مقالة منهجية

موارد المعلوماتية الحيوية لدراسة تفاعلات البروتين بوساطة الجليكان

DOI:

10.3791/63356

⸱

يناير 20, 2022

1Proteome Informatics Group, SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 2Computer Science Department, University of Geneva, 3Section of Biology, University of Geneva

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيفية استكشاف ومقارنة وتفسير البروتين البشري glycome مع الموارد عبر الإنترنت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إطلاق مبادرة Glyco@Expasy كمجموعة من قواعد البيانات والأدوات المترابطة التي تغطي عدة جوانب من المعرفة في علم الأحياء السكري. على وجه الخصوص ، يهدف إلى تسليط الضوء على التفاعلات بين البروتينات السكرية (مثل مستقبلات سطح الخلية) والبروتينات المرتبطة بالكربوهيدرات بوساطة الجلايكان. هنا ، يتم تقديم الموارد الرئيسية للمجموعة من خلال مثالين توضيحيين يتمركزان على N-glycome لمستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) و O-glycome لبروتينات المصل البشري. من خلال استعلامات قاعدة البيانات المختلفة وبمساعدة أدوات التصور ، توضح هذه المقالة كيفية استكشاف المحتوى ومقارنته في سلسلة متصلة لجمع وربط أجزاء المعلومات المتناثرة بخلاف ذلك. البيانات التي تم جمعها موجهة لتغذية سيناريوهات أكثر تفصيلا لوظيفة الجليكان. لذلك ، يتم اقتراح المعلوماتية الجليكونية المقدمة هنا كوسيلة إما لتعزيز أو تشكيل أو دحض الافتراضات حول خصوصية غليكوم البروتين في سياق معين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجليكان والبروتينات التي ترتبط بها (البروتينات السكرية) والبروتينات التي ترتبط بها (الليكتين أو البروتينات المرتبطة بالكربوهيدرات) هي الجهات الفاعلة الجزيئية الرئيسية على سطح الخلية1. على الرغم من هذا الدور المركزي في التواصل بين الخلايا الخلوية، إلا أن الدراسات واسعة النطاق، بما في ذلك الغليكوميكس، أو الجليكوبروتيوميك، أو بيانات الجليكوبروتينات البينية لا تزال نادرة مقارنة بنظيرتها في علم الجينوم والبروتيوميات.

حتى وقت قريب ، لم يتم تطوير طرق لتوصيف الهياكل المتفرعة للكربوهيدرات المعقدة بينما لا تزال مقترنة بالبروتين الناقل. التخليق الحيوي للبروتينات السكرية هو عملية غير مدفوعة بالقوالب يلعب فيها المتبرعون بالسكريات الأحادية ، وركائز البروتين السكري المقبولة ، والجليكوزيل ترانسفيراز والجليكوزيداز دورا تفاعليا. يمكن أن تحمل البروتينات السكرية الناتجة هياكل معقدة مع نقاط تفرع متعددة حيث يمكن أن يكون كل مكون من مكونات السكاريد الأحادي أحد الأنواع العديدة الموجودة في الطبيعة1. تفرض العملية غير القائمة على القوالب التحليل الكيميائي الحيوي كخيار وحيد لتوليد البيانات الهيكلية قليلة السكاريد. غالبا ما تكون العملية التحليلية لهياكل الجليكان المرتبطة بالبروتين الأصلي صعبة لأنها تتطلب تقنيات حساسة وكمية وقوية لتحديد تكوين السكاريد الأحادي والروابط والتسلسلات المتفرعة2.

في هذا السياق ، يعد قياس الطيف الكتلي (MS) هو التقنية الأكثر استخداما على نطاق واسع في تجارب glycomics و glycoproteomics. مع مرور الوقت ، يتم تنفيذ هذه في إعدادات إنتاجية أعلى وتتراكم البيانات الآن في قواعد البيانات. هياكل غليكان بتنسيقات مختلفة3 ، تملأ GlyTouCan4 ، مستودع بيانات غليكان العالمي حيث ترتبط كل بنية بمعرف مستقر بغض النظر عن مستوى الدقة الذي يتم به تعريف الجليكان (على سبيل المثال ، ربما نوع الارتباط المفقود أو التركيب الغامض). يتم جمع هياكل متشابهة جدا ولكن يتم الإبلاغ بوضوح عن اختلافاتها الطفيفة. يتم وصف البروتينات السكرية وتنسيقها في GlyConnect5 و GlyGen6 ، وهما قاعدتا بيانات مرجعيتان لبعضهما البعض. يتم تخزين بيانات MS التي تدعم الأجزاء الهيكلية من الأدلة بشكل متزايد في GlycoPOST7. وللحصول على تغطية أوسع للموارد على الإنترنت، فإن الفصل 52 من الدليل المرجعي، أساسيات علم الأحياء السكرية، مكرس للمعلوماتية السكرية8. ومن المثير للاهتمام ، أن برامج تحديد الجليكوببتيد قد انتشرت في السنوات الأخيرة9,10 ولكن ليس لصالح التكاثر. دفع القلق الأخير قادة مبادرة HUPO GlycoProteomics (HGI) إلى وضع تحد للبرمجيات في عام 2019. تم توفير بيانات MS التي تم الحصول عليها من معالجة المخاليط المعقدة من بروتينات المصل البشري N- و O-glycosylated في أوضاع تجزئة CID و ETD و EThcD للمنافسين سواء مستخدمي البرامج أو المطورين. ولا يرد هنا سوى التقرير الكامل عن نتائج هذا التحدي(11). بادئ ذي بدء ، لوحظ انتشار عمليات تحديد الهوية. تم تفسيره بشكل رئيسي على أنه ناجم عن تنوع الأساليب المنفذة في محركات البحث ، وإعداداتها ، وكيفية تصفية المخرجات ، و "حساب" الببتيد. قد يكون التصميم التجريبي قد وضع أيضا بعض البرامج والأساليب في ميزة (غير واضحة). والأهم من ذلك، أن المشاركين الذين يستخدمون نفس البرنامج أبلغوا عن نتائج غير متناسقة، مما يسلط الضوء على قضايا خطيرة تتعلق بقابلية التكرار. واختتم بمقارنة التقديمات المختلفة بأن بعض الحلول البرمجية تؤدي أداء أفضل من غيرها وأن بعض استراتيجيات البحث تسفر عن نتائج أفضل. ومن المرجح أن توجه هذه التغذية المرتدة تحسين أساليب تحليل بيانات غليكوببتيد الآلية، وستؤثر بدورها على محتوى قاعدة البيانات.

