يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخراج وتنقية بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والكلى والفئران

5.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63333

⸱

فبراير 18, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Biomedical Aging Research, University of Innsbruck

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية استخراج البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetate من كبد الخنازير والفئران. يمكن تكييف الطرق المذكورة مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية وتعديلها للأنسجة الأخرى.

الملخص

فوماريلاسيتواتواتات هيدرولاز يحتوي على البروتين 1 (FAHD1) هو أول عضو محدد في عائلة FAH الفائقة في حقيقيات النوى ، حيث يعمل كأوكسالواسيتات ديكاربوكسيلاز في الميتوكوندريا. تقدم هذه المقالة سلسلة من الطرق لاستخراج وتنقية FAHD1 من كبد الخنازير والفئران. الطرق المغطاة هي كروماتوغرافيا التبادل الأيوني مع كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) ، وترشيح هلام تحضيري وتحليلي مع FPLC ، ونهج بروتينية. بعد استخراج البروتين الكلي ، تم استكشاف هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وتم استخراج FAHD1 عبر استراتيجية متسلسلة باستخدام التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يمكن تكييف هذا النهج التمثيلي مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية (التي يتم التعبير عنها بمستويات كبيرة) وتعديلها للأنسجة الأخرى. قد يدعم البروتين النقي من الأنسجة تطوير أجسام مضادة عالية الجودة ، و / أو مثبطات دوائية قوية ومحددة.

المقدمة

يعمل البروتين 1 (FAHD1) المحتوي على مجال FAH حقيقيات النواة كثنائي الوظيفة من أوكسالواسيتات (OAA) ديكاربوكسيلاز (ODx)1 وهيدرولاز أسيلبيروفات (ApH)2. وهي مترجمة في الميتوكوندريا 2 وتنتمي إلى عائلة FAH الفائقة الواسعة من الإنزيمات1،2،3،4،5،6. في حين أن نشاط ApH الخاص به ليس له أهمية تذكر فقط ، فإن نشاط ODx الخاص ب FAHD1 يشارك في تنظيم تدفق دورة TCA1،7،8،9. OAA ليس مطلوبا فقط لتفاعل سينثاز السترات المركزي في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل ولكنه يعمل أيضا كمثبط تنافسي لنازعة هيدروجيناز السكسينات كجزء من نظام نقل الإلكترون وكمستقلب كاتابليروتي. أدى انخفاض تنظيم التعبير الجيني FAHD1 في الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVEC) إلى انخفاض كبير في معدل تكاثر الخلايا10 ، وتثبيط كبير لإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، المرتبط بالتحول المصاحب إلى تحلل السكر. يشير نموذج العمل إلى خلل الميتوكوندريا المرتبط بالشيخوخة (MiDAS) 11 الشبيه بالنمط الظاهري 8 ، حيث يتم تنظيم مستويات OAA الميتوكوندريا بإحكام بواسطة نشاط FAHD1 1,8,9.

من الأسهل الحصول على البروتين المؤتلف عن طريق التعبير والتنقية من البكتيريا12 بدلا من الأنسجة. ومع ذلك ، قد يكون البروتين المعبر عنه في البكتيريا متحيزا بسبب احتمال عدم وجود تعديلات ما بعد الترجمة ، أو قد يكون ببساطة مشكلة (أي بسبب فقدان البلازميد ، واستجابات الإجهاد البكتيري ، وروابط ثاني كبريتيد المشوهة / غير المشوهة ، وعدم وجود إفراز أو سوء إفراز ، وتجميع البروتين ، والانقسام البروتيني ، وما إلى ذلك). بالنسبة لبعض التطبيقات ، يجب الحصول على البروتين من تحلل الخلايا أو الأنسجة ، من أجل تضمين مثل هذه التعديلات و / أو استبعاد القطع الأثرية المحتملة. يدعم البروتين النقي من الأنسجة تطوير أجسام مضادة عالية الجودة ، و / أو مثبطات دوائية قوية ومحددة لإنزيمات مختارة ، مثل FAHD113.

تقدم هذه المخطوطة سلسلة من الطرق لاستخراج وتنقية FAHD1 من كبد الخنازير والفئران. تتطلب الطرق الموصوفة كروماتوغرافيا سائلة سريعة البروتين (FPLC) ولكنها تستخدم معدات مختبرية شائعة. يمكن العثور على طرق بديلة في أماكن أخرى14،15،16،17. بعد الاستخراج الكلي للبروتين ، يتضمن البروتوكول المقترح مرحلة اختبار ، حيث تتم مناقشة البروتوكولات الفرعية لهطول الأمطار بكبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (الشكل 1). بعد تحديد هذه البروتوكولات الفرعية ، يتم استخراج البروتين محل الاهتمام عبر استراتيجية متسلسلة باستخدام التبادل الأيوني وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع FPLC. وبناء على هذه المبادئ التوجيهية، يمكن تكييف البروتوكول النهائي بشكل فردي مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية.

