تطوير المواد العضوية من الغدة النخامية الفأر كما في المختبر نموذج لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية

Emma Laporte; Charlotte Nys; Hugo Vankelecom

doi:10.3791/63431

مقالة منهجية

تطوير المواد العضوية من الغدة النخامية الفأر كما في المختبر نموذج لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية

DOI:

10.3791/63431

⸱

فبراير 25, 2022

Emma Laporte^*¹ , Charlotte Nys^*¹ , Hugo Vankelecom¹

¹Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة النخامية هي المنظم الرئيسي لنظام الغدد الصماء في الجسم. تصف هذه المقالة تطور المواد العضوية من الغدة النخامية للفأر كنموذج 3D جديد في المختبر لدراسة مجموعة الخلايا الجذعية في الغدة التي لا تزال البيولوجيا والوظيفة غير مفهومة بشكل جيد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة النخامية هي الغدة الصماء الرئيسية التي تنظم العمليات الفسيولوجية الرئيسية ، بما في ذلك نمو الجسم ، والتمثيل الغذائي ، والنضج الجنسي ، والتكاثر ، والاستجابة للإجهاد. منذ أكثر من عقد من الزمان ، تم تحديد الخلايا الجذعية في الغدة النخامية. ومع ذلك ، على الرغم من تطبيق مناهج المعدلة وراثيا في الجسم الحي ، إلا أن نمطها الظاهري والبيولوجيا ودورها لا يزال غير واضح. لمعالجة هذا اللغز ، تم تطوير نموذج عضوي جديد ومبتكر في المختبر لكشف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية بعمق. تمثل المواد العضوية هياكل الخلايا 3D التي ، في ظل ظروف ثقافة محددة ، تتطور ذاتيا من الخلايا الجذعية (الظهارية) للأنسجة وتلخص علامات مميزة متعددة لتلك الخلايا الجذعية وأنسجتها. يظهر هنا أن المواد العضوية المشتقة من الغدة النخامية للفئران تتطور من الخلايا الجذعية للغدة وتلخص بأمانة خصائصها الظاهرية والوظيفية في الجسم الحي . من بين أمور أخرى ، فإنها تعيد إنتاج حالة تنشيط الخلايا الجذعية كما هو الحال في الجسم الحي التي تحدث استجابة للضرر الموضعي المعدل وراثيا. المواد العضوية قابلة للتوسع على المدى الطويل مع الاحتفاظ بقوة بنمطها الظاهري الجذعي. ويعد النموذج البحثي الجديد ذا قيمة عالية لفك رموز النمط الظاهري للخلايا الجذعية وسلوكها خلال الظروف الرئيسية لإعادة تشكيل الغدة النخامية، بدءا من نضج حديثي الولادة إلى التلاشي المرتبط بالشيخوخة، ومن الغدد الصحية إلى الغدد المريضة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإنشاء المواد العضوية المشتقة من الغدة النخامية للفئران ، والتي توفر أداة قوية للغوص في عالم الخلايا الجذعية النخامية الغامض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغدة النخامية هي غدة صماء صغيرة تقع في قاعدة الدماغ ، حيث ترتبط بمنطقة ما تحت المهاد. تدمج الغدة المدخلات الطرفية والمركزية (تحت المهاد) لتوليد إطلاق هرمون مضبوط ومنسق ، وبالتالي تنظيم أعضاء الغدد الصماء المستهدفة في المصب (مثل الغدد الكظرية والغدد التناسلية) لإنتاج الهرمونات المناسبة في الوقت المناسب. الغدة النخامية هي المنظم الرئيسي لنظام الغدد الصماء ، وبالتالي يطلق عليها بحق الغدة الرئيسية¹.