أدى التوسع في المعلوماتية السكرية إلى إنشاء بوابات ويب توفر المعلومات والوصول إلى العديد من الموارد المماثلة أو المكملة. ويرد وصف لأحدث وأحدث هذه الأحدث في فصل من سلسلة كتب علم الجليكوساينس الشاملة(12)، ومن خلال التعاون، يتم تقديم حل لتقاسم البيانات وتبادل المعلومات في وضع الوصول المفتوح. تم تطوير إحدى هذه البوابات التي كانت تسمى في الأصل Glycomics@ExPASy 13 وأعيدت تسميتها Glyco@Expasy ، بعد الإصلاح الرئيسي لمنصة Expasy 14 التي استضافت مجموعة كبيرة من الأدوات وقواعد البيانات المستخدمة عبر العديد من -omics لعقود ، العنصر الأكثر شعبية هو UniProt15 - قاعدة معارف البروتين العالمية. تقدم Glyco@Expasy اكتشافا تعليميا للغرض من قواعد البيانات والأدوات واستخدامها ، استنادا إلى تصنيف مرئي وعرض لأوجه ترابطها. يوضح البروتوكول التالي إجراءات استكشاف بيانات الجليكوميكس و glycoproteomics مع مجموعة مختارة من الموارد من هذه البوابة التي تجعل العلاقة بين glycoproteomics و glycan-interactomics واضحة عبر glycomics. كما هو الحال ، تنتج تجارب glycomics هياكل حيث يتم تعريف السكريات الأحادية بشكل كامل وتحديد الروابط جزئيا أو كليا ، ولكن ارتباطها بموقع البروتين يكون ضعيفا ، إن وجد. في المقابل ، تولد تجارب glycoproteomics معلومات دقيقة عن مرفق الموقع ولكن مع دقة ضعيفة لهياكل الجليكان ، وغالبا ما تقتصر على تركيبات السكاريد الأحادي. يتم تجميع هذه المعلومات معا في قاعدة بيانات GlyConnect. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام أدوات البحث في GlyConnect للكشف عن روابط الجليكان المحتملة التي يتم وصفها جنبا إلى جنب مع البروتينات التي تتعرف عليها في UniLectin16 ، المرتبطة ب GlyConnect عبر glycans. ينقسم البروتوكول المعروض هنا إلى قسمين لتغطية الأسئلة الخاصة بالجليكان المرتبط ب N والمرتبط ب O والبروتينات السكرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يلزم وجود جهاز متصل بالإنترنت (يفضل شاشة أكبر) ومتصفح ويب محدث مثل Chrome أو Firefox. قد لا يكون استخدام Safari أو Edge موثوقا به.

