يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63316

⸱

يناير 20, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratório de Ciências e Tecnologias Aplicadas em Saúde (LaCTAS), Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 2Pós-graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 3Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, Instituto Carlos Chagas (ICC), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz)

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا العمل خطوات إنتاج qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي T. cruzi الذي يمكن تحميله مسبقا على وعاء التفاعل وتخزينه في الثلاجة لعدة أشهر.

الملخص

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) تقنية حساسة ودقيقة بشكل ملحوظ تسمح بتضخيم كميات دقيقة من أهداف الحمض النووي من العديد من العينات. وقد تم استخدامه على نطاق واسع في العديد من مجالات البحث وحقق التطبيق الصناعي في مجالات مثل التشخيص البشري واختيار السمات في محاصيل الكائنات المعدلة وراثيا (GMO). ومع ذلك ، فإن qPCR ليست تقنية مقاومة للخطأ. قد يؤدي خلط جميع الكواشف في مزيج رئيسي واحد يتم توزيعه لاحقا على 96 بئرا من لوحة qPCR العادية إلى أخطاء المشغل مثل الخلط غير الصحيح للكواشف أو التوزيع غير الدقيق في الآبار. هنا ، يتم تقديم تقنية تسمى الهلام ، حيث يتم استبدال معظم الماء الموجود في المزيج الرئيسي بالكواشف التي تشكل خليط سول جل عند تقديمه إلى فراغ. نتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كواشف qPCR بشكل فعال لبضعة أسابيع في درجة حرارة الغرفة أو بضعة أشهر عند 2-8 درجةمئوية. يتم عرض تفاصيل تحضير كل محلول هنا جنبا إلى جنب مع الجانب المتوقع من تفاعل هلامي مصمم للكشف عن الحمض النووي للأقمار الصناعية T. cruzi (satDNA). يمكن تطبيق إجراء مماثل للكشف عن الكائنات الحية الأخرى. يعد بدء تشغيل qPCR الهلامي أمرا بسيطا مثل إزالة اللوحة من الثلاجة ، وإضافة العينات إلى الآبار الخاصة بها ، وبدء التشغيل ، وبالتالي تقليل وقت إعداد تفاعل اللوحة الكاملة إلى الوقت المستغرق لتحميل العينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج تفاعلات PCR الهلامية والتحكم فيها من أجل الجودة على دفعات ، مما يوفر الوقت وتجنب أخطاء المشغل الشائعة أثناء تشغيل تفاعلات PCR الروتينية.

المقدمة

تم اكتشاف مرض شاغاس فيأوائل القرن العشرين في المناطق الريفية في البرازيل ، حيث كان الفقر منتشرا على نطاق واسع 1,2. وحتى اليوم، لا يزال المرض مرتبطا بالمحددات الاجتماعية والاقتصادية للصحة في الأمريكتين. مرض شاغاس ثنائي الطور ، ويتألف من مرحلة حادة ومزمنة. وهو ناتج عن العدوى بطفيلي المثقبية الكروزية ، الذي ينتقل عن طريق ناقلات الحشرات ، أو نقل الدم عبر الطريق الخلقي ، أو الابتلاع الفموي للأغذية الملوثة 3,4.

يمكن إجراء تشخيص مرض شاغاس من خلال ملاحظة الأعراض السريرية (خاصة علامة رومانا) ، والفحص المجهري لطاخة الدم ، والأمصال ، والاختبارات الجزيئية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR) أو التضخيم متساوي الحرارة4،5،6،7،8،9. تستخدم الأعراض السريرية والفحص المجهري لطاخة الدم في الحالات المشتبه في إصابتها بالعدوى الحادة ، بينما يستخدم البحث عن الأجسام المضادة كأداة فحص في المرضى الذين لا تظهر عليهم أعراض. نظرا لحساسيته وخصوصيته ، فقد تم اقتراح استخدام qPCR كأداة مراقبة للمرضى المزمنين ، للمرضى الحادين الذين يخضعون للعلاج لقياس حمل الطفيلي في الدم ، وكعلامة بديلة للفشل العلاجي6،8،10،11،12 . على الرغم من أنه أكثر حساسية وتحديدا من الاختبارات المتاحة حاليا ، إلا أن qPCR يمنع بشكل فعال من أن يعرف كأدوات تشخيصية في المناطق المحرومة في جميع أنحاء العالم بسبب متطلبات درجات الحرارة المتجمدة للنقل والتخزين13،14،15.