تتكون الغدة النخامية للفأر من ثلاثة فصوص (الشكل 1) ، أي الفص الأمامي (AL) ، والفص الوسيط (IL) ، والفص الخلفي (PL). الغدد الصماء الرئيسية AL يحتوي على خمسة أنواع من الخلايا الهرمونية, بما في ذلك somatotropes التي تنتج هرمون النمو (GH); اللاكتوتروبات التي تولد البرولاكتين (PRL) ؛ القشرية التي تفرز هرمون قشر الكظر (ACTH) ؛ الثيروتروب المسؤول عن إنتاج هرمون تحفيز الغدة الدرقية (TSH) ؛ والغدد التناسلية التي تصنع الهرمون الملوتن (LH) والهرمون المنبه للجريب (FSH). يتكون PL من إسقاطات محورية من منطقة ما تحت المهاد حيث يتم تخزين هرمونات الأوكسيتوسين وفاسوبريسين (هرمون مضاد لإدرار البول). يقع IL بين AL و PL ويضم الميلانوتروب التي تنتج هرمون تحفيز الخلايا الصباغية (MSH). في الغدة النخامية البشرية ، يتراجع IL أثناء التطور ، وتنتشر الميلانوتروب داخل AL¹. بالإضافة إلى خلايا الغدد الصماء ، تحتوي الغدة النخامية أيضا على مجموعة من الخلايا الجذعية ، تتميز بشكل أساسي بعامل النسخ SOX2 2,3,4,5,6. تقع خلايا SOX2⁺ هذه في المنطقة الهامشية (MZ) ، البطانة الظهارية للشق (تجويف بقايا جنينية بين AL و IL) ، أو تنتشر كمجموعات في جميع أنحاء حمة AL ، مما يقترح اثنين من منافذ الخلايا الجذعية في الغدة (الشكل 1) ²،³،⁴^،⁵^،⁶.

بالنظر إلى الطبيعة التي لا غنى عنها للغدة النخامية ، يرتبط خلل في الغدة بأمراض خطيرة. يمكن أن يحدث فرط الغدة النخامية (الذي يتميز بالإفراط في إفراز واحد أو أكثر من الهرمونات) وقصور الغدة النخامية (إنتاج معيب أو مفقود لواحد أو أكثر من الهرمونات) بسبب أورام الغدد الصماء العصبية النخامية (PitNETs ؛ على سبيل المثال ، الأورام المنتجة ل ACTH التي تؤدي إلى مرض كوشينغ) أو بسبب العيوب الوراثية (على سبيل المثال ، نقص هرمون النمو مما يؤدي إلى التقزم)⁷. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جراحة الغدة النخامية (على سبيل المثال ، لإزالة الأورام) ، والالتهابات (على سبيل المثال ، السل تحت المهاد والغدة النخامية ، أو العدوى التي تلي التهاب السحايا الجرثومي أو التهاب الدماغ) ، ومتلازمة شيهان (نخر بسبب عدم كفاية تدفق الدم بسبب فقدان الدم الشديد عند الولادة) ، وسكتة الغدة النخامية وإصابة الدماغ الرضحية هي أسباب مهمة أخرى لنقص وظائف الغدة النخامية⁸ . وقد تبين أن الغدة النخامية للفأر تمتلك القدرة التجديدية ، حيث تكون قادرة على إصلاح الضرر المحلي الناجم عن الاستئصال المعدل وراثيا لخلايا الغدد الصماء ^9,10. تتفاعل الخلايا الجذعية SOX2⁺ بشكل حاد مع الإصابة التي تظهر نمطا ظاهريا نشطا ، يتميز بانتشار معزز (مما يؤدي إلى توسع الخلايا الجذعية) وزيادة التعبير عن العوامل والمسارات المرتبطة بالجذعية (على سبيل المثال ، WNT / NOTCH). علاوة على ذلك ، تبدأ الخلايا الجذعية في التعبير عن الهرمون المبتور ، مما يؤدي في النهاية إلى استعادة كبيرة لمجموعة الخلايا المستنفدة على مدى الأشهر التالية (5 إلى 6) ^9,10. أيضا ، خلال مرحلة نضج حديثي الولادة للغدة (أول 3 أسابيع بعد الولادة) ، تزدهر الخلايا الجذعية النخامية في حالة تنشيط 6,11,12,13 ، في حين ترتبط الشيخوخة العضوية بانخفاض وظائف الخلايا الجذعية في الموقع ، بسبب زيادة البيئة الالتهابية (الدقيقة) عند الشيخوخة (أو "الالتهاب")^10,14 . بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط تكوين الورم في الغدة أيضا بتنشيط الخلايا الجذعية ^7,15. على الرغم من اكتشاف تنشيط الخلايا الجذعية في العديد من حالات إعادة تشكيل الغدة النخامية (تمت مراجعتها في ^7,16) ، إلا أن الآليات الأساسية لا تزال غير واضحة. نظرا لأن النهج في الجسم الحي (مثل تتبع النسب في الفئران المعدلة وراثيا) لم تقدم صورة واضحة أو شاملة للخلايا الجذعية للنخامة ، فإن تطوير نماذج موثوقة في المختبر لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية في الغدة النخامية الطبيعية والمريضة أمر ضروري. لا تزال الزراعة القياسية في المختبر للخلايا الجذعية الأولية للنخامة غير كافية بسبب قدرة النمو المحدودة للغاية والظروف غير الفسيولوجية (2D) مع الفقدان السريع للنمط الظاهري (للحصول على نظرة عامة أكثر تفصيلا ، انظر¹⁶). تم إنشاء مزارع المجال ثلاثي الأبعاد (pituispheres) من الخلايا الجذعية النخامية كما تم تحديدها من قبل السكان الجانبيين والنمط الظاهري SOX2 ⁺ ^2,3,4. تنمو البيتيسفير بشكل مستنسخ من الخلايا الجذعية ، وتعبر عن علامات الجذعية وتظهر قدرة التمايز في أنواع خلايا الغدد الصماء. ومع ذلك ، فإنها لا تتوسع بشكل كبير بينما تظهر فقط قابلية مرور محدودة (2-3 مقاطع) ^3,4. كما تم الحصول على هياكل تشبه الكرة من مجموعات الخلايا الجذعية النخامية غير المنفصلة عند استزراعها في 50٪ من Matrigel المخفف لمدة أسبوع واحد ، ولكن لم تظهر قابلية التوسع¹⁷. يستخدم نهج البيتوسفير في الغالب كأداة قراءة لأعداد الخلايا الجذعية ، ولكن التطبيقات الأخرى محدودة بقدرة توسع أقل شأنا¹⁶.

