مقالة منهجية

تصور التحولات على دائرة الخلايا العصبية الدبقية باستخدام تقنية تصوير الكالسيوم

4.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63338

⸱

أبريل 8, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Neurochemistry, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratory of Neuroenergetics and Inborn Errors of Metabolism, Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Laboratory of Neurochemistry and Cell Biology, Institute of Life Sciences, Universidade Federal da Bahia

في هذه المقالة

ملخص

تصوير الكالسيوم الخلوي هو منهجية متعددة الاستخدامات لدراسة الإشارات الديناميكية للخلايا الفردية ، على مجموعات مختلطة في الثقافة أو حتى على الحيوانات المستيقظة ، استنادا إلى التعبير عن القنوات / المستقبلات النفاذة للكالسيوم التي تعطي توقيعات وظيفية فريدة من نوعها.

الملخص

هنا ، نقدم تقريرا عن نماذج انتقائية في المختبر للدوائر القائمة على الخلايا الدبقية (الخلايا النجمية ، الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا الدبقية الصغيرة) و / أو الخلايا العصبية من الأطراف الطرفية (العقد الجذرية الظهرية) والأنسجة المركزية (القشرة ، المنطقة تحت البطينية ، العضوية) التي تتم دراستها ديناميكيا من حيث تحولات الكالسيوم. النموذج الذي تم اختياره لتوضيح النتائج هو شبكية العين، وهي نسيج بسيط مع تفاعلات خلوية معقدة. الكالسيوم هو رسول عالمي يشارك في معظم الأدوار الخلوية الهامة. نوضح في بروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن إعداد وتقييم الخلايا العصبية الدبقية الشبكية في الثقافة ، مع تصور تحولات الكالسيوم. في هذا النموذج ، نفرق بين الخلايا العصبية والدبقية بناء على استجابتها الانتقائية ل KCl و ATP. يتم التعبير عن المستقبلات والقنوات النفاذة للكالسيوم بشكل انتقائي في مقصورات مختلفة. لتحليل استجابات الكالسيوم، نستخدم قوالب الفلورسنت النسبية مثل Fura-2. يحدد هذا المسبار تركيز Ca2+ الحر استنادا إلى الأشكال المرتبطة ب Ca2 + و Ca2 + ، مما يعرض قمتين مختلفتين ، مبنيتين على شدة التألق المدركة على طولين موجيين.

المقدمة

نظرا للخصائص العالمية للكالسيوم كرسول ثان ، يشارك هذا الأيون في عدد كبير من أنشطة الإشارة: النسخ الجيني ، والولادة والموت ، والانتشار ، والهجرة والتمايز ، والانتقال المشبكي ، واللدونة. وبالتالي ، فإن الطريقة القادرة على تتبع ديناميكيات تنشيط الكالسيوم بدقة وخفة الحركة ستوفر طريقة لمراقبة الاستجابات المكانية والزمانية الفريدة. هذه الطريقة هي تقنية تصوير الكالسيوم الخلوية ، والتي تربط بين البيانات الوظيفية لتحولات الكالسيوم مع أنماط ظاهرية خلية محددة بناء على استجاباتها المتميزة.