للتحايل على هذه العقبة ، تم استكشاف تقنيات الحفظ مثل التجفيد والهلام16,17. في حين أن التجفيد يوفر الحفظ لسنوات ، فإنه يتطلب كواشف مصنوعة خصيصا دون وجود الجلسرين ، والذي يستخدم عادة لتثبيت / حفظ الإنزيم18. بينما ثبت أن الهلام يوفر الحفظ لعدة أشهر ، فإنه يسمح باستخدام الكواشف العادية19. يتكون محلول الهلام من أربعة مكونات ، لكل منها أدوار محددة في العملية: السكريات trehalose و melezitose تحمي الجزيئات الحيوية أثناء عملية التجفيف عن طريق تقليل جزيئات الماء الحرة في المحلول ، ينتج الجليكوجين مصفوفة واقية أوسع ، ويستخدم ليسين الأحماض الأمينية ككاسح للجذور الحرة لمنع التفاعلات المؤكسدة بين كربوكسيل الجزيء الحيوي ، المجموعات الأمينية والفوسفات. تحدد هذه المكونات خليط سول جل يمنع فقدان البنية الثلاثية أو الرباعية أثناء عملية التجفيف ، مما يساعد على الحفاظ على نشاط الجزيئات الحيوية عند الإماهة19. بمجرد الاستقرار داخل أنابيب التفاعل ، يمكن تخزين التفاعلات لبضعة أشهر عند 2-8 درجة مئوية أو بضعة أسابيع عند 21-23 درجة مئوية بدلا من -20 درجة مئوية العادية. تم بالفعل دمج هذا النهج في الاختبارات المصممة للمساعدة في تشخيص أمراض مثل مرض شاغاس والملاريا وداء الليشمانيات والسل وداء السيكلوسبوريا13،14،15،20.

يصف هذا العمل جميع الخطوات لإعداد الحلول المطلوبة لإجراء الهلام ، والمزالق في العملية ، والجانب النهائي المتوقع من qPCR الهلامي الجاهز للاستخدام داخل شرائط ثمانية أنابيب. يمكن تكييف نفس البروتوكول مع الأنابيب المفردة أو ألواح 96 بئرا. أخيرا ، سيتم عرض اكتشاف الحمض النووي T. cruzi كتشغيل تحكم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير محاليل المخزون وخليط الهلام

ملاحظة: سيتم تحضير أربعة محاليل مخزون (400 ملغم/مل من ميليزيتوز، 400 ملغم/مل من تريهالوز، 0.75 ملغم/مل من اللايسين، و200 ملغم/مل من الجليكوجين) وخلطها وفقا للنسبة المبينة في الجدول 1 لإنتاج خليط الهلام. على الرغم من أن البروتوكول يصف 10 مل من إنتاج حلول المخزون ، إلا أنه يمكن تكييفه لأحجام أقل أو أعلى.

  1. حل ميليزيتوز
    1. قم بوزن 4 جم من melezitose في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
      ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه).
    2. اصنع الحجم النهائي إلى 10 مل بالماء الخالي من النيوكلياز. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. حل تريهالوز
    1. قم بوزن 4 جم من التريهالوز في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
      ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه).
    2. قم بتكوين الحجم إلى 10 مل بماء خال من النيوكلياز وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. محلول الجليكوجين
    1. قم بوزن 2 جم من الجليكوجين في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، وأضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز ، ودوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يذوب المسحوق.
      ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه).
    2. حافظ على المحلول في حالة راحة عند 2-8 درجة مئوية لمدة 8-12 ساعة لأن إذابة الجليكوجين تنتج الكثير من الفقاعات (الشكل 1). اصنع الحجم إلى 10 مل بالماء الخالي من النيوكلياز. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. حل ليسين
    1. تزن 7.5 ملغ من ليسين في أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل ، أضف 6 مل من الماء الخالي من النيوكلياز. دوامة بأقصى سرعة للأداة حتى يتم إذابة المسحوق.
      ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الماء لتسهيل الذوبان ، مع الحرص على عدم تجاوز الحجم النهائي (انظر أدناه).
    2. قم بتكوين الحجم إلى 10 مل بماء خال من النيوكلياز وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. انقل المحلول إلى قارورة كهرمانية أو قم بحمايته من الضوء. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  5. خليط الهلام (GM)
    1. في أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل ، امزج أحجام محاليل المخزون وفقا للجدول 1.
    2. امزج الكواشف بعشرة انعكاسات من طرف إلى طرف للأنبوب.
      ملاحظة: ليست هناك حاجة لخطوة ترشيح إذا تم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء أمان التدفق الرقائقي. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة في بيئة نظيفة ، فقم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر قبل نقله إلى قارورة كهرمانية.
    3. انقل المحلول إلى قارورة كهرمانية أو قم بحمايته من الضوء. يلصق ويخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      ملاحظة: كخطوة لمراقبة الجودة لإعداد خليط الهلام ، تأكد من أن قيم الأس الهيدروجيني والتوصيل والكثافة المقاسة ضمن النطاقات التالية: الرقم الهيدروجيني 5.55-6.66 ؛ الموصلية 0.630-0.757 مللي ثانية / سم ؛ والكثافة 1.08-1.11 جم / سم3. يجب أن تؤخذ جميع القياسات عند 25 درجة مئوية.