لمعالجة هذه العيوب والتغلب عليها ، تم مؤخرا إنشاء نموذج 3D جديد ، أي المواد العضوية ، بدءا من AL الغدد الصماء الرئيسية للفئران التي تحتوي على MZ والخلايا الجذعية المتني. وقد تبين أن المواد العضوية مشتقة بالفعل من الخلايا الجذعية للغدة النخامية وتلخص بأمانة نمطها الظاهري¹⁸. علاوة على ذلك ، فإن المواد العضوية قابلة للتوسع على المدى الطويل ، مع الحفاظ بقوة على طبيعتها الجذعية. لذلك ، فإنها توفر طريقة موثوقة لتوسيع الخلايا الجذعية الأولية للنخامة للاستكشاف العميق. مثل هذا الاستكشاف غير قابل للتحقيق مع العدد المحدود من الخلايا الجذعية التي يمكن عزلها من الغدة النخامية ، والتي هي أيضا غير قابلة للتوسيع في ظروف ثنائية الأبعاد¹⁶. وقد تبين أن المواد العضوية هي أدوات قيمة وموثوقة للكشف عن ميزات الخلايا الجذعية النخامية الجديدة (يمكن ترجمتها إلى الجسم الحي)¹⁴^،¹⁸. الأهم من ذلك ، أن النموذج العضوي يعكس بأمانة حالة تنشيط الخلايا الجذعية النخامية كما يحدث أثناء تلف الأنسجة المحلية ونضج حديثي الولادة ، مما يدل على تعزيز كفاءة التكوين وتكرار المسارات الجزيئية غير المنظمة¹⁴^،¹⁸. وبالتالي ، فإن نموذج العضوية المشتق من الغدة النخامية هو نموذج بحثي مبتكر وقوي لبيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية بالإضافة إلى أداة قراءة تنشيط الخلايا الجذعية.