تم تطوير مجسات Ca2+ لأول مرة في عام 1980 ، مع تحسينات لاحقة تسمح باستخدام هذه الجزيئات في فحوصات الخلايا الحية 1. كمؤشر كيميائي ، يعتبر Fura-2 هو المعيار للقياسات الكمية [Ca2 +]i. يتخلل استر الأسيتوكسي ميثيل (AM) لهذا المؤشر (أي Fura-2 AM) غشاء الخلية بسهولة ويمكن أن يصل إلى تركيزات داخل الخلايا أكبر ب 20 ضعفا من تخفيف الحضانة (على سبيل المثال ، [5 μM] o / [100 μM]i). ميزة أخرى ل Fura-2 هي أن لديها مقاومة جيدة للتبييض الضوئي. وبالتالي ، فإن تصوير هذا المؤشر لفترات أطول من الزمن لن يؤثر بشكل كبير على قدراته الفلورية. أخيرا ، Fura-2 حساس لمجموعة واسعة من مستويات الكالسيوم ، من ~ 100 نانومتر إلى ~ 100 ميكرومتر ، ولديه دينار كويتي من ~ 145 نانومتر ، وهو ما يمكن مقارنته بالراحة [Ca2 +] i2. في وقت لاحق ، تم تطوير تصوير الكالسيوم الخلوي باستخدام مجاهر فلورسنت أفضل وطرق حسابية ، إلى جانب تحقيقات قياس النسبة التي لا تتأثر بتحميل الصبغة.

تعبر كل خلية عن أجهزة الكالسيوم المختلفة (المضخات والناقلات والمستقبلات والقنوات) التي تساهم في الاستجابة النهائية كتوقيع معين. النصيحة المهمة هي العثور على استجابات انتقائية لأنواع مختلفة من الخلايا المرتبطة بتعبيرها الظاهري. وبناء على ذلك، هناك مستقبلان مختلفان على الأقل يعملان من خلال تحولات الكالسيوم: المستقبلات الأيونية التي تتخلل Ca2+ في وضع سريع ومستقبلات التمثيل الغذائي البطيئة إلى جانب مسارات الإشارات والمخزونات داخل الخلايا التي تطلق Ca2+ التي يتم تنشيطها بواسطة رسل ثانية، مثل الإينوزيتول ثلاثي الفوسفات وADP-ribose3 الدوري.

على سبيل المثال، تعبر الخلايا السلفية عن العشين في شبكية العين غير الناضجة وتظهر مستقبلات GABAA غير المستقطبة بواسطة GABA (أو muscimol)4. يحدث هذا بسبب التدرج الكهروكيميائي Cl مع مستويات Cl− عالية داخل الخلايا. مع تطور الأنسجة ، يتحول الناقلون KCC2 من الإثارة على السلف إلى تثبيط الخلايا العصبية GABAergic الناضجة5. من ناحية أخرى ، فإن الخلايا الجذعية التي تعبر عن sox-2 في المنطقة تحت البطينية غير الناضجة (SVZ) للقوارض بعد الولادة تقدم أيضا مستقبلات H1 الأيضية التي يتم تنشيطها بواسطة الهيستامين الذي يزيد من Ca2 + بطريقة بطيئة 6. وهناك مستقبل استقلابي ثان من عائلة المستقبلات المنشطة بالبروتياز-1 (PAR-1)، يتم تنشيطه بواسطة الثرومبين والمصب إلى G(q/11) وفوسفوليباز C (PLC)، يعطي تحولات بطيئة Ca2+ في الخلايا القليلة التغصن (التي تعبر عن O4 و PLP) المتولدة من الخلايا الجذعية العصبية SVZ متعددة القدرات7.

بشكل عام ، تعبر الخلايا العصبية عن قنوات الكالسيوم المعتمدة على الجهد بالإضافة إلى مستقبلات الناقل العصبي الرئيسية النفاذة إلى Ca2 + ، مثل الغلوتاماتيرجيك (AMPA ، NMDA ، kainate) ومستقبلات النيكوتين الطرفية والمركزية. عادة ما يستخدم كلوريد البوتاسيوم كعامل إزالة الاستقطاب لتنشيط الخلايا العصبية الطرفية، مثل الخلايا العصبية العقدة الجذرية الظهرية8 أو الخلايا العصبية المركزية، اعتبارا من المنطقة تحت البطينية9 أو شبكية العين10. من ناحية أخرى ، يتم التعرف على ATP باعتباره جهاز الإرسال الدبقي الرئيسي (بالإضافة إلى D-serine) ، والذي ينشط أعضاء P2X الانتقائيين المؤثرين في Ca2 + ، مثل P2X7 و P2X4. يقدم كلا المستقبلين تيارات Ca2+ مكافئة ، على غرار تلك التي أظهرتها مستقبلات NMDA المعترف بها كأكبر تيارات Ca2 + التي يتم تنشيطها بواسطة أجهزة الإرسال 11. يتم التعبير عن مستقبلات P2X7 بشكل كبير على الخلايا الدبقية الصغيرة ، ولكن بكثافة أقل على الخلايا النجمية والخلايا قليلة التغصن ، ولها دور في إطلاق السيتوكينات المسببة للالتهابات 12. يتم التعبير عن مستقبلات P2X7 أيضا على خلايا Schwann13 ودبقية مولر في شبكية العين14,15.

