الزائد.
  5. قم بتوصيل قطب الشفط المحفز بمحفز كهربائي وتأكد من حدوث تقلصات عضلية بعد المحفزات. انظر القسم 3.9-3.12 للاطلاع على ظروف التحفيز والتسجيل.
  6. املأ نظام التروية بمحلول Ringer ب d-tubocurarine (10 μM).
    ملاحظة: يساعد هذا الحل على منع تقلصات العضلات. D-tubocurarine أو حاصرات ألفا بونغاروتوكسين الخاصة بمستقبلات أستيل كولين النيكوتينية على الغشاء ما بعد المشبكي من شأنها أن تمنع تقلصات العضلات كليا أو جزئيا50. أيضا ، لمنع الانقباضات العضلية ، يمكن استخدام حاصرات محددة من قنوات الصوديوم ما بعد المشبكي مثل μ-conotoxin GIIIB51.
  7. قم بتشغيل مضخة شفط التروية وابدأ تروية المستحضر باستخدام محلول Ringer الذي يحتوي على d-tubocurarine.
  8. قم بتعيين معلمات التصوير في برنامج LSCM على النحو التالي.
    1. في برنامج LSCM (التركيز البؤري التلقائي ل LAS؛ راجع جدول المواد)، اختر الفيزيولوجيا الكهربية.
      ملاحظة: في هذا الوضع، عندما يتم التقاط صورة في النقطة الزمنية، يتم إرسال نبضة متزامنة إلى المحفز بمساعدة مربع الزناد. هذا يثير توليد العمل المحتمل في التحضير (الشكل 1 ؛ وحدة المحفز).
    2. حدد وضع الاستحواذ. لتشغيل المحفز باستخدام نبضة مزامنة المجهر، في إعدادات قائمة المهمة، حدد إعدادات المشغل. اضبط الحقل Trigger Out On Frame على قناة out1.
    3. استخدم الإعدادات التالية: وضع المسح الضوئي: XYT, تكرار المسح الضوئي: 1400 هرتز, عامل التكبير/التصغير: 6.1, الثقب: مفتوح بالكامل. تأكد من تشغيل وضع X ثنائي الاتجاه المتسلسل عبر التمرير.
    4. قم بتعيين الحد الأدنى من الوقت لتشكيل إطار بسرعة 52 مللي ثانية والإطارات التي سيتم جمعها في فيديو خام بمعدل 20 إطارا.
      ملاحظة: تسمح هذه الإعدادات بالتقاط الصور بدقة 128 × 128 بكسل أثناء التقاط إطار واحد كل 52 مللي ثانية.
    5. اضبط الطول الموجي للإثارة لليزر الأرجون عند 488 نانومتر مع 8٪ من طاقة الإخراج.

figure-protocol-1
الشكل 1: مخطط الإعداد التجريبي. 1. المجهر البؤري المسح الضوئي بالليزر (LSCM). 2. وحدة المزامنة من LSCM (مربع الزناد). 3. محفز. 4. وحدة العزل. 5. العينة البيولوجية. 6. قطب شفط للتحفيز الكهربائي للأعصاب. 7. أنظمة التروية (7a: خزان perfusate ، 7b: قطارة ، 7c: منظم التدفق ، 7d: قارورة فراغ). تشير الأسهم إلى اتجاه انتشار نبض المزامنة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. اضغط على زر الوضع المباشر للتبديل إلى الوضع المباشر ، مما يساعد على الحصول على معاينة للأطراف العصبية المحملة بالصبغة.