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل إنشاء المواد العضوية المشتقة من الغدة النخامية للفئران. تحقيقا لهذا الهدف ، يتم عزل AL وفصله إلى خلايا مفردة ، والتي يتم تضمينها في مصفوفة محاكاة خارج الخلية Matrigel (يشار إليها هنا باسم ECM). ثم يتم استزراع مجموعة الخلايا ECM في وسط محدد ، يحتوي بشكل أساسي على عوامل نمو الخلايا الجذعية ومنظمات الغدة النخامية الجنينية (يشار إليها أيضا باسم "وسط الغدة النخامية" العضوي (PitOM)¹⁸ ؛ الجدول 1). بمجرد اكتمال تطوير المواد العضوية (بعد 10-14 يوما) ، يمكن توسيعها بشكل أكبر من خلال المرور المتسلسل للحوض الصغير وإخضاعها لاستكشاف مكثف في اتجاه المصب (على سبيل المثال ، التألق المناعي ، RT-qPCR ، والنسخ السائبة أو أحادية الخلية ؛ الشكل 1). على المدى الطويل ، من المتوقع أن تمهد الخلايا الجذعية النخامية العضوية الطريق لنهج إصلاح الأنسجة والطب التجديدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات لهذه الدراسة من قبل لجنة KU Leuven الأخلاقية للتجارب على الحيوانات (P153/2018). تم إيواء جميع الفئران في منشأة الحيوانات في الجامعة في ظل ظروف موحدة (درجة حرارة ثابتة تبلغ 23 ± 1.5 درجة مئوية ، والرطوبة النسبية 40٪ -60٪ ، ودورة نهارية / ليلية من 12 ساعة) ، مع إمكانية الوصول إلى الماء والغذاء بشكل خاص.

1. الفئران

استخدم سلالات الماوس المتاحة تجاريا، مثل الفئران C57BL/6J، من سن الشباب البالغين (8-12 أسبوعا). بشكل عام ، توفر 2-3 فئران عددا كافيا من خلايا AL للبروتوكول.

2. عزل وتفكك الماوس AL

ملاحظة: يتم إعداد المتوسط A و B و C مقدما^19,20. وترد التراكيب في الجدول 2.