من المعروف أن شبكية العين تظهر تقريبا جميع أجهزة الإرسال التي شوهدت في الدماغ. على سبيل المثال ، المحور الرأسي (المستقبلات الضوئية ، الخلايا العقدية ثنائية القطب والشبكية) هو أساسا غلوتاماتيرجي ، مع مستقبلات AMPA أو kainate النفاذة للكالسيوم المعبر عنها في الخلايا ثنائية القطب OFF-polar و mgluR6 المعبر عنها في الخلايا ثنائية القطب ON-bipolar16. ومن الغريب أن جميع المستقبلات الثلاثة موجودة أيضا في دبقية مولر ، والتي تقترن بمسارات الكالسيوم والإينوزيتول ثلاثي الفوسفات17،18. المحور المثبط الأفقي ، الذي تصنعه الخلايا الأفقية والأماكرين ، لا يفرز فقط GABA ، ولكن أيضا الدوبامين والأسيتيل كولين وغيرها من الناقلات العصبية الكلاسيكية. خلايا أماكرين هي الأنواع الرئيسية من الخلايا الموجودة في مزارع شبكية العين للطيور ، والتي تظهر عدة أنواع من القنوات التي تعمل بالكالسيوم ، مثل قنوات الكالسيوم الغلوتاماتية والبيورينية والنيكوتينية والجهد الكهربائي. لهذا السبب ، يعد هذا نموذجا ممتازا لتقييم الخصائص المختلفة لتحولات الكالسيوم بين الخلايا العصبية والدبقية.

لذلك ، فإن الجمع بين المستقبلات والقنوات المختلفة التي تم تلخيصها في علامات النمط الظاهري الانتقائي أثناء التطوير مع أنماط استجابة ناهضة متميزة يسمح بتوقيعات فريدة في الجذع ، السلف ، الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية ، oligodendrocyte ، و microglia التي تعمل من خلال أجهزة إشارات انتقائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب التي شملت الحيوانات وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للجامعة الفيدرالية في ريو دي جانيرو ، وفقا ل مبادئ رعاية المختبر (المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ؛ رقم التصريح IBCCF-035 لبيض الدجاج الأبيض المخصب Leghorn.

1. إعداد الحلول

  1. تحضير محلول كريبس: (132 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، 4 ملليمتر KCl ، 1.4 ملم MgCl2 ، 2.5 ملم CaCl2 ، 6 ملليمتر جلوكوز ، 10 ملم HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 373 mOsm).
  2. تحضير المخزن المؤقت الملحي (Ca2+ و Mg2+ الحل الحر - CMF): 76.55 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 3.05 جم / لتر KCl ، 1.65 جم / لتر Na2HPO4 ، 0.610 جم / لتر KH2PO4 ، 21.95 جم / لتر جلوكوز ، و 7.90 جم / لتر NaHCO3.
  3. تحضير محلول الحضانة (مع حل Fura-2 في Krebs:) 5 ميكرومتر فورا-2-أسيتوكسي ميثيل استر (فورا-2)، 0.1٪ ألبومين مصل البقر الخالي من الأحماض الدهنية (BSA)، و 0.02٪ بولوكسامير 407.
  4. بالنسبة للسكان المختلطين أو ثقافة الدبقية ، قم بإعداد DMEM / F12 مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) و 40 مجم / لتر من الجنتاميسين كوسيط.
  5. للثقافة الغنية بالخلايا العصبية ، قم بإعداد DMEM / F12 مع 1٪ FCS ، ملحق زراعة الخلايا العصبية ، 40 مجم / لتر والجنتاميسين كوسيط.