figure-protocol-2
الشكل 2: عصب الماوس والمحطات الطرفية المحملة بمؤشر Ca2+ ، يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. وحدة التحفيز
    ملاحظة: في هذا العمل، استخدم المحفز الموصوف في مقالة Land et al.52 . يسمح هذا الجهاز بتعيين المعلمات الزمنية للتحفيز عبر برنامج MatLab.
    1. قم بإنشاء ملف جديد ، الصق التعليمة البرمجية من المقالة المذكورة أعلاه إلى نافذة التعليمات البرمجية MatLab ، واحفظ الملف. انقر فوق تشغيل ، لذلك تظهر نافذة بها معلمات التحفيز. تعيين وقت التأخير ومدة التحفيز.
      ملاحظة: يحدد التأخير الدقة الزمنية لإشارة الفلورسنت المعاد تشكيلها. يتم تأخير النبضة الكهربائية لمدة 0.2 مللي ثانية ، ثم يتم إرسالها إلى وحدة العزل. هذا الأخير يشكل سعة وقطبية النبضة المحفزة ويعزل الجسم البيولوجي كهربائيا عن معدات التسجيل.
    2. لتحفيز العصب ، حدد السعة فوق القصوى للنبض المحفز (25٪ -50٪ أكبر من الحد الأقصى لشدة التحفيز اللازمة لتنشيط جميع الألياف العصبية).
      ملاحظة: تعتمد الطريقة المقدمة على خوارزمية خاصة لتسجيل إشارات الفلورسنت السريعة المفردة باستخدام LSCM مع الاجتياح المصغر. في كل خطوة من خطوات الخوارزمية المطورة ، يتم نقل إشارة الفلورسنت المسجلة من سابقتها بفاصل زمني أقصر من اكتساح المجهر. تحدد قيمة التحولات الزمنية الدقة الزمنية للإشارة المطلوبة. يعتمد عدد الخطوات (التحولات) في الخوارزمية على الدقة الزمنية المطلوبة والدقة الزمنية الأصلية. باستخدام طريقة التسجيل هذه ، يتم تحفيز المستحضر بتردد 0.25 هرتز.
  2. في الوضع المباشر، ابحث عن عائد الاستثمار واحصل على أفضل تركيز. قم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات.
  3. قم بتحويل التأخير على المحفز بمقدار 2 مللي ثانية أقل بالنسبة للقيمة السابقة وقم بتشغيل برنامج الحصول على البيانات.
  4. كرر الخطوة 3.11 26 مرة للحصول على 26 تسلسلا، مع إزاحة كل تسلسل بمقدار 2 مللي ثانية عن سابقتها.

4. معالجة الفيديو

ملاحظة: يتم تصدير سلسلة من صور الفيديو التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر البؤري بتنسيق TIFF باستخدام البرنامج المجاني LAS X (انظر جدول المواد). تم تقسيم هذه السلسلة إلى إطارات وتصديرها إلى مجلد. لإنشاء تسلسل الصور بدقة زمنية أعلى ، تم استخدام برنامج ImageJ ، الذي يحتوي على رمز أولي مفتوح لتحليل البيانات ومعالجتها. يتم تمثيل خوارزمية معالجة الإشارات تخطيطيا في الشكل 3.

figure-protocol-3
الشكل 3: مخطط لتجميع ملف فيديو عالي الدقة (2 مللي ثانية على الإطار) من ملفات الفيديو الأصلية بدقة زمنية منخفضة (52 مللي ثانية على الإطار). يتم تلوين ملفات الفيديو الأصلية والإشارات المقابلة باللون الأسود والأرجواني والأخضر. ملف الفيديو المترجم والإشارة الناتجة ملونة باللون الأحمر. يظهر المخطط الموجود على اليمين ، سطرا بعد سطر ، صور الفيديو التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر متحد البؤرة. على اليسار ، تتغير إشارات التألق المقابلة من عائد الاستثمار المحدد. يتم تشكيل الخط العلوي إطارا تلو الآخر من الإطارات المستلمة وفقا للمخطط. والنتيجة هي صورة فيديو تتكون من مجموعة كاملة من الإطارات بحيث يكون هناك وقت تأخير يبلغ 2 مللي ثانية بين الإطارات بدلا من 52 مللي ثانية. يتوافق كل خط مع إزاحة إشارة التحفيز بواسطة (n - 1) * t ، حيث t هو التحول الزمني (2 مللي ثانية) ، و n هو عدد تكرارات التحول. يشير k إلى عدد الإطارات في ملفات الفيديو الأصلية (الأسطر 2-4) ويعتمد على مدة الإشارة المسجلة. في هذه الحالة ، لتسجيل إشارة مدتها 1 ثانية ، من الضروري تحديد k = 20 (52 مللي ثانية * 20 = 1040 مللي ثانية). t0 هو التأخير المطلوب قبل التحفيز. لحساب عدد تكرارات التحول n، يجب تقسيم الدقة الزمنية الأولية بين الإطارات (52 مللي ثانية) على الدقة الزمنية المطلوبة (2 مللي ثانية). في هذه الحالة ، n = 26 ، وهو ما يتوافق مع 26 عملية مسح مسجلة. نتيجة للتلاعبات التي تم إجراؤها ، يتم الحصول على صورة فيديو تتكون من n * k = 520 إطارا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بتشغيل برنامج LAS X. افتح المشروع الذي تم إنشاؤه أثناء إجراء التجربة. انقر فوق تصدير ، ثم على حفظ باسم لحفظ الإطارات بتنسيق .tiff في المجلد الوجهة.
  2. قم بتشغيل برنامج ImageJ. انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور.
  3. في نافذة فتح تسلسل الصور ، اختر المجلد الوجهة وافتح الإطار الأول.
  4. في نافذة خيارات التسلسل ، في حقل بدء الصورة، اضبط رقم الإطار على 1 للإطار الأول. في حقل الزيادة ، اضبط القيمة التي تساوي عدد الإطارات في تسجيل الإشارة الأولي (20 للحالة الحالية) وانقر فوق موافق.
  5. لحفظ الملف الذي تم إنشاؤه من الإطارات الأولى المخيطة في مجلد منفصل ، انقر فوق ملف > حفظ مجلد >.
  6. كرر الخطوات من 4.3 إلى 4.5 للإطارات ال 19 التالية. في نافذة خيارات التسلسل ، اضبط رقم الإطار المقابل في حقل صورة البدء .
  7. لإنشاء الفيديو الكامل عالي الدقة ، قم بخياطة جميع الإطارات معا. للقيام بذلك ، انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور وحدد 1 في حقلي صورة البدء والتزايد . ستكون النتيجة هي الفيديو النهائي بدقة زمنية متزايدة. احفظ الملف في .tiff أو أي تنسيق مناسب آخر.