عزل الفأر AL
1. القتل الرحيم للفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ ، يليه قطع الرأس (الشكل 2 أ). اغسل رؤوس الفئران بالماء منزوع الأيونات لإزالة الدم ورشها ب 70٪ EtOH لتوليد بيئة معقمة.
2. باستخدام أدوات جراحية معقمة ، قم بإزالة جلد الرأس بين الأذنين (الشكل 2B).
3. افتح الجمجمة وأزل الدماغ.
  1. كسر "جسر الأنف" (أي الجزء الأمامي من العظم الجبهي; الشكل 2 ب) مع مقص معقم.
  2. افتح الجمجمة أكثر باستخدام المقص ، بدءا من جسر الأنف المكسور نحو الأذنين ، على كلا الجانبين (الشكل 2C).
  3. قم بإزالة الجمجمة والدماغ باستخدام ملاقط معقمة ، دون لمس الغدة النخامية (الشكل 2D).
4. قم بإزالة الحجاب الحاجز sellae باستخدام ملاقط حادة ، دون الإضرار بالغدة النخامية. تخلص من PL و IL من AL تحت المجهر المجسم.
  ملاحظة: يتم ربط PL و IL وبالتالي إزالتهما في وقت واحد. تظهر هذه الأجزاء كأنسجة بيضاء ، مقارنة ب AL الوردي اللون (الشكل 2D).
5. اعزل AL بعناية باستخدام ملاقط حادة واجمعها في قارورة Erlenmeyer سعة 10 مل ، مملوءة ب 3 مل من A المتوسطة (انظر الجدول 2). ضع القارورة على الثلج حتى تتم معالجتها مرة أخرى.
انفصال الفأر AL
1. قم بإزالة الوسط الفائق (SN) A من قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على AL. أضف 2 مل من محلول التربسين المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بنسبة 2.5٪ واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2. بدون إزالة محلول التربسين ، أضف 2 مل من محلول DNase المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (2 ميكروغرام / مل في الوسط A ؛ معقم يتم تصفيته من خلال شبكة 0.22 ميكرومتر) ، وقم بتدوير قارورة Erlenmeyer 10 مرات. دع الغدة النخامية تغرق في القاع (~ 1 دقيقة) وقم بإزالة SN.
3. أضف 2 مل من محلول مثبط التربسين المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (0.1 مجم / مل في الوسط A ؛ معقم يتم تصفيته من خلال شبكة 0.22 ميكرومتر) واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دع الرواسب النخامية إلى القاع وقم بإزالة SN.
4. أضف 2 مل من الوسط B المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (انظر الجدول 2) واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بدون إزالة SN ، أضف 2 مل من درجة الحرارة المسبقة (37 درجة مئوية) متوسطة C (انظر الجدول 2) واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
5. دع الغدة النخامية تغرق في القاع وإزالة SN. شطف الغدة النخامية ثلاث مرات مع درجة حرارة مسبقة (37 درجة مئوية) متوسطة مئوية.
6. فصل الغدة النخامية إلى خلايا واحدة.
  1. أضف 2 مل من درجة الحرارة المسبقة (37 درجة مئوية) متوسطة C. استنشق واطرد الغدة النخامية باستخدام ماصة باستور معقمة ومصقولة باللهب عدة مرات ، حتى لا تكون الشظايا مرئية بعد الآن.
  2. انقل التعليق إلى أنبوب 15 مل مع 4.5 مل من محلول DNase المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (2 ميكروغرام / مل في الوسط A ؛ معقم التصفية من خلال شبكة 0.22 ميكرومتر). شطف Erlenmeyer ثلاث مرات مع 2 مل من درجة الحرارة المسبقة (37 درجة مئوية) متوسطة C ونقل التعليق إلى أنبوب 15 مل.
7. امزج تعليق الخلية الذي تم جمعه وقم بتصفيته من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب سعة 30 مل. شطف أنبوب 15 مل ومصفاة الخلية ثلاث مرات مع 2 مل من C المتوسطة ونقل التعليق إلى أنبوب 30 مل.
8. ضع طرف ماصة باستور الزجاجية ، المملوءة ب 2 مل من محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 3٪ (في الوسط A ؛ معقم التصفية من خلال شبكة 0.22 ميكرومتر) ، في الجزء السفلي من الأنبوب وماصة بلطف لتشكيل طبقة كثافة مرئية. جهاز طرد مركزي عند 190 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
9. قم بإزالة SN عن طريق عكس الأنبوب في حركة واحدة بطلاقة وإزالة قطرات SN المتبقية بطرف P1000. أعد تعليق حبيبة الخلية في 1 مل من DMEM / F12 المتقدم البارد (Adv DMEM / F12) وحدد كمية الخلايا باستخدام عداد الخلايا.

3. إنشاء وزراعة المواد العضوية المشتقة من AL

ملاحظة: قم بإذابة ECM على الجليد مقدما (2-3 ساعات لمدة 1 مل) واحتفظ به على الجليد طوال مدة البروتوكول.