2. تشريح الشبكية وإعداد زراعة الخلايا

  1. افتح بيضة جنين الفرخ (E8) البالغة من العمر 8 أيام حيث توجد خلية الهواء.
  2. قم بإزالة محتويات البيض إلى طبق بتري واستمر في القتل الرحيم للجنين عن طريق قطع الرأس باستخدام زوج من الملقط.
  3. أحضري الرأس إلى طبق بتري نظيف واسكبي بعض المحلول الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (CMF) لغسله.
  4. قم بإزالة العينين ، مع الحرص على عدم إتلافها في هذه العملية.
    ملاحظة: حاول تجنب قطع أو تمزيق طبقات العين قبل إزالتها من تجويف العين.
  5. أحضري العينين إلى طبق بتري نظيف يحتوي على CMF.
  6. ابدأ تشريح العين عن طريق إزالة العدسة.
  7. قم بإجراء 3 أو 4 جروح طولية في العين ، بدءا من الثقب الذي تركته العدسة. قم بإجراء تخفيضات عن طريق سحب الملقط ، مع إمساك الصلبة العينية في اتجاهين متعاكسين.
  8. قم بإزالة الجسم الزجاجي الشفاف بحذر ، مع التأكد من أن شبكية العين ليست مرتبطة به.
  9. افصل شبكية العين عن الظهارة المصطبغة وأزل أي أنسجة متبقية.
  10. قطع شبكية العين واضحة في قطع صغيرة.
  11. انقل شبكية العين إلى مستلم آخر وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة (~ 1800 × g لمدة دقيقة واحدة) لإزالة CMF.
  12. قم بفصل شبكية العين إنزيميا مع 1 مل من 0.25٪ من التربسين ، عن طريق احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  13. أوقف التفاعل بإضافة 1 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ FCS.
  14. اغسل شبكية العين 2 أو 3 مرات بمتوسطة. يتكون الغسيل من دورات لإضافة وسيط وإزالته عن طريق الطرد المركزي (~ 1800 × g لمدة دقيقة واحدة).
  15. أضف 2 مل من الوسط الكامل لكل شبكية العين وافصل الشبكية ميكانيكيا بلطف عن طريق سحبها لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: هنا ، يمكن للمحققين اختيار نوع الثقافة التي سيتم إعدادها. للحصول على ثقافة عصبية غنية ، استخدم DMEM-F12 + مكمل عصبي + 1٪ FCS + مضادات حيوية. بالنسبة للسكان المختلطين أو الدبقية النقية ، استخدم DMEM-F12 + 10٪ FCS + المضادات الحيوية.
  16. عد الخلايا وتخفيفها إلى الكثافة المطلوبة.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يجب أن تكون هذه ثقافة منخفضة الكثافة مع ~ 2 × 106 خلايا أو أقل.
  17. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل غطاء.
  18. علاج الانزلاق الغطائي
    1. احتضان الأغطية لمدة 1 ساعة على الأقل (من الناحية المثالية بين عشية وضحاها) في 1 مل من 10-50 ميكروغرام / مل بولي ل ليسين في الماء النقي المعقم عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة محلول poly-L-lysine واغسل أغطية الغطاء بالماء النقي المعقم 2-3 مرات.
    3. اترك الأغطية تجف في خزانة أمان مع تشغيل مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. في هذه المرحلة ، قم بتخزينها في حاوية مغلقة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
    4. الخطوة الاختيارية: بالنسبة للثقافات الغنية بالخلايا العصبية، أضف 50 ميكرولتر من 10-20 نانوغرام/مل من الصفيحة في PBS أو متوسطة إلى كل غطاء لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول laminin الزائد ويكون الغطاء جاهزا للاستخدام.
  19. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪ حتى تلتصق بالزجاج. هذا يجب أن يستغرق حوالي 1-2 ساعة.
  20. أضف 1 مل من الوسط الكامل إلى كل بئر وأعد اللوحة إلى الحاضنة حتى يوم التجربة. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام.