1. من بروتين N-glycome في GlyConnect إلى ليكتين من UniLectin

  1. الوصول إلى الموارد من Glyco@Expasy
    ملاحظة: الإجراء الموضح هنا هو الوصول إلى GlyConnect ولكن يمكن تطبيقه للوصول إلى أي مورد مسجل في النظام الأساسي.
    1. انتقل إلى https://glycoproteome.expasy.org/glycomics-expasy وفكر في المخطط الفقاعي على اليمين الذي يعرض فئات مختلفة مثل Glycoconjugates أو Glycan Binding. في القائمة الموجودة في أقصى اليسار والتي تعكس الفئات الموجودة في الفقاعات، حدد مربع البروتينات السكرية بحيث يقوم المخطط الفقاعي الموجود على اليمين بتكبير الفقاعة المطابقة لتلك الفئة على الفور.
      ملاحظة: الفقاعات الخضراء هي أدوات والفقاعات الصفراء هي قواعد بيانات. يؤدي النقر فوق أي منهما إلى التكبير مرة أخرى لتقديم تفاصيل حول المورد. قبل القيام بذلك ، قد يرغب المستخدم في فهم تبعيات هذا المورد للآخرين.
    2. للحصول على معلومات حول التبعيات، انتقل من علامة التبويب التصنيف المواضيعي للموارد إلى علامة التبويب عجلة تبعية الموارد . ضع الماوس على GlyConnect في العجلة للتحقق من مستوى تكامله مع المصادر الأخرى (الشكل 1).
    3. ارجع إلى علامة التبويب التصنيف المواضيعي للموارد للوصول إلى فقاعة GlyConnect كما في الخطوة 1.1.1 وانقر فوقها (الشكل التكميلي 1) لعرض صفحة GlyConnect الرئيسية في علامة تبويب جديدة تعرض إحصائيات المحتوى في أحدث إصدار من قاعدة البيانات.
      ملاحظة: يطابق نظام الألوان المفصل في الجدول 1 الأنواع المختلفة من المعلومات المخزنة في قاعدة البيانات. رمز اللون هذا صالح في جميع صفحات الكيانات في GlyConnect وهو متسق طوال الوقت. تعرض الصفحة الرئيسية أيضا أربعة أقسام مخصصة لمجموعات البيانات المركزة مثل تلك التي تصف غليكوزيل بروتين سارس-كوف-2 سبايك (COVID-19) أو تفصل على نطاق واسع السكريات قليلة السكريات في الحليب البشري (HMO). ولن يتم استكشاف هذه المسائل في هذا البروتوكول.
  2. استكشاف المعلومات السياقية لبروتين N-glycome
    ملاحظة: يتم عرض جميع هياكل الجليكان في GlyConnect في ثلاثة تنسيقات بديلة وشائعة الاستخدام: (1) تسمية الرمز للجليكان (SNFG)17 (2) IUPAC المكثف18، و (3) أكسفورد19. في المقابل ، لا يوجد تدوين قياسي للتعبير عن تكوين الجليكان. في GlyConnect ، يتم استخدام التعليمة البرمجية التالية: Hex ل hexose ، HexNAc ل N-Acetylhexosamine ، dHex للفوكوز ، و NeuAc لأحماض السياليك. من أجل البساطة ، تعتمد أدوات التصور على تدوين مكثف: H للسداسي ، N ل N-Acetylhexosamine ، F للفوكوز ، و S لأحماض السياليك. بالإضافة إلى ذلك ، تشير الأحرف الصغيرة إلى تعديلات مثل "a" للأسيتيل ، و "p" للفسفرة ، و "s" للكبريتات ، لأكثر هذه البدائل المزعومة شيوعا.
    1. لعرض واستكشاف N-glycome من مستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) ، من الصفحة الرئيسية GlyConnect ، تابع على النحو التالي.
      ملاحظة: تمت دراسة غليكوزيل PSA البشري على مر السنين ، وخاصة في سياق سرطان البروستاتا. تخزن قاعدة بيانات GlyConnect ثلاثة مراجع20،21،22 ، والتي تجمع بين بيانات glycomics و glycoproteomics. لاحظ أنه تم الحصول على النتائج المقدمة هنا مع إصدار سبتمبر 2021 من GlyConnect. قد يؤدي الاستخدام الخفي لقاعدة البيانات إلى إحصائيات مختلفة قليلا بسبب تحديثات البيانات المتكررة.
    2. حدد الزر PROTEIN لفتح طريقة عرض البروتين في قاعدة البيانات. في صفحة عرض البروتين، اكتب البروستاتا في نافذة البحث. ابحث عن الإدخالين المدرجين في الإخراج اللذين يميزان بين شكلين متساويين من PSA مع قيم pI متميزة. انقر فوق 790 (عمود ID) المقابل للشكل المتماثل الشائع ل PSA.
      ملاحظة: ابحث عن الشريط العلوي متعدد الألوان الذي يعرض معلومات موجزة مستخرجة من العمل المنشور في المخطط المفصل أعلاه. هناك العديد من الخيارات الممكنة للتنقل كما هو موضح أدناه.
    3. في الشريط العلوي متعدد الألوان ، انقر فوق الزر SOURCE باللون الأخضر لعرض أنواع العينات التي تمت معالجة البيانات المنشورة منها: البول والسائل المنوي. لتصفح هذه المعلومات بشكل أكبر، انقر فوق أي من أنواع العينات هذه. وينطبق الشيء نفسه على أي عنصر يظهر عند النقر فوق زر ملون.
    4. للتحقق من المحتوى المتعلق بالصحة في قاعدة البيانات ، انقر فوق الزر DISEASE ، الذي يحتوي على عنصرين ، أحدهما هو سرطان البروستاتا الذي يرتبط بصفحة المرض المخصصة المقابلة في GlyConnect. يظهر ملخص تلك الصفحة أن ثلاث دراسات واسعة النطاق أبلغت عن 319 تركيبة في 1087 موقعا تم العثور عليها في 308 بروتينات بشرية.
    5. انقر فوق الزر STRUCTURE لعرض القائمة الكاملة ل 135 بنية مرتبطة ب PSA من بيانات glycomics. انقر فوق الزر COMPOSITION للحصول على 78 تركيبة مرتبطة تحددها تجارب glycoproteomics. انقر على أي هيكل أو تكوين للحصول على مزيد من التفاصيل.