2. تحضير مزيج qPCR الرئيسي للهلام

ملاحظة: في هذه الخطوة ، يتم تحضير مزيج qPCR الرئيسي للهلام. وبالتالي ، لا يضاف الماء إلى المزيج ولكن بدلا من ذلك ، يضاف خليط الهلام (الجدول 2).

  1. قم بإذابة الكواشف في حاوية مبردة. امزج الكواشف في أنبوب سعة 1.5 مل وفقا للجدول 2. يوضح هنا مثال على تفاعل حجمه النهائي 25 μL يحتوي على 5 μL من عينة الحمض النووي (DNA).
    ملاحظة: لا تضاف عينة الحمض النووي إلى الخليط في هذه الخطوة. يتم استخدامه هنا فقط لحساب الأحجام النهائية لكل كاشف من مزيج qPCR الرئيسي. يجب إضافة عينات الحمض النووي مباشرة قبل بدء التشغيل (انظر الخطوة 4 أدناه).

3. هلام الكواشف على أوعية التفاعل

  1. اضرب بشكل مناسب الأحجام الموضحة في الجدول 2 لإعداد شريط من ثمانية أنابيب أو لوحة 96 بئر.
  2. ماصة 18.5 ميكرولتر من مزيج الهلام الرئيسي الموضح في الجدول 2 على كل بئر تفاعل.
    ملاحظة: يمثل هذا الحجم أحجام مزيج قليل النوكليوتيد ، ومخزن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وخليط الهلام المستخدم في تفاعل واحد (وفقا للجدول 2) وسيختلف اعتمادا على تركيز الكواشف والحجم اللازم لتفاعل واحد. يختلف الحجم النهائي في المزيج الرئيسي للهلام عن الحجم الموجود في المزيج الرئيسي العادي لأنه لا يتم إضافة الماء.
  3. ضع الأنابيب / اللوحة في الدعامة الموصلة للحرارة (مثل الألومنيوم) داخل فرن التفريغ.
    ملاحظة: الدعم الموصل للحرارة اختياري. يجب على المشغل التأكد من أن الجزء السفلي من الأنابيب ملامس لرف الفرن المفرغ للسماح بالتوازن الحراري السريع.
  4. ضع كيسا واحدا من طين البنتونيت لكل طبقين من 96 بئرا.
    ملاحظة: تستخدم أكياس طين البنتونيت لامتصاص الماء الذي تمت إزالته من مزيج الهلام الرئيسي عن طريق الضغط التفاضلي الذي يمارسه الفراغ. تم العثور على أكياس الطين البنتونيت لتكون غير ضرورية لأقل من اثنين من لوحات 96 بئر.
  5. إخضاع الأنابيب / اللوحة التي تحتوي على مزيج الهلام الرئيسي لثلاث دورات مفرغة (30 ± 5 مللي بار) مدة كل منها 30 دقيقة ، بالتناوب مع إطلاق الفراغ حتى يتم تحقيق الضغط الجوي (900-930 مللي بار) ، تحت درجة حرارة مضبوطة (30 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية) (الشكل 2).
    ملاحظة: تستخدم الأداة برنامجا للتحكم في المعلمات ، ويظهر مثال للدورة في الشكل 2. يجب على المستخدم إنشاء ملف تعريف للتشغيل ، مع الإشارة إلى المعلمات المختارة.
  6. عند اكتمال الدورة ، تحقق من الأنابيب / الألواح بحثا عن الهلام المناسب للكواشف من خلال التأكد من تقليل الحجم بشكل واضح (الشكل 3) وأن السوائل لا تتحرك عند النقر على الأنابيب / الألواح بالأصابع.
    ملاحظة: إذا لم يحدث الهلام ، فسوف يتناثر المحلول على جدران الأنبوب عند النقر على الأنابيب (الشكل 3).
  7. أغلق وخزن الأنابيب / الألواح في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة 8-12 ساعة قبل الاستخدام.