البذر العضوي والزراعة
1. قم بالطرد المركزي لنظام تعليق AL الخلوي عند 190 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة SN. أعد تعليق بيليه الخلية في Adv DMEM/F12 باستخدام الحجم المحدد المحسوب للوصول إلى كثافة خلية تبلغ 1.1 × 10⁶ خلايا/مل.
  ملاحظة: على سبيل المثال ، إذا كان تعليق الخلية يحتوي على 500000 خلية / مل ، فيجب على المرء إعادة تعليق بيليه الخلية في 454.54 ميكرولتر من Adv DMEM / F12 للوصول إلى الكثافة المطلوبة من 1.1 × 10⁶ خلايا / مل.
2. أخرج حجم تعليق الخلايا اللازم للطلاء (وفقا للعدد المطلوب من الآبار للبذور لتطوير العضوية) وأضف ECM بنسبة 30: 70 (تعليق الخلية 30٪ (في Adv DMEM / F12 ) و 70٪ ECM). تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
  ملاحظة: على سبيل المثال ، بالنسبة لقطرة واحدة من 30 ميكرولتر (انظر الخطوة 3.1.3) ، يجب على المرء (بلطف) خلط 9 ميكرولتر من تعليق الخلية (يحتوي على ~ 10000 خلية عند أخذها من تعليق 1.1 × 10⁶ خلايا / مل) مع 21 ميكرولتر من ECM.
3. لكل بئر ، قم بإيداع قطرة 30 ميكرولتر من خليط تعليق الخلية / ECM (انظر الخطوة 3.1.2) على لوحة 48 بئرا تم تسخينها مسبقا (37 درجة مئوية). اقلب اللوحة رأسا على عقب واترك ECM يتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  ملاحظة: قم بتسخين ألواح الاستزراع مسبقا لمدة 24 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
4. أعد اللوحة إلى اتجاهها الصحيح وأضف بعناية 250 ميكرولتر من PitOM المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (انظر الجدول 1) المكمل بمثبط الصخور 10 ميكرومتر (Y-27632).
5. استمر في زراعة المواد العضوية عن طريق تغيير الوسط (الخالي من Y-27632) كل 2-3 أيام حتى تنمو المواد العضوية بالكامل ، الأمر الذي يستغرق ما بين 10-14 يوما (الشكل 3A). ثم ، تمرير المواد العضوية.
  ملاحظة: عند شفط الوسط، تأكد من عدم تعطيل قبة ECM. قم بإمالة لوحة الثقافة قليلا وإزالة الوسط من الحافة السفلية للبئر. يجب إضافة الوسط الطازج (المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية) بلطف إلى جانب البئر. إذا تم فك الالتصاق قطرات الجل ، فقم بجمع المواد العضوية وإعادة تعليقها وزراعتها مرة أخرى في قطرة ECM جديدة.
مرور عضوي
1. استنشاق الوسط بلطف وإضافة 400 ميكرولتر من Adv DMEM / F12 البارد المثلج لتفكيك ECM وجمع المواد العضوية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. يغسل مرة واحدة مع 400 ميكرولتر من الثلج البارد Adv DMEM / F12 EM. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإزالة SN بعناية وأضف 400 ميكرولتر من إنزيم TrypLE Express المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (1X). اخلطي المزيج عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات ، واحتضنيه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3. أضف 400 ميكرولتر من Adv DMEM / F12 البارد المثلج وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة SN.
4. أعد تعليق الكريات ب 100 ميكرولتر من Adv DMEM / F12 البارد ، ثم قم بتفتيت المواد العضوية عن طريق السحب بقوة لأعلى ولأسفل باستخدام طرف P200 ضيق (أي دفع الطرف الفارغ لأسفل ضد الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، لتقليل قطر فتحه) حتى يتم الحصول على شظايا عضوية (يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرومتر) (الشكل 3B).
  ملاحظة: يجب أن يحتوي خليط التفكك على شظايا عضوية في الغالب وعدد قليل من الخلايا المفردة. يؤثر التفكك القاسي للعضويات إلى خلايا مفردة سلبا على إعادة نمو المواد العضوية.
5. أضف 800 ميكرولتر من Adv DMEM / F12 وأجهزة الطرد المركزي عند 190 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة SN.
6. تمرير المواد العضوية بنسبة 1: 2 إلى 1: 4. أعد تعليق الكريات في حجم مناسب من Adv DMEM/F12 حسب الحاجة للطلاء وأضف ECM بنسبة 30:70 (تعليق خلوي بنسبة 30٪ و 70٪ ECM). تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
7. البذور وزراعة المواد العضوية كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3.1.3-3.1.5.
  ملاحظة: في المتوسط، يتطور 20 مادة عضوية لكل بئر من 10000 خلية كاملة من خلايا AL المبذرة (0.2٪). يمكن تقسيم هذه المقاطع العضوية 0 بنسبة 1: 2 ، مما يؤدي إلى تطور >50 عضويا لكل بئر (المقطع 1). يمكن بعد ذلك تقسيم المواد العضوية بنسبة 1: 2 إلى 1: 4 خلال المقاطع اللاحقة. تتباطأ إعادة نمو المواد العضوية بعد حوالي 10 مقاطع (المقابلة ل 3 أشهر من الثقافة) ، تتجسد في عضويات أقل وأصغر تدريجيا.