      ملاحظة: يمكن الحصول على تفاصيل مثل قائمة البروتينات البديلة التي تحمل بنية معينة أو قائمة الهياكل المطابقة للتكوين. من المعروف أن PSA لديها موقع N-glycosylation واحد فقط في Asn-69 (عنصر واحد فقط يتم احتسابه لزر SITE البني).
    6. لتقليل غموض التراكيب ، انقر فوق STRUCT المقترح أسفل تركيبة محددة (على سبيل المثال ، Hex:6 HexNAc:3 NeuAc:1). يتم تقديم اقتراح في كل مرة يتزامن فيها عدد السكريات الأحادية مع عدد البنية المذكورة أعلاه (الشكل 2).
      ملاحظة: يتم مطابقة التركيبة السداسية: 6 HexNAc: 3 NeuAc: 1 الناتجة عن تجربة glycoproteomics مع أربعة هياكل عالية الدقة من بيانات glycomics. في حالة PSA ، لا يوجد غموض في الموقع لحله لأن Asn-69 فقط هو glycosylated.
    7. لاستكشاف صفحة البروتين بالكامل، يمكنك عرض مزيد من التفاصيل على الجانب الأيمن من الصفحة (الشكل 3).
      1. عرض إدخال 3QUM PDB الافتراضي (بنك بيانات البروتين23) ل PSA الذي يظهر مع اثنين من الجليكان المعقدة المرفقة بكل مونومر (الشكل 3) أو إدخال 2ZCK البديل ، والذي يتوفر أيضا بسبب الكربوهيدرات المرفقة. يظهر الإدخال الثاني سلسلة واحدة.
        ملاحظة: يتم تصور كلا الإدخالين باستخدام المكون الإضافي 3D LiteMol 24 الذي يعرض الجليكان في تدوين SNFG-3D المعتمد في PDB-RCSB.
      2. انقر على الروابط المقابلة للمراجع التبادلية الأخرى لاستكشاف المعلومات الوظيفية ذات الصلة من قواعد بيانات البروتينات الرئيسية ، مثل UniProt (الشكل 3).
  3. تصور وربط المعلومات السياقية لبروتين N-glycome
    ملاحظة: كما رأينا في القسم السابق ، قد يكون من الصعب فهم القوائم الطويلة من الهياكل أو التراكيب ككل ويعتمد GlyConnect على أداتين مختلفتين لتصور المعلومات الرئيسية ، وهما GlyConnect Octopus و GlyConnect Compozitor (الأول يوسع معلومات الملخص التي تم التقاطها في أزرار ملونة والثاني يبرز التبعيات الهيكلية من حيث الهيكل / التكوين الموجود في آخر). كما هو موضح أدناه ، يستكشف GlyConnect Octopus الارتباطات بين الكيانات المختلفة المخزنة في قاعدة البيانات من خلال تسليط الضوء على اتصالات متعددة أو مفردة كانعكاس لمحتوى قاعدة البيانات.
    1. قم بإجراء بحث GlyConnect Octopus لتأكيد وجود سمات هيكلية مشتركة مثل الهياكل الأساسية الهجينة والهياكل المحتوية على حمض السياليك المتكررة للغاية في تنوع الجليكان المرتبط ب PSA ، كما هو موضح أدناه.
    2. انتقل إلى الصفحة الرئيسية للأخطبوط https://glyconnect.expasy.org/octopus/. احتفظ بعلامة التبويب المرتبطة ب N محددة بشكل افتراضي. انتقل إلى علامة التبويب الفرعية النوى وانقر على أيقونة الهجين . انتقل إلى علامة التبويب الفرعية خصائص وانقر على أيقونة Sialylated . انقر على زر البحث الأخضر أدناه.
      ملاحظة: يتم عرض نتائج البحث بيانيا كعلاقات بين ثلاث فئات من العناصر. بشكل افتراضي ، تتطابق القائمة المركزية مع استعلام التراكيب ، وتمتد المجموعة اليسرى على البروتينات ذات الصلة ، وتمتد القائمة اليمنى على الجليكان ذي الصلة.
    3. في الرسم البياني المعروض للعلاقات، مرر مؤشر الماوس فوق H6N4F1S1 لتسليط الضوء على الروابط إلى ستة بروتينات وثلاثة هياكل. قارن هذا عن طريق التحليق فوق H6N4F2S1 الذي يميز الشكلين المتماثلين ل PSA (يشار إليهما باسم UniProt ID: KLK3_HUMAN) وبنية واحدة (ID: 10996). مرر مؤشر الماوس فوق معرف الهيكل لإظهار تمثيل SNFG الخاص به وانقر فوقه لفتح الصفحة المقابلة (الشكل التكميلي 2).
    4. قم بتغيير عقد الأخطبوط إلى أي موضوع آخر يصف سياق الغليكوزيل. ويظل رمز اللون كما هو موضح سابقا (انظر الجدول 1).
      1. قم بتغيير العقد المركزية إلى الأنسجة لعرض 15 خيارا في منتصف الرسم البياني، وكثير منها عبارة عن سوائل الجسم. ابحث عن جميع الارتباطات بين البروتينات والجليكان التي تطابق الاستعلام اعتمادا على معلومات الأنسجة. ضع المؤشر على البول أو السائل المنوي في منتصف الرسم البياني لعرض الارتباطات المختلفة (الشكل 4A,B).
      2. قم بتغيير عقد المركز إلى مرض لعرض 13 خيارا، أحدها سرطان البروستاتا. البروتين الوحيد المرتبط به هو PSA (KLK3_HUMAN) (الشكل التكميلي 3).
        ملاحظة: نظرة فاحصة على PSA N-glycome الموضحة في صفحة البروتين تحدد التردد العالي جدا ل NeuAc الطرفي (a?-?) جالون(ب?-?) البنية التحتية GlcNAc في كثير من الحالات على هياكل ذات هوائيين أو ثلاثة. يمكن إنشاء أخطبوط آخر على هذا الأساس كما هو موضح أدناه.
    5. انقر فوق الزر مسح لتحديث البحث. انتقل إلى علامة التبويب الفرعية خصائص وانقر على أيقونة الهوائي الثنائي . انتقل إلى علامة التبويب الفرعية المحددات وانقر على أيقونة 3-Sialyl-LN (النوع 2 ). انقر على زر البحث الأخضر أدناه.
    6. تحقق من ارتباطات الأخطبوط المستردة مع جليكان ثنائي الهوائي يحتوي على زخارف طرفية 3-Sialyl-LN (النوع 2) ، أي NeuAc (a1-3) Gal (b1-4) GlcNAc. قم بتغيير العقد المركزية إلى الأنسجة لتسهيل القراءة ومرر مؤشر الماوس فوق KLK3_HUMAN لتوصيل السائل المنوي مباشرة بالشكل المتماثل الشائع PSA وسبعة هياكل (الشكل التكميلي 4).