5. تحليل الفيديو

ملاحظة: في ImageJ، حدد عائد الاستثمار والخلفية. طرح الخلفية من عائد الاستثمار. يتم تمثيل البيانات كنسبة ، (ΔF / F 0 - 1) * 100٪ ، حيث F0 هي شدة التألق في الراحة و ΔF هي شدة التألق أثناء التحفيز.

  1. انقر فوق الصور > مكدسات أدوات > > Stack Sorter. ثم انقر فوق أدوات > التحليل > ROI Manager.
  2. اسحب ملف .tiff المحفوظ في الخطوة 4.7 وأفلته في نافذة ImageJ. قم بتوسيع الصورة للحصول على عرض أفضل. لتحسين تصور الصورة ، انقر فوق الصورة > ضبط > السطوع / التباين > تلقائي. لن تؤثر هذه الخطوة على البيانات.
  3. اضبط الخلفية بالقرب من الطرف العصبي عن طريق رسم عائد الاستثمار. قم بإضافته إلى مدير عائد الاستثمار. احسب الخلفية بالنقر فوق المزيد من > Multi Measure. انسخ القيم المتوسطة، والصقها في برنامج جداول البيانات، واحسب المتوسط.
  4. اطرح متوسط القيمة المحسوبة من المكدسات بالنقر فوق عملية > الرئيسية > طرح. أدخل القيمة.
  5. ارسم عائد الاستثمار حول طرف عصبي عبر خط مضلع. قم بإضافته إلى مدير عائد الاستثمار.
  6. قياس شدة الطرف العصبي: انقر على مزيد من > متعدد القياسات. انسخ القيم المتوسطة والصقها في برنامج جداول البيانات.
  7. احسب متوسط إزاحة الإشارات.
    ملاحظة: استخدم النقاط المقابلة اعتمادا على وقت التأخير قبل التحفيز. تقوم هذه الخطوة بإنشاء قيمة F0 التي سيتم استخدامها في العمليات الحسابية اللاحقة.
  8. قسمة قيم الإشارة على متوسط قيمة الإزاحة.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة، لا تحتوي الإشارة على مساهمة الخلفية والتألق الخام في قيم السعة لعائد الاستثمار المحدد.
  9. اطرح 1 من القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.8، ثم اضرب في 100٪.
  10. ارسم رسما بيانيا ل Ca2 + - عابر واحسب السعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد تحميل المستحضر بالصبغة وفقا للتقنية المقدمة ، كان لمعظم نقاط الاشتباك العصبي الموجودة بالقرب من جذع العصب مستوى كاف من التألق (انظر الشكل 2). بعد تحميل التحضير بالصبغة وتطبيق الطريقة الموصوفة للتسجيل ومعالجة الصور ، تم الحصول على انتقالات الكالسيوم بالدقة المكانية والزمانية المطلوبة (انظر الشكل 4). تم استرداد الكالسيوم العابر بالطريقة المقترحة (انظر الشكل 3).