4. استخدام qPCR هلامي

  1. أخرج شريط الأنبوب أو اللوحة من الثلاجة وافتحه في محطة عمل لمعالجة العينات. أضف 15 μL من الماء الخالي من النيوكلياز إلى كل وعاء تفاعل.
    ملاحظة: يعتبر حجم الكواشف الهلامية حوالي 5 ميكرولتر. إذن، مع حجم عينة الحمض النووي (انظر أدناه)، حجم التفاعل النهائي هو 25 ميكرولتر.
  2. أضف 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي قالب DNA بجودة qPCR. في العمل الحالي ، تم استخراج الحمض النووي من 108T. cruzi epimastigotes (سلالة Dm28c) وتم تخفيفه بشكل متسلسل بنسبة 1:10 باستخدام محلول TE.
  3. أغلق الأنابيب / الألواح وانتقل إلى المعدات التي تختارها. قم بتشغيل التجربة وانتقل إلى تحليل البيانات المنتظم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ثلاثة من الكواشف التي تشكل خليط الهلام يمكن إذابتها بسهولة عند الدوامة القوية. ومع ذلك ، يتطلب الجليكوجين دوامة دقيقة لضمان ذوبان المسحوق تماما. لسوء الحظ ، تنتج الدوامة القوية الكثير من الفقاعات ، مما يجعل من الصعب تحديد الحجم الفعلي للمحلول (الشكل 1A-B). لذلك ، من الضروري ترك محلول الجليكوجين في الثلاجة حتى ينتقل معظم المحلول المحبوس داخل الفقاعات إلى جسم المحلول الرئيسي. بالنظر إلى بروتوكولات الإنتاج وروتين المختبر ، يتم الاحتفاظ بالأطباق الهلامية في الثل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد أبرزت السنوات الأخيرة الحاجة إلى إيجاد تكنولوجيات أكثر حساسية وتحديدا للمساعدة في تشخيص الأمراض المدارية والمهملة. على الرغم من أهمية الاختبارات الطفيلية (المجهر الضوئي) والاختبارات المصلية للمكافحة الوبائية ، إلا أن لها قيودا ، خاصة فيما يتعلق بالحساسية وقابلية التطبيق في نقطة الرعاية. لطالما استخدمت تقنيات تضخيم الحمض النووي مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل والتضخيم متساوي الحرارة والاختلافات ذات الصلة في البيئات المختبرية ، لكن العقبات التكنولوجية تحول دون استخدامها في البيئات الميدانية. واحدة من العقبات الرئيسية هي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يعربوا عن امتنانهم لألين بوردا فارياس للمساعدة التقنية في فرن التفريغ ، وكذلك للإدارة في معهد البيولوجيا الجزيئية في بارانا (IBMP ، كوريتيبا ، البرازيل) للسماح بالوصول إلى المعدات المذكورة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منحة CNPq 445954 / 2020-5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكياس الطين البنتونيت (منشطة)Embamat Global Packaging Solutions (برشلونة ، إسبانيا)026157 / STDلا ينبغي الخلط بينه وبين عبوات هلام السيليكا
GlycogenAmersham BioscienceCat # US16445
LysineAcros OrganicCat # 365650250
MelezitozeSigma-AldrichCat # 63620
ماءخال من النوكليازالبائع
Oligonucleotidesالبائع
PCR mastermixالبائع المفضل أو Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP ، كوريتيبا ، البرازيل)Chagas NAT kit
PCR thermocyclerالبائع
المفضل لفرن التفريغMemmert GmbhCelsius v10.0
TrehaloseSigma-AldrichCat # T9531
Trypanosoma cruziDNA من الطفيليات المزروعة في المنزل ، أو تم شراؤها من البائعين المعتمدين مثل ATCC
Vacuum ovenMemmert جي إم بي إتشVO-400
المفضلالمفضل برنامج

المراجع

  1. Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
  2. Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
  3. Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
  4. Tanowitz, H. B., et al. Chagas' disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
  5. Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
  6. Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
  7. Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
  8. Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
  9. Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402(2020).
  10. Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
  11. Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154(2015).
  12. Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191(2019).
  13. de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
  14. Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
  15. Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111(2021).
  16. Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
  17. Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158(2014).
  18. Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
  19. Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
  20. Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).
  21. Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
  22. Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
  23. Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المجلّتالكشف عن Trypanosoma cruziتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقيتضخيم الحمض النوويالكشف عن الممرضاتالمزيج الرئيسي لتفاعل qPCRبروتوكول التجلطالكشف عن الحمض النوويالتشخيص الجزيئي
qPCR جاهز للاستخدام للكشف عن الحمض النووي من المثقبية الكروزية أو الكائنات المسببة للأمراض الأخرى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.