      ملاحظة: تقوم أداة التصور الثانية ، GlyConnect Compozitor ، بإجراء مسح للعلاقات المحتملة بين كل تكوين في قائمة منه (انظر أدناه). يتم تعريف العلاقة على أنها تختلف عن واحد فقط من السكريات الأحادية بين تركيبتين. هذه العلاقات المحددة التي تم رسمها في رسم بياني تكشف عن (تعطيل) استمرارية الغليكوم.
    7. استخدم GlyConnect Compozitor لإجراء مسح للعلاقات المحتملة بين كل تركيبة في قائمتها ، كما هو موضح أدناه لحالة PSA.
      ملاحظة: يعالج GlyConnect Compozitor التراكيب بالاقتران مع سياق. يوفر علامات تبويب متميزة للاستعلام عن GlyConnect ، على سبيل المثال ، البروتينات والمصادر وخطوط الخلايا والأمراض التي لا تحتاج إلى شرح لتأهيل السياق. ويتضح ذلك هنا مع PSA على النحو التالي.
    8. ارجع إلى صفحة البروتين في PSA: https://glyconnect.expasy.org/browser/proteins/790. على الجانب الأيمن من صفحة إدخال PSA ، انقر فوق الارتباط Compozitor. تأكد من أن حقول البحث Compozitor مملوءة مسبقا بتفاصيل إدخال Id 790 في علامة التبويب البروتين (البروتين: مستضد البروستاتا الخاص ، الأنواع: الإنسان العاقل ، ونوع الجليكان: N-linked).
    9. انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد لاسترداد البيانات من قاعدة البيانات وعرض الرسم البياني للتركيبات المتصلة. قم بإلغاء تحديد الخيار تضمين العقد الظاهرية . انقر فوق الزر Compute Graph لعرض رسم بياني يعرض مجموعة متصلة جيدا من 78 تركيبة تمثل PSA N-glycome ، ومخطط شريط يوضح الخصائص الرئيسية للجليكان.
    10. مرر مؤشر الماوس فوق الشريط الأرجواني في مخطط الشريط ، والذي يحدد موقع جميع الهياكل السياليل في الرسم البياني للكشف عن تحيز يمكن ملاحظته نحو الهياكل السياليلية.
    11. ابق في علامة التبويب الرئيسية البروتين وحدد مستضد البروستاتا الخاص - ارتفاع Pi isoform (psah) في حقل البروتين (الاسم).
      ملاحظة: يتم ملء الحقلين نوع الجليكان وموقع غليكان تلقائيا.
    12. انقر فوق الزر " إضافة إلى التحديد" لاسترداد البيانات من قاعدة البيانات التي تصل إلى 57 تركيبة. انقر فوق الزر " حساب الرسم البياني" لإنشاء الرسوم البيانية المتراكبة لكل من الأشكال المتساوية وتقييم الاختلافات في glycome لشكلي PSA isoforms. مرر مؤشر الماوس فوق تسميات العقدة للمطالبة بعرض عدد الهياكل المقابلة للتركيبات / التسميات (الشكل 5).
  4. معلومات ربط الجليكان في UniLectin
    ملاحظة: تذكر المحدد الذي تم اختباره في الأخطبوط ، الموصوف باسم NeuAc (a2-3) Gal (b1-4). بحكم التعريف ، فهو جزء ملزم راسخ من بنية غليكان ، وعلى هذا النحو ، يمكن البحث عنه في قاعدة بيانات UniLectin3D25.
    1. انتقل إلى https://www.unilectin.eu/ وانقر على زر UniLectin3D . بدلا من ذلك ، انتقل مباشرة إلى الصفحة: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/.Click على زر البحث في Glycan لفتح هذه الصفحة: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/glycan_search (الشكل التكميلي 6).
    2. انقر فوق الماس الأرجواني الذي يمثل حمض السياليك ، والذي يدفع إلى عرض جميع الزخارف المرتبطة بالجليكان والتي تنتهي بحمض السياليك المخزن في قاعدة البيانات. يحتوي الجزء العلوي من هذه المجموعة من الزخارف على زخارف NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc التي تم التحقيق فيها سابقا (الشكل التكميلي 7).
    3. انقر فوق الشكل NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc للمطالبة بعرض جميع الليكتينات التي يعرف بها هيكل ثلاثي الأبعاد يؤكد التفاعل مع NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc . تظهر النتيجة افتراضيا الليكتين في جميع الأنواع. استخدم الخيار البحث حسب الحقل لقصر العرض على المعلومات التي تركز على الإنسان.
    4. انقر فوق خيار البحث حسب الحقل . في حقل الأنواع ، اكتب Homo sapiens. انقر فوق الزر استكشاف هياكل الأشعة السينية لتصفية القائمة الأصلية. لم يتبق سوى إدخال واحد ، أي الجاليكتين البشري -8. انقر فوق الزر عرض الهيكل والمعلومات ثلاثية الأبعاد في الزاوية العلوية اليمنى من العنصر المدرج لعرض معلومات مفصلة عن تفاعل الجاليكتين-8 البشري مع NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc.
    5. الوصول إلى المعلومات الهيكلية على galectin-8 البشري المعروضة على الصفحة مع اثنين من المشاهدين المختلفين.
      1. أمسك الماوس لتحويل الجزيء وجلب الليكاند إلى المقدمة باستخدام برنامج Litemol 26 المدمج لإظهار بنية اللكتين 3D. مرر الماوس فوق أحد التفاعلات المدرجة على اليسار لتحديث العرض على اليمين وتحديد مكان عمل هذا التفاعل المعين في الهيكل باستخدام برنامج PLIP27 المدمج لتفصيل التفاعلات الذرية بين الليكتين والليجند (الشكل 6).
    6. انقر فوق أي زر أخضر يرتبط بالإدخالات المقابلة في UniProt و PDB (المواقع الأوروبية أو الأمريكية) و GlyConnect لاستكشاف هذه الإحالات التبادلية.