كما تم تحليل السعة ومعلمات الوقت للإشارات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتم تقديم طريقة تحميل صبغة حساسة Ca2 + في النهايات العصبية للفأر من خلال الجذع العصبي ولتسجيل عابر سريع للكالسيوم باستخدام المجهر البؤري في هذه المقالة. نتيجة لتنفيذ طريقة التحميل هذه ، كان لدى معظم نقاط الاشتباك العصبي الموجودة بالقرب من جذع العصب مستوى كاف من التألق لتمكين تسجيل دخول الكالسيوم إلى النهايات العصبية استجابة للتحفيز منخفض التردد للعصب الحركي.

على عكس البروتوكولات المقدمة سابقا لتحميل أصباغ الكالسيوم من خلال الجذع ، تم تصميم هذا البروتوكول للاستخدام على نقاط الاشتباك ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم إجراء دراسات التألق لهذا العمل بدعم مالي من منحة مؤسسة العلوم الروسية (المشروع رقم 19-15-00329). تم تطوير هذه الطريقة بتمويل من مهمة حكومية لمركز FRC قازان العلمي التابع ل RAS АААА-А18-118022790083-9. تم تطوير البحث باستخدام معدات مركز البحوث الفيدرالي "مركز قازان العلمي التابع ل RAS". يود المؤلفان أن يشكرا الدكتور فيكتور إيلين على قراءته النقدية لهذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

أدوات منتج 40 مم محلي محلي
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلارك الطبية الكهروحرارية الشعرية، المملكة المتحدةGC150-10
نظام المجهر متحد البؤر ومتعدد الفوتون Leica TCS SP5 MPLeica Microsystems ، هايدلبرغ ، ألمانيا
مشتعل / مجتذب ماصة دقيقة براون P 97أداة Sutter ، الولايات المتحدة الأمريكيةP-97
منظم التدفقKD Medical GmbH منتجات المستشفيات ، ألمانياKD REGمجموعة التسريب القابل للتصرف مع منظم التدفق
HEPESSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةH0887نظام إضاءة 100 مل
Leica CLS 150XLeica Microsystems ، ألمانيا
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكيةhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
برنامج Las AFLeica Microsystems ، هايدلبرغ ، ألمانيا
Las X softwareLeica Microsystems ، هايدلبرغ ، ألمانياhttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
حامل مغناطيسي مع أنابيب شفطBIOSCIENCE TOOLS ، USAMTH-S
Microspin FV 2400Biosan ، لاتفياBS-010201-AAA
Minutien Pinsأدوات العلوم الدقيقة ، كندا26002-20
متعدد الدوران MSC 3000Biosan ، لاتفياBS-010205-AAN
أوريغون جرين 488 BAPTA-1 ملح خماسي البوتاسيومالمجسات الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكيةO6806500 & mu ؛ g
PipetteBiohit ، روسيا7202100.5-10 & micro ؛ L
طرف الماصةBiohit ، روسيا78134910 & micro ؛ L
محليللبلاستيسين
إبر تحت الجلد للاستخدام مرة واحدةBbraun100 Sterican0.4 & مرات ؛
برنامج جداول بياناتمايكروسوفت ، الولايات المتحدة الأمريكيةمايكروسوفت أوفيس إكسل
مجهر مجسم ، لايكا M80لايكا مايكروسيستمز ، ألمانيا
قطب شفطكازاكوف أ. قطب شفط بسيط للتحفيز الكهربائي للأجسام البيولوجية / أ. كازاكوف ، م. ألكسندروف ، إن في زيلياكوف وآخرون // مجلة الأبحاث الدولية. - 2015. - رقم 9 (40) الجزء 3. - ص. 13-16.http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
سيلجارد 184 مطاط مطاطيداو كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية
حقنةمنتج0.5 مل
حقنةمنتج60 مل

المراجع

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225(2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201(2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250(2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302(2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29(2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122(2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124(2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482(2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621(2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031(2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إشارات الكالسيومكالسيوم قبل التشابكيالنقل التشابكيتقنية تحميل الصبغةنهايات العصب الحركيتحرر الناقل العصبي
تسجيل انتقالات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية للفأر بدقة زمنية عالية باستخدام المجهر البؤري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.