سير عمل معالجة الأنسجة: الطرد المركزي ، هطول الأمطار ، الكروماتوغرافيا. تحليل اللطخة الغربية.
الشكل 1: الاستراتيجية العامة لهذا البروتوكول. من أعلى إلى أسفل: يتم استخراج البروتين من الأنسجة. يتم إعداد تجانس الأنسجة وطردها مركزيا وترشيحها. لكل زوج من العينات الفائقة والمستمدة من الكريات ، يجب إجراء اختبارات لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني (FPLC) للتحقيق في الظروف المثلى. بعد إنشاء هذه البروتوكولات الفرعية ، يمكن استخراج البروتين عن طريق إجراء متسلسل لهطول الأمطار بكبريتات الأمونيوم ، وكروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم المتكرر (FPLC) عند تركيزات متفاوتة من الأس الهيدروجيني والملح. يجب التحكم في جميع الخطوات بواسطة اللطخة الغربية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تم الحصول على كلية الخنازير طازجة من السوبر ماركت المحلي. تم حصاد أنسجة الكبد من الفئران من النوع البري C57BL6 التي تم الاحتفاظ بها في معهد أبحاث الشيخوخة الطبية الحيوية في جامعة إنسبروك ، Rennweg 10 ، 6020 Innsbruck ، النمسا تحت إشراف Uniiv.-Doz. الدكتور بيدر يانسن دور، مشمول بإذن أخلاقي كقائد للمشروع صدر في عام 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). يتم تغطية صيانة واستخدام الفئران للمشروع بموجب الإذن الأخلاقي رقم 2020-0.242.978 من 5 مايو 2020 ، الصادر عن وزارة التعليم والعلوم والبحوث النمساوية (BMBWF).

1. التحضيرات

ملاحظة: قبل بدء البروتوكول ، يجب إعداد العديد من الأشياء ، أي المخزن المؤقت لتحلل البروتين ، وعينة الأنسجة الخام ، وجسم مضاد محدد ، إلى جانب المواد الكيميائية والمواد العامة.

  1. تحضير 250 مل من المخزن المؤقت لتحلل البروتين لكل 100 غرام من الوزن الصافي للأنسجة: 250 مل من 1x PBS مع 50 mM NaF ، و 1 mM PMSF ، و 2 ميكروغرام / مل من الأبروتينين ، و 1 mM orthovanadate المنشط (انظر الجدول 1). قم بتصفية الحل باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: مطلوب تنشيط orthovanadate قبل الاستخدام لتحويله إلى مثبط أكثر فعالية من بروتين التيروزين فوسفاتيز18. يمكن الحصول على تقويم العظام المنشط من الموردين التجاريين ، ولكن أيضا إعداده على النحو التالي.
    1. قم بإعداد محلول مخزون 200 mM من (الصوديوم) orthovanadate في ddH2O. لإعداد 10 مل من المحلول ، أضف 368 ملغ من Na3VO4 إلى 9 مل من الماء وتذوب عن طريق التحريك. بمجرد إذابتها ، قم بتكوين الحجم إلى 10 مل باستخدام ddH2O.
      ملاحظة: قد يختلف الرقم الهيدروجيني الأولي لمحلول أورثوفانادات الصوديوم باختلاف مصدر المادة، ويجب تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 10 في نهج متكرر على النحو التالي.
    2. اعتمادا على الرقم الهيدروجيني الأولي للمحلول ، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10 باستخدام NaOH أو HCl. عند درجة الحموضة > 10 ، سيكون للمحلول لون أصفر. قم بغلي المحلول حتى يصبح عديم اللون ، وقم بتبريده إلى درجة حرارة الغرفة ، وتحقق من درجة الحموضة. إذا كان الرقم الهيدروجيني >10 ، أضف كمية صغيرة من HCl لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10. في هذه المرحلة ، قد يتحول الحل إلى اللون الأصفر مرة أخرى.
    3. كرر الغليان والتبريد حتى يظل المحلول عديم اللون ويستقر الرقم الهيدروجيني عند 10 (حوالي 5-7 مرات). عند هذه النقطة ، تؤدي إضافة HCl إلى ظهور باهت للون الأصفر في المحلول. تخزين orthovanadate المنشط في 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية.
  2. تحضير أنابيب مع 2 مل من المحلل التحلل لكل غرام من الأنسجة ووضعها على الجليد.
    ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول ثمانية أنابيب سعة 50 مل، كل منها مملوء ب 30 مل من المخزن المؤقت للتحلل في المجموع لكلية خنازير واحدة (حوالي 100-150 جم)، وأنبوبين مملوء كل منهما ب 40 مل من المخزن المؤقت للتحلل ل 20 كبد فأر (كل منهما 1-2 جم) في المجموع.
  3. تحضير الأنسجة: تشريح الأنسجة على لوحة زجاجية نظيفة مسبقا موضوعة على الجليد في صندوق رغوة البوليسترين. قطع قطع الأنسجة من حوالي 100 ملغ لكل منها ليتم نقلها بسهولة إلى الأنابيب المعنية للتحلل اللاحق. انقل قطع الأنسجة إلى الأنابيب المحضرة (الخطوة 1.2).
  4. تحضير محلول كبريتات الأمونيوم المشبعة: تسخين 500 مل من ddH2O إلى 70 درجة مئوية وأثناء التحريك ، أضف تدريجيا مسحوق كبريتات الأمونيوم (انظر جدول المواد) حتى لا يتم إذابة المزيد من كبريتات الأمونيوم. قم بتبريد هذا المحلول المشبع (الزائد) إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.

2. استخراج البروتين الكلي

ملاحظة بعد تحضير العينة في مخزن مؤقت لتحلل البروتين البارد (انظر الخطوة 1.3) ، قم بتجانس الأنسجة بأفضل شكل ممكن عن طريق الصوتنة بواسطة مسبار بالموجات فوق الصوتية ، أو باستخدام مجانس كهربائي على النحو التالي.