4. الحفظ بالتبريد للعضويات المشتقة من AL وإذابتها

الحفظ بالتبريد للمواد العضوية
1. اتبع بروتوكول المرور من الخطوة 3.2.1 حتى الخطوة 3.2.5.
2. أعد تعليق الكريات العضوية (التي تحتوي على شظايا وخلايا) مع 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد (الجدول 3). انقل التعليق إلى تبريد وضعه على الجليد.
  ملاحظة: يمكن الجمع بين المواد العضوية (أي الشظايا والخلايا الناتجة) من ما يصل إلى أربعة آبار من صفيحة 48 بئرا في بئر واحدة مبردة.
3. ضع الكريوفيالات في حاوية تجميد وانقلها إلى -80 درجة مئوية.
4. بعد 24 ساعة ، انقل العينات إلى صندوق تبريد وخزنها في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) للتخزين على المدى الطويل.
ذوبان المواد العضوية المحفوظة بالتجميد
1. قم بإزالة المبرد من خزان النيتروجين السائل وضعه على الجليد. المضي قدما على الفور مع بروتوكول الذوبان.
2. قم بإذابة المحلول بشظايا العضوية المحفوظة بالتجميد والخلايا المفردة عند 37 درجة مئوية (حمام مائي).
  ملاحظة: لا تحتفظ بالمحلول لأكثر من 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتجنب سمية الخلايا بواسطة DMSO.
3. انقل المحتوى إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 10 مل من Adv DMEM / F12 البارد مع مصل بقري جنيني بنسبة 30٪ (FBS). شطف المبرد مع 1 مل من Adv DMEM/F12 مع 30٪ FBS.
4. جهاز طرد مركزي عند 190 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الكريات مع 1 مل من Adv DMEM / F12 البارد المثلج وانقل التعليق إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق.
5. جهاز طرد مركزي عند 190 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الكريات في حجم مناسب من Adv DMEM/F12 حسب الحاجة للطلاء وأضف ECM بنسبة 30:70. تخلط جيدا عن طريق سحب لأعلى ولأسفل.
6. البذور وزراعة المواد العضوية كما هو موضح أعلاه في الخطوات 3.1.3-3.1.5.