3. تحميل الخلايا مع Fura-2 AM

  1. إعادة تشكيل قارورة 50 ميكروغرام من Fura-2 AM مع 50 ميكرولتر من DMSO.
  2. لإعداد حل Fura-2 AM العامل ، أضف 3 ميكرولتر من 10٪ Poloxamer 407 ، 7.5 ميكرولتر من Fura-2 AM في DMSO وحل Krebs q.s.p. إلى 1.5 مل.
  3. سونيك الخليط لمدة 7 دقائق في حمام مائي.
  4. اغسل الغطاء بزراعة الخلايا 3x بمحلول كريبس قبل احتضانه في Fura-2.
  5. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
  6. بعد الحضانة ، اغسلها 3x مرة أخرى وانقلها إلى مستلم آخر يحتوي على كريبس ومحمي من الضوء.
    ملاحظة: يظل حل Fura-2 AM العامل مستقرا لمدة 24 ساعة إذا كان محميا من الضوء.

4. تصوير الكالسيوم للخلايا

  1. قبل كل تشغيل ، أضف السيليكون إلى دعامة الغطاء والغرفة لتجنب التسرب أثناء التجربة.
  2. اغسل الجزء السفلي من الغطاء بالماء المقطر لتجنب تبلور الملح على عدسة المجهر.
  3. ضع الغطاء على الدعامة ، واضغط برفق على الحدود.
  4. قم بتوصيل الدعم والغرفة بالمجهر وابدأ في اختراق الخلايا بمحلول Krebs.
    ملاحظة: تتم معايرة تروية الخلايا أثناء تجارب تصوير الكالسيوم أحادية الخلية إلى معدل تدفق يبلغ 0.5 مل / دقيقة ، ويستغرق استبدال حل النظام الأساسي بالكامل من 8 إلى 10 ثوان.
  5. ألق نظرة على الخلايا وحدد مجال رؤية مناسبا.
  6. حدد أجسام الخلايا يدويا بناء على مورفولوجيتها المتميزة.
  7. قبل تطبيق أي حافز ، انتظر استقرار خط الأساس. يجب أن يستغرق كل حافز حوالي 30 ثانية.
    ملاحظة: قم بإعداد جميع الحلول مباشرة قبل كل تجربة.
  8. قم بتقييم الاختلافات في [Ca2+] i عن طريق تحديد نسبة التألق المنبعث عند 510 نانومتر بعد الإثارة البديلة (750 مللي ثانية) عند 340 و 380 نانومتر.
  9. معالجة القيم المكتسبة باستخدام برنامج تحليل التألق.
  10. التعبير عن النتائج التجريبية في جدول يمثل فيه كل صف خلية فردية، وكل سطر نقطة زمنية.

5. معالجة البيانات

  1. باستخدام برنامج جدول بيانات ، ارسم تباين قيم نسبة التألق Fura-2 للخلايا المفردة بشكل منفصل أو جميعها في نفس الوقت.
  2. لتحديد عدد الخلايا التفاعلية لتحديد الحافز ، حدد حدا لزيادة بنسبة 30٪ في مستويات خط الأساس للكالسيوم