  1. تجانس الأنسجة
    1. في حالة الكلى الخنازير ، يفضل أن يكون التعليق عن طريق مسبار بالموجات فوق الصوتية مع الحفاظ على العينة على الجليد (10 دورات من نبض 15 ثانية ، مع فترات من 30 ثانية بين النبضات لتبريد العينة على الجليد ، بسعة متوسطة مع دورة عمل 50٪).
    2. في حالة أعضاء الفأر ، قم بتجانس التعليق باستخدام مجانس كهربائي (يبدأ بقوة منخفضة ، ويتسارع ببطء إلى قوة متوسطة) مع الحفاظ على العينة على الجليد. اغسل المجانس الكهربائي بانتظام في PBS لإزالة أي مادة عضوية تسد الجهاز.
    3. خذ 20 ميكرولتر من العينات وتحقق تحت المجهر مما إذا كانت خلايا الأنسجة المتجانسة قد دمرت بشكل صحيح ؛ خلاف ذلك ، كرر التجانس.
  2. جهاز الطرد المركزي للأنابيب في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 10000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: اختياريا، قم بطرد مركزي للغاز الخارق مرة ثانية بسرعة 20000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية للتخلص من الأجزاء الصغيرة من الكريات الأولية التي ربما تم نقلها. سيؤدي ذلك إلى تبسيط الترشيح اللاحق في الخطوة 2.3.
  3. جمع supernatant في أنبوب جديد ووضعه على الجليد. قم بتصفية supernatant بالتتابع باستخدام وحدات مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر. Aliquot supernatant في دفعات 10 مل وتجميدها عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير أو عند -80 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول.
    ملاحظة: يزيل الترشيح المسبق باستخدام 0.45 ميكرومتر غالبية الجسيمات قبل أن تزيل خطوة الترشيح الثانية ب 0.22 ميكرومتر الجسيمات الدقيقة. يمكن أن يؤدي استخدام مرشح 0.22 ميكرومتر مباشرة إلى خطر انسداد المرشحات.
  4. قم بإعداد عينة 50 ميكرولتر لتحليل اللطخة SDS-PAGE/Western عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS 5x (انظر الجدول 1) إلى 40 ميكرولتر من supernatant ، ثم الغليان عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    1. اختياريا، أعد تعليق حوالي 100 ميكرولتر من الكريات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2 في 900 ميكرولتر من ddH2O، وقم بإعداد عينة لتحليل البقع الغربية SDS-PAGE/Western كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: إن إدراج العينات المشتقة من الكريات في تحليل اللطخة الغربية ، بالإضافة إلى التحكم الإيجابي ، سيشير إلى ما إذا كان التعبير عن البروتين منخفضا ، أو أن الجسم المضاد يمثل مشكلة.

3. SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية

ملاحظة: يلزم تحليل اللطخة الغربية للتحقق من قابلية ذوبان البروتين. فيما يلي وصف لبروتوكول النشاف الكهربائي ، باستخدام نظام النشاف الرطب / الخزان (انظر جدول المواد). ويمكن العثور على بروتوكول بديل ل SDS-PAGE في مكان آخر19.