2. استكشاف ومقارنة O-glycome في GlyConnect

  1. تصفح مجموعة بيانات تحدي HGI عالية الثقة
    ملاحظة: يتم تخزين مجموعة بيانات HGI المذكورة في المقدمة في قاعدة بيانات GlyConnect. أنه يحتوي على 163 N- و 23 O-glycopeptides وجدت في 37 البروتينات السكرية تعتبر قائمة ثقة عالية. GlyConnect Compozitor28 هو المفتاح لتقييم اتساق بيانات glycome. الأهم من ذلك ، يسمح Compozitor بالعقد الافتراضية (الموضحة باللون الرمادي) عند الحاجة إلى خطوة وسيطة واحدة فقط لتوصيل العقد المعزولة. وبهذه الطريقة ، تشدد العقد الافتراضية الرسم البياني ويمكن تفسيرها على أنها هياكل يحتمل أن تكون مفقودة في النتائج التجريبية.
    1. تصفح مجموعة بيانات HGI من الصفحة الرئيسية ل GlyConnect بالانتقال مباشرة إلى الصفحة المرجعية للمقالة: https://glyconnect.expasy.org/browser/references/2943.
      ملاحظة: يعكس الملخص الموجود في الأزرار الملونة جزئيا الأرقام الواردة في المقالة. ومع ذلك ، إذا تم سرد 69 ببتيدا فريدا فقط ، فإن هذا يعكس ارتباطات متعددة بين الببتيدات والمواقع أو الهياكل. في المقالة ، يتم تعريف glycopeptide على أنه مزيج فريد من الببتيد والتكوين. في GlyConnect ، يتم النظر في الجليكوسات أولا ، ويتم وصفها بأنها مزيج من الببتيد مع الهياكل. هذا ما يفسر التناقض في الأرقام بين GlyConnect والاقتباس أعلاه.
    2. تحقق من التردد العالي لحدوث التراكيب المرتبطة ب N ، مثل Hex:5 HexNAc:4 NeuAc:2 ، المحددة في 42 موقعا في 43 ببتيدا بدلا من التفرد المتكرر لمعظم التراكيب المرتبطة ب O المحددة في موقع واحد في 1 الببتيد.
    3. انقر على رابط Compozitor على الجانب الأيمن من صفحة إدخال المرجع لتقييم اتساق مجموعة البيانات. تأكد من أن أداة Compozitor تعالج DOI للمرجع مباشرة وتملأ حقل البحث بالمرجع = 10.1101/2021.03.14.435332 في علامة التبويب خيارات متقدمة من الأداة. اكتب &glycan_type=O-linked بعد رقم DOI لتضييق نطاق البحث إلى الجليكان المرتبط ب O، بحيث يصبح الاستعلام: المرجع = 10.1101/2021.03.14.435332&glycan_
      type=O-linked
    4. انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد لاسترداد البيانات من قاعدة البيانات (هناك 20 تركيبة مرتبطة ب O). احتفظ بالخيار تضمين العقد الظاهرية محددا. انقر فوق الزر " حساب الرسم البياني" لعرض الرسم البياني للتركيبات المتصلة. تسلط هذه النتيجة الضوء على العديد من الثغرات في الاستمرارية المتوقعة للتخليق الحيوي للجليكان مع تسع عقد افتراضية مطلوبة لإكمال الرسم البياني (الشكل 7).
  2. مقارنة مع O-glycome من بروتين مصل مختار في GlyConnect
    ملاحظة: لتقييم ما إذا كان يمكن سد الفجوات عن طريق البيانات المخزنة في GlyConnect ، تم اختيار بروتين O-glycosylated واحد من أصل 37 مدرجا مع المرجع. في مجموعة البيانات ، تم الإبلاغ عن السلسلة الثقيلة لمثبطات Inter-alpha-trypsin H4 (Q14624) على أنها O-glycosylated على Thr-725.
    1. انتقل إلى علامة التبويب البروتين في GlyConnect Compozitor (راجع الخطوة 2.1.3). من قائمة البروتين، حدد السلسلة الثقيلة المثبطة للتربسين بين ألفا والتريبسين H4. تأكد من أن اختيار الأنواع هو الإنسان العاقل بشكل افتراضي. قم بإلغاء تحديد N المرتبط في نوع Glycan. حدد Thr-725 فقط في قائمة المواقع بالنقر أولا على علامة الطرح الموجودة على يسار الموقع لإلغاء تحديد جميع المواقع ، ثم تحديد Thr-725 فقط من القائمة.
    2. انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد (لاحظ أن ستة تركيبات مرتبطة ب Thr-725). انقر فوق الزر " حساب الرسم البياني" لعرض الرسم البياني للتركيبات المتصلة (الشكل التكميلي 8).
    3. راقب الرسم البياني المعروض، الذي يوضح 17 تركيبة فريدة من أصل 20 تركيبة مرتبطة بحرف O لمجموعة بيانات المقالة باللون الأزرق وثلاثة تركيبات فريدة من أصل ستة في قاعدة البيانات باللون الأحمر. وبعبارة أخرى ، فإن التداخل بين المصدرين موجود في ثلاثة تركيبات ممثلة باللون الأرجواني. لاحظ أنه يتم إنشاء دوران 45 درجة للرسم البياني تلقائيا.
      ملاحظة: يتم تقليل عدد العقد الظاهرية بمقدار واحد. وكما اتضح، فإن H2N2S1 المفقود في 20 تركيبة مرتبطة ب O لمجموعة بيانات المقالة والممثلة كعقدة افتراضية مملوء الآن بتركيبة إضافية مرتبطة ب Thr-725 من السلسلة الثقيلة لمثبطات Inter-alpha-trypsin H4 في قاعدة البيانات. وهذا يبسط طوبولوجيا الرسم البياني لأن عقدتين افتراضيتين أخريين أخريين تصبحان عديمي الفائدة لأنهما كانتا خيارين بديلين لسد الفجوة بين H1N2S1 وH2N2S2. ومع ذلك، فإن التركيب الثاني المستورد من قاعدة البيانات سيتم عزله لولا إنشاء عقدتين افتراضيتين بديلتين جديدتين H2N2F1S1 و H1N2F2S1.
    4. لفهم العقد الافتراضية ، تحقق مما إذا كانت التراكيب المقابلة موجودة في GlyConnect. للقيام بذلك ، انقر فوق الزر تصدير أسفل الرسم البياني. حدد افتراضي فقط عن طريق إلغاء تحديد جميع الخيارات الأخرى. انقر على أيقونة الحافظة لنسخ مجموعة من 8 مؤلفات.
    5. الصق التحديد في نافذة الاستعلام في علامة التبويب مخصص في Compozitor . حدد O المرتبط في الحقل نوع Glycan . قم بتعيين تسمية التحديد في حقل التراكيب إلى، على سبيل المثال، VN لتسمية قائمة 8 تركيبات. انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد ، ثم على زر حساب الرسم البياني . يتم الآن عرض جميع العقد الظاهرية كعقد خضراء (الشكل 8).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهر الجزء الأول من البروتوكول (القسم 1) كيفية التحقيق في خصوصية أو شيوع N-glycans المرفقة على Asn-69 من مستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) باستخدام منصة GlyConnect. تم التأكيد على الاختلافات المعتمدة على الأنسجة (البول والسائل المنوي) ، وكذلك الاختلافات المعتمدة على الشكل المتماثل (الطبيعي والعالي pI) في التعبير الجلايكان ، باستخدام أداتين للتصور (الشكل 4 والشكل 5).