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا ، استخدمنا خلايا شبكية العين في الثقافة من فراخ اليوم الجنيني 8 للتحقيق في كيفية إشارة الخلايا العصبية والدبقية من حيث تحولات الكالسيوم. تم تحضير المستنبتات بشكل أساسي كما هو موصوف15,19 كخلايا عصبية دبقية مختلطة (بكثافة ≥ 1 × 106 خلية / طبق) في مرحلة من 7 أيام في المختبر (الشكل 1A). بدلا من ذلك ، الخلايا العصبية المخصبة المحضرة بكثافة منخفضة (5 × 105 خلية / طبق) ، مبذرة على أغطية بولي - إل ليسين المعالجة (10...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد استخدمنا أنسجة شبكية العين لإظهار أن استجابات الكالسيوم بوساطة KCl أو ATP مجزأة بوضوح إلى استجابات عصبية ودبقية ، على التوالي (الشكل 1). على الرغم من أن بعض البيانات في الأدبيات تشير إلى أن مستقبلات P2X7 يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية ، التي تنظم النشاط العصبي وإطلاق الناقل العصبي المشبكي 20 ، إلا أن مؤلفين آخرين يشككون في وجود مستقبلات P2X7 العصبية. في الواقع، تدعم النتائج الحالية فكرة أن مستقبلات P2X7 الدبقية الأولية تتوسط في التأثيرات العصبية التي يتم تلخي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

المنح والرعاة ومصادر التمويل: يتلقى MH زمالة CNPq للدكتوراه. تتلقى HRF زمالة ما بعد الدكتوراه بدعم من CNPq (رقم منحة HRF 152071/2020-2). يتم دعم RAMR من قبل CNPq و FAPERJ (أرقام المنح E-26/202.668/2018 و E-26/010.002215/2019 و 426342/2018-6 و 312157/2016-9 و INCT-INNT (المعهد الوطني لعلم الأعصاب الانتقالي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

غطاء Suplement
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 ممPaul Marienfeld GmbH & Co. KG111550Cell supports
510 nm مرشح طويل التمريرCarl Zeiss
ATPSigmaA1852
B-27 SupplementGibco17504044Suplement
CaCl2< / sub>Sigma-AldrichC8106
CoolSNAP digital الكاميراروبر العلمية, ترينتون, نيوجيرسي
D- (+)-الجلوكوزالنيون1466
DMEM / F-12Gibco12400-24وسط ثقافة الخلية
برنامج Excelمايكروسوفت
مصل العجل الجنينسيجما ألدريتشF9665
مجهر مضانAxiovert 200; كارل زايسب 40-080
Fura-2 AMالمجسات الجزيئيةF1221النسبية Ca2 + < / sup> مؤشر
جنتاميسين كبريتاتكالبيوتشيم1405-41-0المضادات الحيوية
HEPESSigmaH4034
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Lambda جهاز DG-4أداة Sutter ، Novاتو ، CADG-4PLUS / OF30
LamininGibco23017-015مساعدة التصاق الخلية
برنامج MetafluorUniversal Imaging Corp. West Chester ، PA
MgCl 2< / sub>SigmaM4880
Na2< / sub>HPO4< / sub>Vetec129
كلوريد الصوديومIsofar310
NaHCO3< / sub>Vetec306
PH3 منصةWarner Intruments ، Hamden ، CT64-0286
Pluronic F-127المجسات الجزيئيةP6866غير أيونية ، خافضة للتوتر السطحي
Poly-L-lysineSigma-AldrichP8920مساعدة التصاق الخلية
Trypsin-EDTA 0.25٪جيبكو25200056إنزيم التفكك

المراجع

  1. Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
  2. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  3. Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
  4. De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
  5. Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
  6. Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
  7. Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).
  8. Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919(2014).
  9. Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529(2013).
  10. Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
  11. Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
  12. Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
  13. Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
  14. Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
  15. Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677(2016).
  16. Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
  17. Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
  18. López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
  19. Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
  20. Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
  21. Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
  22. Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
  23. Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
  24. Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
  25. Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
  26. de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
  27. Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fura 2 ATP P2X7

مقالات ذات صلة