  1. قم بإعداد هلام متقطع 12.5٪ من البولي أكريلاميد SDS-PAGE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (أي هلام التراص فوق هلام الحل ؛ انظر الجدول 1). قم بتشغيل العينات التي تم إعدادها مسبقا خلال الخطوة 2 (على غرار الخطوات 4 و5 و6؛ راجع أدناه).
    1. قم بتحميل سلم علامة البروتين في البئر الأول (انظر جدول المواد). تحميل 5 نانوغرام من البروتين المؤتلف hFAHD1 (الذي تم الحصول عليه من البكتيريا12 ؛ انظر الجدول 1) كعنصر تحكم إيجابي في البئر الثاني.
    2. بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولتر من العينة المراد تحليلها ، واملأ جميع الآبار المتبقية ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE 1x المحضر (أي مخزن مؤقت للعينة 5x مخفف ب ddH2O). قم بتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE على 125 فولت باستخدام المخزن المؤقت الذي يعمل بنظام SDS (انظر الجدول 1).
  2. بعد اكتمال SDS-PAGE ، قم بإجراء تحليل لطخة غربية وفحص الأغشية باستخدام الجسم المضاد المتاح المرفوع ضد FAHD1 (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: نظرا لأن العينات مأخوذة من تجانس الأنسجة الخام، عادة ما تتعرض جودة SDS-PAGE وتحليل اللطخة الغربية في هذه المرحلة للخطر؛ ومع ذلك ، من المهم التحقق مما إذا كان البروتين المراد استخراجه قابلا للذوبان في supernatant. تم اختبار البروتوكول التالي لكليتي الخنازير ، وأعضاء الفئران المختلفة ، بما في ذلك الكبد والقلب والدماغ والكلى.
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت لنقل اللطخة الغربية 10x (انظر الجدول 1). قم بإعداد المخزن المؤقت لنقل اللطخة الغربية 1x (انظر الجدول 1) وقم بتبريده إلى 4 درجات مئوية.
    2. تنشيط غشاء PVDF لمدة 2 دقيقة في الميثانول. اغسل الغشاء في ddH2O لمدة دقيقتين. قم بموازنة الغشاء لمدة 15 دقيقة في 1x مخزن مؤقت لنقل اللطخة الغربية.
    3. اغسل جل SDS ب 1x PBS لمدة 10 دقائق أثناء الاهتزاز لإزالة المخزن المؤقت الذي يعمل بنظام SDS ، ثم احتضن الجل في مخزن مؤقت لنقل اللطخة الغربية لمدة 10 دقائق لتحقيق التوازن. قم بتجميع كاسيت النشاف الكهربائي (أي الجمع بين غشاء PVDF المنشط والمواد الهلامية) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. قم بتشغيل اللطخة عن طريق النشاف الكهربائي عند 300 مللي أمبير لمدة 1 ساعة في صندوق رغوة البوليسترين المملوء بالثلج أو في الغرفة الباردة (4 درجات مئوية). انقل غشاء PVDF إلى أنبوب 50 مل مع جانبه المكشوف المواجه للجانب الداخلي من الأنبوب. احتضن الغشاء في 20 مل من المخزن المؤقت الغربي لحجب اللطخة (انظر الجدول 1) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية أثناء التدحرج على بكرة أنبوب (انظر جدول المواد).
    5. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء لمدة 5 دقائق باستخدام 20 مل من المخزن المؤقت لغسل اللطخة الغربية (PBS مع 0.1٪ (v / v) Tween 20) في نفس الأنبوب أثناء التدحرج. احتضان الغشاء في نفس الأنبوب مع الجسم المضاد الأساسي2 (الذي يستهدف FAHD1 ؛ انظر الجدول 1) المخفف 1: 500 في المخزن المؤقت الغربي لحجب اللطخة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء التدحرج.
    6. اغسل الغشاء في نفس الأنبوب ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع 20 مل من المخزن المؤقت لغسيل اللطخة الغربية أثناء التدحرج. احتضن الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الجسم المضاد الثانوي المقترن ب HRP (انظر جدول المواد) المخفف بنسبة 1:3000 في 5 مل من المخزن المؤقت لحجب اللطخة الغربية.
    7. اغسل الغشاء في نفس الأنبوب ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع 20 مل من المخزن المؤقت لغسيل اللطخة الغربية ومرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما باستخدام 1x PBS. جفف الغشاء عن طريق الإمساك به بعناية باستخدام ملاقط على حافة واحدة ، وعن طريق لمس قطعة من السليلوز أو قطعة من ورق Whatman مع الحافة المقابلة (السفلية) من الغشاء. ضع الغشاء (الجانب المكشوف لأعلى) على لوحة زجاجية نظيفة.
    8. قم بتغطية الغشاء بالكامل بعناية ب 1 مل من ركيزة اللطخة الغربية ECL المعدة باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم إنشاء أي فقاعات هواء. دع محلول ECL يحضن لمدة 3 دقائق ، وقم على الفور بتطوير الغشاء باستخدام فيلم الأشعة السينية أو باستخدام نظام تصوير.
      ملاحظة: إذا لم يتم الكشف عن البروتين في أي من العينات ولكن فقط في التحكم الإيجابي ، فقد يشير ذلك إلى أن البروتين غير قابل للذوبان ، أو غير موجود بكميات كافية ليتم اكتشافه بواسطة الجسم المضاد. إذا تم تحميل نانوغرام فقط من التحكم الإيجابي ، فإن السيناريو الأول يكون أكثر احتمالا. إذا لم يتم اكتشاف أي بروتين على الإطلاق ، فتحقق من جودة الجسم المضاد ، وربما انتقل إلى جسم مضاد متعدد النسيلة بدلا من جسم مضاد أحادي النسيلة. في حالات نادرة ، أي بالنسبة لبعض البروتينات الكارهة للماء ، قد يكون البروتين قابلا للكشف بعد الطرد المركزي ، ولكن ليس بعد الترشيح. في مثل هذه الحالة ، يوصى باستخدام وحدات تصفية خاصة للبروتينات الكارهة للماء.
  3. اختياريا ، قم بتلطيخ أغشية PVDF بعد اللطخة الغربية للتحكم في النقل الناجح للبروتين من جل SDS-PAGE إلى غشاء PVDF.
    ملاحظة: يوصى باستخدام تلطيخ Coomassie لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتطوير الطريقة والتوثيق ، ولكن ضع في اعتبارك أنه بعد تطبيق هذا البروتوكول ، يتم فقدان الأغشية لمزيد من تحليل اللطخة الغربية. يعطي تلطيخ Ponceau S تلطيخا أضعف ولكن يمكن استخدامه إذا كان سيتم إعادة فحص الأغشية.
    1. تحضير صواني صغيرة تحتوي على تلطيخ (Coomassie أو Ponceau S) وحلول إزالة التلطيخ.
    2. باستخدام ملاقط ، ضع الغشاء في محلول التلطيخ ورجه بلطف حتى يلطخ الغشاء جيدا (5-10 دقائق).
    3. انقل الغشاء إلى محلول إزالة البقع ورجه حتى يشبع المحلول (5-10 دقائق). كرر خطوة إزالة البقع حتى يمكن ملاحظة نطاقات البروتين على الغشاء ؛ إذا لم يتم ملاحظة أي عصابات على الإطلاق ، كرر التلطيخ مع وقت حضانة أطول. جفف الغشاء عن طريق وضعه على طبق زجاجي باستخدام ملاقط.

4. اختبار: هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم

ملاحظة: هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم هو وسيلة لتنقية البروتين عن طريق تغيير ذوبان البروتين. في تجربة أولية ، يتم زيادة تركيز كبريتات الأمونيوم بالتتابع إلى قيمة ترسب أكبر قدر ممكن من ملوثات البروتين ، مع ترك FAHD1 في المحلول. يتم فحص قابلية ذوبان البروتين مرة أخرى عن طريق تحليل اللطخة الغربية.