أولا ، وفر GlyConnect Octopus ، الذي يعرض الارتبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GlyConnect الأخطبوط كأداة للكشف عن الارتباطات غير المتوقعة
تم تصميم GlyConnect Octopus في الأصل للاستعلام عن قاعدة البيانات مع تعريف فضفاض للجليكان. في الواقع ، غالبا ما تشير الأدبيات إلى الخصائص الرئيسية للجليكان في الغليكوم مثل كونها فوكوسيلات أو سياليل ، كونها مصنوعة من هوائين أو أكثر ، إلخ. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف الجليكان سواء كان مرتبطا ب N أو O في النوى ، كما هو مفصل في الدليل المرجعي Essentials of Glycobiology1 ، والتي غالبا ما يتم الاستشهاد بها أيضا في المقالات المنش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلف بحرارة بالأعضاء السابقين والحاليين في مجموعة Proteome Informatics Group المشاركين في تطوير الموارد المستخدمة في هذا البرنامج التعليمي ، وعلى وجه التحديد ، جوليان ماريثوز وكاثرين هايز ل GlyConnect ، وفرانسوا بونارديل ل UniLectin ، و Davide Alocci ، و Frederic Nikitin للأخطبوط ، و Thibault Robin ل Compozitor واللمسة الأخيرة على الأخطبوط.

وتدعم الحكومة الاتحادية السويسرية تطوير مشروع glyco@Expasy من خلال أمانة الدولة للتعليم والبحث والابتكار، وتكمله حاليا المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF: 31003A_179249). يتم الحفاظ على ExPASy من قبل المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية واستضافته في مركز كفاءة تكنولوجيا المعلومات الحيوية. كما يعترف المؤلف بآن إمبرتي لتعاونها المتميز على منصة UniLectin المدعومة بشكل مشترك من قبل ANR PIA Glyco@Alps (ANR-15-IDEX-02) ، والصناديق المشتركة ل Alliance Campus Rhodanien (http://campusrhodanien.unige-cofunds.ch) Labex Arcane / CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