  1. انتقل من الخطوة 2.3: إما إذابة أليكوت من العينة أو المتابعة مباشرة بعد استخراج البروتين (أي دون تجميد العينة). قم بتصفية العينة باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الرواسب المحتملة بعد الذوبان. قم بإعداد ستة أنابيب سعة 1.5 مل على الجليد ، وانقل 250 ميكرولتر من العينة إلى كل أنبوب.
  2. إعداد سلسلة تخفيف من 5 ٪ ، 10 ٪ ، 15 ٪ ، 20 ٪ ، 25 ٪ ، و 30 ٪ كبريتات الأمونيوم في الأنابيب المعدة أعلاه ، وتشكل الحجم النهائي إلى 1000 ميكرولتر مع المخزن المؤقت لتحلل البروتين. احتضان العينات عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها على دوار أنبوب (انظر جدول المواد).
  3. باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة ، جهاز طرد مركزي عند 10000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل جميع المواد الفائقة بعناية إلى أنابيب منفصلة. جفف الكريات الناتجة في الهواء وأعد تعليق كل منها في 1000 ميكرولتر من ddH2O.
  4. لكل زوج من الكريات المعاد تعليقها و supernatant من الخطوة السابقة ، امزج 40 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS 5x واغلي عند 95 درجة مئوية مع أغطية مفتوحة حتى يتبخر معظم السائل. ثم ، أعد تعليق الكريات في خليط من 50٪ DMSO في ddH2O.
  5. قم بإجراء SDS-PAGE (الخطوة 3) ولكن قم بتشغيل المواد الهلامية عند 80 فولت لمدة 3 ساعات. لكل تركيز من كبريتات الأمونيوم, تحميل العينات المشتقة من بيليه المعاد تعليقها وsupernatant (الخطوة 4.3) في أزواج. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية (الخطوة 3).
  6. تحقق من وجود أعلى تركيز لكبريتات الأمونيوم ، حيث يبقى البروتين المراد تنقيته (أي FAHD1) في العينة المشتقة من supernatant. استنادا إلى النتائج, تحديد بروتوكول هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم للبروتين من الفائدة, لاستخدامها في التجارب المستقبلية.
    ملاحظة: من المعروف جيدا أن كبريتات الأمونيوم تشوه SDS-PAGE واللطخة الغربية. مع زيادة تركيز كبريتات الأمونيوم ، سيتم اختراق جودة تحليل اللطخة الغربية. ومع ذلك ، كما هو الحال مع الخطوة 3 من قبل ، يتم استخدام هذا التحليل للتحقق من قابلية ذوبان البروتين محل الاهتمام عند تركيزات معينة من كبريتات الأمونيوم. يهدف هذا البروتوكول إلى ترسيب البروتينات الأخرى ، في حين أن البروتين المراد تنقيته يجب أن يظل قابلا للذوبان.

5. اختبار: كروماتوغرافيا التبادل الأيوني مع FPLC

ملاحظة: ترتبط الجزيئات ذات المجموعات الوظيفية المشحونة بعمود جسيمات السيليكا ل FPLC ، مما يتيح تمايز البروتينات وفقا لشحنة سطحها. نفذ هذه الخطوة مرتين، باستخدام عمود التبادل الكاتيوني وعمود التبادل الأنيوني (انظر جدول المواد). وخطوات البروتوكول هي نفسها بالنسبة لكروماتوغرافيا التبادل الكاتيونية أو الأنيونية، ولكن المخازن المؤقتة التي ستستخدم مختلفة (انظر الجدول 1)؛ كلاهما مع ظروف "الملح المنخفض" 15 mM NaCl و "الملح العالي" 1 M NaCl. بالنسبة للأعمدة المستخدمة ، يوصى بمعدل تدفق يبلغ 1 مل / دقيقة.

  1. قم بإعداد نظام FPLC باستخدام عمود التبادل الأنيوني أو الكاتيوني. اغسل العمود ب 5 أحجام أعمدة (CVs) بنسبة 20٪ EtOH (في H 2 O) ، متبوعة ب 5 CVs من ddH2O. بدلا منذلك ، اغسل العمود ب 1 CV من المخزن المؤقت منخفض الملح ، والمخزن المؤقت عالي الملح ، ومرة أخرى المخزن المؤقت منخفض الملح بالترتيب حتى لا يتم ملاحظة المزيد من القمم في الكروماتوجرام ، ولكن اغسل مرة واحدة على الأقل.
  2. بعد تحديد البروتوكول الأمثل لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم على نطاق صغير (الخطوة 4) ، قم بتطبيق بروتوكول هطول الأمطار على 10 مل من تجانس الأنسجة الأصلي (الخطوة 2). اختياريا، قم بتدوير العينة مقابل المخزن المؤقت منخفض الملح.
    1. ضع العينة على العمود (على سبيل المثال ، عن طريق الحقن أو باستخدام مضخة عينة) وجمع التدفق من خلالها. اغسل العمود ب 1 CV من المخزن المؤقت منخفض الملح.
  3. قم بإعداد إزالة التدرج الخطي من 100٪ مخزن مؤقت منخفض الملح / 0٪ مخزن مؤقت عالي الملح إلى 0٪ مخزن مؤقت منخفض الملح / مخزن مؤقت عالي الملح بنسبة 100٪ ضمن 3 CVs. بعد انتهاء التدرج ، استمر في الجري باستخدام المخزن المؤقت العالي الملح حتى لا يتم اكتشاف المزيد من القمم المرتبطة بالبروتين (امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280/255 نانومتر) في الكروماتوجرام على مدى 1 CV.
  4. ضع 1 مل من 25٪ SDS المذاب في 0.5 M NaOH (في ddH2O) لتنظيف العمود. على التوالي ، اغسل العمود ب 3 CVs من ddH 2 O و 3CVs من 20٪ EtOH (في ddH2O).
  5. جمع عينات SDS-PAGE من جميع كسور الذروة والتدفق من خلالها ، والتحقيق فيها عبر اللطخة الغربية لوجود البروتين محل الاهتمام (الخطوة 3). قم بتجميد الكسور المجمعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  6. بعد اكتمال تحليل اللطخة الغربية ، قم بإذابة وتجميع الكسور التي تحتوي على البروتين محل الاهتمام وتجاهل الأجزاء الأخرى. كرر الخطوات من 5.1 إلى 5.5 مع العمود البديل (أي عمود التبادل الكاتيوني أو الأنيوني).
  7. بعد فحص كلا العمودين ، حدد بروتوكول FPLC للبروتين محل الاهتمام ، لاستخدامه في التجارب المستقبلية. قلل من حجم محلول البروتين باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائق (10 كيلو دالتون، انظر جدول المواد) إلى 2 مل.
    ملاحظة: هناك نتيجتان متوقعتان لهذه السلسلة من التجارب. إما أن يكون البروتين محل الاهتمام قد على أحد الأعمدة ، ومحلول البروتين نقي بالفعل بعد الاستخلاص ، أو بقي البروتين في التدفق في كلتا الحالتين. في السيناريو الأخير ، على الرغم من أن البروتين في التدفق ، إلا أن تأثير التنظيف لهذه الخطوة قد لا يزال كبيرا. في مثل هذه الحالة ، كما هو الحال بالنسبة ل FAHD1 في كبد الخنازير والفئران ، ستظل هذه الخطوة من التبادل الأيوني تؤدي. إذا لم يتمكن عمود التبادل الكاتيوني أو الأنيوني من توفير تأثير تنظيف مناسب ، فقد يحاول المرء تعديل الرقم الهيدروجيني للمحللات والمخزن المؤقت ، وتحويل العينة مقابل المخزن المؤقت قيد التشغيل قبل التطبيق على FPLC.

6. استخراج البروتين باستخدام بروتوكولات فرعية محددة لهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم و FPLC

ملاحظة: الجسيمات المسامية في عمود هلام السيليكا ل FPLC (انظر جدول المواد) تمكن من تمييز البروتينات وفقا لنصف قطرها الهيدروديناميكي. يجب تنفيذ الخطوات الموضحة باستخدام نظام FPLC ، باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). بالنسبة لعمود SEC المستخدم (انظر جدول المواد) ، يوصى بمعدل تدفق يبلغ 0.3 مل / دقيقة.

  1. قم بإعداد جميع المواد المطلوبة (انظر الخطوة 1) ، واستخرج البروتين الكلي من الأنسجة (انظر الخطوة 2). إجراء هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم مع جميع الأنسجة المتجانسة التي لم تستخدم للاختبار (انظر الخطوة 4). بالنسبة للأحجام الأكبر حجما، ركز الليزات باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة (10 كيلودادين؛ انظر جدول المواد) وصولا إلى حجم أصغر يبلغ 50 مل أو أقل.
  2. قم بإجراء خطوة تنقية أولى باستخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني (انظر الخطوة 5).
    1. قم بإعداد عينات للبقع الغربية ، كما هو موضح في الخطوات السابقة. إجراء تحليل اللطخة الغربية وتجميع جميع FAHD1 التي تحتوي على كسور من كروماتوغرافيا التبادل الأيوني.
    2. قلل حجم محلول البروتين إلى 2 مل باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة (10 كيلو دالتون). قم بتصفية المحلول بالتتابع باستخدام وحدات تصفية حقنة 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر لإزالة أي هطول متناهي الصغر.
  3. قم بموازنة عمود SEC مع 1 CV من المخزن المؤقت قيد التشغيل في SEC (انظر الجدول 1) ، الذي يحتوي على 1 mM DTT. قم بتحميل العينة على العمود وقم بتشغيل الكروماتوغرافيا حتى يتم التخلص من جميع البروتينات (1-2 CV).
    1. جمع كسور من 1 مل من التدفق من خلال التي تتوافق مع قمم كبيرة في كروماتوجرام (امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280/255 نانومتر) وإعداد عينات 50 ميكرولتر من كل كسر تم جمعه ل SDS-PAGE وتحليل البقع الغربية ، كما هو موضح في الخطوات السابقة. قم بتجميد جميع الكسور باستخدام النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  4. اغسل عمود SEC على التوالي ب 1 CV من ddH 2 O و 1 CV من20٪ EtOH (في ddH2O). قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية، وقم بتجميع جميع الكسور التي تحتوي على FAHD1. قلل حجم محلول البروتين إلى 2 مل باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة (10 كيلو دالتون، انظر جدول المواد).
  5. تقييم تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص BCA تجارية (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: قد يؤثر محتوى الأس الهيدروجيني والملح في المرحلة المتنقلة على ملف تعريف الاستخلاص للبروتينات الكروية20. قد تؤدي الظروف الحمضية أو الأساسية إلى أن تكون القمم أقل تحديدا وزيادة تفاعلات مصفوفة البروتين مما يؤدي إلى الاحتفاظ الجزئي بالبروتين في العمود20. يمكن استغلال هذا التأثير لمزيد من تنقية البروتين. تكرار الخطوة 6 مع معدلات تدفق مختلفة ، ودرجة الحموضة ، وتركيزات الملح قد يعزز نقاء البروتين20.