اتصال مستخدم متصفح الويب

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بالإنترنت اختيار
المستخدم الإصدار الأخير مناختيار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spring Harbor Laboratory Press. Essentials of Glycobiology. , Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (2015).
  2. Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the carbohydrate sequencing challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
  3. Tsuchiya, S., Yamada, I., Aoki-Kinoshita, K. F. GlycanFormatConverter: a conversion tool for translating the complexities of glycans. Bioinformatics. 35 (14), 2434-2440 (2018).
  4. Fujita, A., et al. The international glycan repository GlyTouCan version 3.0. Nucleic Acids Research. 49, 1529-1533 (2021).
  5. Alocci, D., et al. GlyConnect: glycoproteomics goes visual, interactive, and analytical. Journal of Proteome Research. 18 (2), 664-677 (2019).
  6. York, W. S., et al. GlyGen: computational and informatics resources for glycoscience. Glycobiology. 30 (2), 72-73 (2020).
  7. Watanabe, Y., Aoki-Kinoshita, K. F., Ishihama, Y., Okuda, S. GlycoPOST realizes FAIR principles for glycomics mass spectrometry data. Nucleic Acids Research. 49, 1523-1528 (2020).
  8. Campbell, M. P., Aoki-Kinoshita, K. F., Lisacek, F., York, W. S., Packer, N. H. Glycoinformatics. Essentials of Glycobiology. , (2015).
  9. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100060(2021).
  10. Mariethoz, J., Hayes, C., Lisacek, F. Glycan compositions with Compozitor to enhance glycopeptide identification. Proteomics Data Analysis. 2361, 109-127 (2021).
  11. Kawahara, R., et al. Communityevaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies of serum glycopeptide analysis. Nature Methods. 18, 1304-1316 (2021).
  12. Lisacek, F., Aoki-Kinoshita, K. F., Vora, J. K., Mazumder, R., Tiemeyer, M. Glycoinformatics resources integrated through the GlySpace Alliance. Comprehensive Glycoscience. 1, 507-521 (2021).
  13. Mariethoz, J., et al. Glycomics@ExPASy: bridging the gap. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
  14. Duvaud, S., et al. Expasy, the swiss bioinformatics resource portal, as designed by its users. Nucleic Acids Research. 49, 216-227 (2021).
  15. The UniProt Consortium et al. UniProt: the universal protein knowledgebase in 2021. Nucleic Acids Research. 49, 480-489 (2021).
  16. Bonnardel, F., Perez, S., Lisacek, F., Imberty, A. Structural database for lectins and the UniLectin web platform. Lectin Purification and Analysis. 2132, 1-14 (2020).
  17. Neelamegham, S., et al. Updates to the symbol nomenclature for glycans guidelines. Glycobiology. 29 (9), 620-624 (2019).
  18. Sharon, N. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Nomenclature of glycoproteins, glycopeptides and peptidoglycans: JCBN recommendations 1985. Glycoconjugate Journal. 3 (2), 123-133 (1986).
  19. Harvey, D. J., et al. Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N- and O-linked carbohydrates and related compounds. Proteomics. 9 (15), 3796-3801 (2009).
  20. Song, E., Mayampurath, A., Yu, C. -Y., Tang, H., Mechref, Y. Glycoproteomics: identifying the glycosylation of prostate specific antigen at normal and high isoelectric points by LC-MS/MS. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5570-5580 (2014).
  21. Moran, A. B., et al. Profiling the proteoforms of urinary prostate-specific antigen by capillary electrophoresis - mass spectrometry. Journal of Proteomics. 238, 104148(2021).
  22. Wang, W., et al. High-throughput glycopeptide profiling of prostate-specific antigen from seminal plasma by MALDI-MS. Talanta. 222, 121495(2021).
  23. wwPDB consortium metal. Protein Data Bank: the single global archive for 3D macromolecular structure data. Nucleic Acids Research. 47, 520-528 (2019).
  24. Sehnal, D., Grant, O. C. Rapidly display glycan symbols in 3D structures: 3D-SNFG in LiteMol. Journal of Proteome Research. 18 (2), 770-774 (2019).
  25. Bonnardel, F., et al. UniLectin3D, a database of carbohydrate binding proteins with curated information on 3D structures and interacting ligands. Nucleic Acids Research. 47, 1236-1244 (2019).
  26. Sehnal, D., et al. LiteMol suite: interactive web-based visualization of large-scale macromolecular structure data. Nature Methods. 14 (12), 1121-1122 (2017).
  27. Salentin, S., Schreiber, S., Haupt, V. J., Adasme, M. F., Schroeder, M. PLIP: fully automated protein-ligand interaction profiler. Nucleic Acids Research. 43, 443-447 (2015).
  28. Robin, T., Mariethoz, J., Lisacek, F. Examining and fine-tuning the selection of glycan compositions with GlyConnect Compozitor. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (10), 1602-1618 (2020).
  29. Compagno, D., et al. Glycans and galectins in prostate cancer biology, angiogenesis and metastasis. Glycobiology. 24 (10), 899-906 (2014).
  30. Gentilini, L. D., et al. Stable and high expression of Galectin-8 tightly controls metastatic progression of prostate cancer. Oncotarget. 8 (27), 44654-44668 (2017).
  31. Schwämmle, V., Verano-Braga, T., Roepstorff, P. Computational and statistical methods for high-throughput analysis of post-translational modifications of proteins. Journal of Proteomics. 129, 3-15 (2015).
  32. Khatri, K., Klein, J. A., Zaia, J. Use of an informed search space maximizes confidence of site-specific assignment of glycoprotein glycosylation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (2), 607-618 (2017).
  33. Sztain, T., et al. A glycan gate controls opening of the SARS-CoV-2 spike protein. Nature Chemistry. 13, 963-968 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

N O GlyConnect UniLectin3D

مقالات ذات صلة