7. تلطيخ الفضة

ملاحظة: يلزم تحليل تلطيخ الفضة للمواد الهلامية SDS-PAGE للتحقق من وجود ملوثات البروتين التي قد لا تظهر مع تلطيخ Coomassie. البروتوكول التالي هو واحد من بين العديد من الإصدارات التي يمكن العثور عليها في الأدبيات21. قم بتنفيذ جميع خطوات الحضانة عن طريق الاهتزاز في صينية زجاجية نظيفة. جمع جميع السوائل المحتوية على الفضة والفورمالديهايد في حاوية نفايات خاصة والتخلص منها بشكل صحيح.

  1. احتضن المواد الهلامية SDS-PAGE في محلول تثبيت تلطيخ الفضة (انظر الجدول 1) بين عشية وضحاها في الغرفة الباردة. احتضان المواد الهلامية في محلول حضانة تلطيخ الفضة (انظر الجدول 1) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. اختياريا ، أضف glutaraldehyde (انظر الجدول 1) لتحسين اكتشاف العصابات الخافتة. اغسل المواد الهلامية أربع مرات في ddH2O لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  2. احتضان المواد الهلامية في محلول الفضة تلطيخ الفضة (انظر الجدول 1) لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: ضع في اعتبارك أنه من الآن فصاعدا تحتوي جميع السوائل والجل نفسه على الفضة والفورمالديهايد السامة.
  3. احتضان المواد الهلامية في محلول مطور تلطيخ الفضة (انظر الجدول 1) مع اهتزاز قوي حتى تكون الأشرطة مرئية بوضوح. لوقف التفاعل ، تخلص من محلول المطور واحتضن المواد الهلامية على الفور في محلول إيقاف تلطيخ الفضة (انظر الجدول 1) لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
    ملاحظة: ستصبح النطاقات الملطخة بالخطوتين 7.2 و 7.3 أكثر تطورا باستمرار. قد يكون من الضروري إضافة المزيد من الفورمالديهايد إلى المحلول أكثر مما هو مذكور إذا كان التلطيخ ضعيفا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخراج بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والفئران باستخدام البروتوكول المعروض. بالنسبة لأنسجة الفأر ، يلزم وجود أعضاء متعددة للحصول على عدة ميكروغرام بعد خطوة التنقية النهائية. لهذا السبب ، تركز هذه المقالة على استخراج FAHD1 من كلى الخنازير ، وهي تجربة أكثر مثالية. يتم استخراج FAHD1 من كبد الفأر لعرض الصعوبات والمزالق المحتملة لهذا البروتوكول. يوصى عموما باستخدام الأعضاء التي تظهر مستوى تعبيرا عاليا عن البروتين الذي يريد المرء تنقيته. قد يساعد أطلس البروتين البشري22 في تقدير التعبير في النظام النمو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يعد اتباع الإرشادات الشائعة للتعامل مع البروتينات أمرا ضروريا ، مثل العمل على الجليد وفي ظروف معتدلة من الأس الهيدروجيني والملح. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني مفيد لهذه الطريقة ، في حين يوصى بشدة باستخدام مثبطات البروتيازوم. قد يؤدي تجميد العينة وإذابتها دائما إلى هطول الأمطار البروتينية (جزئيا على الأقل) ، لذلك يجب معالجة أي أليكوت مذاب من محللات البروتين الأولية (الخطوة 2) بشكل مستمر دون انقطاع. يوصى عموما بالطرد المركزي والترشيح بعد الذوبان لإزالة هطول الأمطار الدقي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

والمؤلفان ممتنان جدا للمساعدة التقنية التي قدمتها آيسي أوزتورك وإيفا ألبرتيني. تم الحفاظ على الفئران المستخدمة لتوليد أنسجة الكبد تحت إشراف Uniiv.-Doz. الدكتور بيدر يانسن دور (معهد أبحاث الشيخوخة الطبية الحيوية في جامعة إنسبروك ، Rennweg 10 ، 6020 Innsbruck ، النمسا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ وحدات تصفية مMERCKSLGP033RSMillex-HP ، 0.22 & micro ؛ م ، PES 33 مم ، وليس معقمة
0.45 & مايكرو ؛ وحدات التصفية مMERCKSLHP033NSMillex-HP ، 0.45 & micro ؛ م ، PES 33 مم ، غير معقمة
15 مل أنابيب الصقر VWR734-0451أنابيب الطرد المركزي
50 مل أنابيب الصقرVWR734-0448أنابيب الطرد المركزي
96 بئر الأشعة فوق البنفسجية MicroplateThermo-Fischer8404UV / VIS شفافة مسطحة القاع 96 لوحة بئر محلول
أكريلاميد / مكرر (40٪ ، نسبة 29: 1)BIO-RAD# 161014740٪ أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد ، محلول 29: 1 (3.3٪ متشابك) لصب المواد الهلامية بولي أكريلاميد
Ä ؛ نظام KTA FPLCGE Healthcare Life Sciences / Cytiva-باستخدام نظام FPLC من قبل GE Healthcare ؛ توجد إصدارات مخصصة مختلفة ؛ يستخدم هذا العمل "Ä نظام KTA النقي
"Amicon Ultra-15 ، PLGC Ultracel-PL Membran ، 10 كيلو دالتونMERCKUFC901024مرشحات مركزية لتخصيب البروتين ؛ 10 كيلو دالتون مرشح الكتلة الجزيئية ؛ 15 مل
Amicon Ultra-4 ، PLGC Ultracel-PL Membran ، 10 كيلو دالتونMERCKUFC801024مرشحات مركزية لتخصيب البروتين ؛ 10 كيلو دالتون مرشح الكتلة الجزيئية ؛ 4 مل
مسحوق كبريتات الأمونيومMERCKA4418كبريتات الأمونيوم للبيولوجيا الجزيئية ، & 99.0٪
درجة كاشف الأمونيوم بيرسلفات ، 98٪215589MERCKلبلمرة هلام الأكريلاميد.
Coomassie Brilliant blue R 250MERCK1125530025Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) للرحلان الكهربائي العلامة التجارية لشركة Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2 ، درجة الحموضة 6.2 (10 جم / لتر ، H2< / sub>O ، 25 درجة ؛ ج)
أنابيب غسيل الكلى غشاء السليلوزMERCKD9277أغشية السليلوز لتبادل المخازن المؤقتة عن طريق غسيل الكلى.
أنابيب Eppendof 1.5 ملVWR525-1042أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. تعقيم
HiLoad 26/600 Superdex 75 pgGE Healthcare Life Sciences / Cytiva28989334HiLoad Superdex 75 pg الأعمدة المعبأة مسبقا مخصصة لحجم عالي الدقة لاستبعاد البروتينات المؤتلفة
Immun-Blot PVDF MembraneBIO-RAD#1620177أغشية PVDF عبارة عن أغشية نشاف البروتين محسنة لتطبيقات الفلورسنت والفلورسنت المتعددة.
خلية النقل الكهربائي المصغرة عبر اللطخةBIO-RAD# 1703930استخدم خلية اللطخة السريعة للنشاف السريع للمواد الهلامية مسبقة الصب والصب يدويا من Mini-PROTEAN.
خلية الرحلان الكهربائي العمودي Mini-PROTEAN Tetra للمواد الهلامية الصغيرة مسبقة الصبBIO-RAD# 1658004نظام الرحلان الكهربائي العمودي 4 هلام ، يتضمن مجموعة القطب الكهربائي ، وحدة التشغيل المصاحبة ، الخزان ، الغطاء مع كابلات الطاقة ، سد عازلة الخلية الصغيرة.
أحادي Q 10/100 GLGE Healthcare Life Sciences / Cytiva17516701أعمدة Mono Q هي أعمدة كروماتوغرافيا قوية لتبادل الأنيون لتحليل البروتين أو تلميع البروتينات على نطاق صغير وعالي الدقة.
أعمدة Mono S 10/100 GLGE Healthcare Life Sciences / Cytiva17516901Mono S هي أعمدة كروماتوغرافيا قوية للتبادل الكاتيوني لتحليل البروتين أو تلميع البروتينات عالي الدقة على نطاق صغير.
البروتين الملون من PageRuler ، من 10 إلى 180 كيلو دالتونThermo-Fischer26616مزيج من 10 بروتينات ملطخة باللون الأزرق والبرتقالي والأخضر (10 إلى 180 كيلو دالتون) لاستخدامها كمعايير للحجم في الرحلان الكهربائي للبروتين (SDS-PAGE) والنشاف الغربي.
مجموعة فحص البروتين Pierce BCAThermo-Fischer23225اختبار بروتين مكون من عنصرين وعالي الدقة ومتوافق مع المنظفات لتحديد تركيز البروتين.
سونيفايير 250 ؛ محول الخلية بالموجات فوق الصوتية مع محولبرانسون- نماذج جديدة في https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
الغلوبولين المناعي المضاد للأرانب / HRP (تقارب معزول)Agilent DakoP0399يتفاعل الجسم المضاد المستخدم في اقتران بيروكسيداز الفجل مع الغلوبولين المناعي للأرانب من جميع الفئات.
TEMED ، 1،2-Bis (ثنائي ميثيل أمينو) إيثان ، TMEDAMERCKT9281TEMED (N ، N ، N &prime ؛ ، N & Prime ؛ -Tetramethylethylenediamine) هو جزيء يسمح بالبلمرة السريعة للمواد الهلامية بولي أكريلاميد.
أسطوانة الأنبوب-أسطوانة دوار الأنبوب العام ؛ على سبيل المثال نموذج جديد في https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator-عجلة دوار الأنبوب العام ؛ على سبيل المثال نموذج جديد في https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX ؛ T 25 IKAالرقمية 0003725000الموديلات الجديدة في https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/
محفز سلم

المراجع

  1. Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
  2. Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
  3. Kang, T. -W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
  4. Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
  5. Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).
  6. Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
  7. Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
  8. Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
  9. Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).
  10. Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
  11. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
  12. Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).
  13. Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009(2021).
  14. Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
  15. Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).
  16. Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
  17. Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).
  18. Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
  19. Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
  20. Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011).
  21. Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
  22. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
  23. Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022).
  24. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  25. Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

استخلاص البروتينتنقية البروتينكروماتوغرافيا التبادل الأيونيكروماتوغرافيا استبعاد الحجمالترسيب بكبريتات الأمونيومتحليل SDS-PAGEلطخة وسترن
استخراج وتنقية بروتين FAHD1 من كبد الخنازير والكلى والفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.