5. التحقق من صحة المواد العضوية المشتقة من AL

جمع وتحلل المواد العضوية لعزل الحمض النووي الريبي
1. جمع وطرد مركزي المواد العضوية كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.2.1).
2. قم بإزالة SN وإضافة 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل مع 1٪ 2-mercapto-ethanol. دوامة لمدة 30 ثانية وتخزينها في -80 درجة مئوية أو المضي قدما على الفور إلى عزل الحمض النووي الريبي.
  تحذير: احذر من أن 2-mercapto-ethanol هو مركب سام. يجب أن يتم كل العمل في غطاء الدخان الكيميائي أثناء ارتداء قفازات النتريل وقناع الغبار ونظارات السلامة. 2-ميركابتو-الإيثانول يمكن أن يسبب ضررا لا رجعة فيه للعينين والجلد.
تثبيت وتضمين المواد العضوية لتلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية / التألق
1. جمع وطرد مركزي المواد العضوية كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.2.1).
2. قم بإزالة SN ، وأضف 1 مل من 4٪ paraformaldehyde (PFA) واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة).
  تحذير: PFA هو مادة مسرطنة بشرية معروفة يمكن أن تسبب أضرارا لا رجعة فيها للقرنية. يجب أن يتم كل العمل في غطاء الدخان الكيميائي. يجب دائما ارتداء قفازات النتريل ونظارات السلامة.
3. جهاز طرد مركزي عند 200 × g لمدة 5 دقائق وإزالة SN. أضف 1 مل من PBS ، واحتضن 10 دقائق في RT على شاكر مداري (100 دورة في الدقيقة) ، وجهاز طرد مركزي عند 90 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر خطوة الغسيل مرتين. يخزن في PBS عند 4 درجات مئوية.
4. لمعالجة الأنسجة والجفاف ، قم بإزالة SN وإضافة 150 ميكرولتر من هلام الأغاروز بنسبة 2٪ (في PBS) إلى الكريات العضوية باستخدام طرف p200 الموسع مسبقا (المصنوع عن طريق قطع قطعة صغيرة من الطرف). قم على الفور بسحب الحجم بالكامل وإخراجه في غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  ملاحظة: من المهم العمل بسرعة ، لأن الجل الذي يحتوي على المواد العضوية سوف يتصلب بسرعة.
5. دع الجل يتصلب بقوة لمدة 30 دقيقة وانقل قرص الجل إلى كاسيت الأنسجة. اغمر وخزن في 50٪ EtOH ، حتى الجفاف في معالج الأنسجة.
6. لتضمين البارافين ، ضع قرص الجل (باستخدام الملقط) في قالب تضمين واملأه بالبارافين الدافئ (60 درجة مئوية). ضع القوالب على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح البارافين صلبا (حوالي 45 دقيقة). يمكن تخزين هذه العينات إما عند 4 درجات مئوية أو يمكن إخضاعها على الفور للتقسيم.
7. ميكروتوم كتل البارافين التي تحتوي على المواد العضوية بسماكة 5 ميكرومتر وجمع العينات على الشرائح الزجاجية. أضف قطرة واحدة من الماء منزوع الأيونات أسفل كل قسم للسماح بالتمدد السليم للقسم ووضع الشرائح على لوحة تسخين مسطحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بتخزين الشرائح بأقسام عند 4 درجات مئوية أو استمر مباشرة في تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية أو التألق المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد عزل وتفكك AL ، يتم زرع الخلايا المفردة التي تم الحصول عليها في ECM وتنمو في PitOM (الشكل 1 ، الجدول 1). ويبين الشكل 3 ألف زراعة الخلايا وكثافتها عند البذر (اليوم 0). قد يكون بعض الحطام الصغير موجودا (الشكل 3A ، رؤوس الأسهم البيضاء) ، لكنه سيختفي عند المرور. بعد أربعة عشر يوما من البذر ، يتم تطوير المواد العضوية المشتقة من AL بالكامل (الشكل 3A). تظهر المواد العضوية مورفولوجيا كيسية ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل المواد العضوية المشتقة من AL ، كما هو موضح هنا ، نموذجا بحثيا قويا لدراسة الخلايا الجذعية النخامية في المختبر. في الوقت الحاضر ، هذا النهج العضوي هو الأداة الوحيدة المتاحة لنمو وتوسيع الخلايا الجذعية الأولية للنخامة بشكل موثوق وقوي. وقد أبلغ سابقا عن نموذج عضوي للغدة النخامية مشتق من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)، والتي تلخص عن كثب التكوين العضوي الجنيني للغدة النخامية²³؛ ومع ذلك ، على الرغم من أنه مفيد للغاية لدراسة تطور الغدة النخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من صندوق أبحاث KU Leuven وصندوق البحث العلمي (FWO) - فلاندرز. يتم دعم E.L. (11A3320N) ، و C.N. (1S14218N) من خلال زمالة الدكتوراه من FWO / FWO-SB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
48 بئر ، معالج TC ، ملفوف بشكل فردي	Costar	734-1607
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM / F12	Gibco	12634010
ألبومين البقر (درجة زراعة الخلايا) ملحق	Serva	47330
B-27 ( 50X) ، ناقص فيتامين A	Gibco	12587010
قوالب القاعدة	VWR	720-1918
Buffer RLT	Qiagen	79216
كاسيت ، مصفاة خلوية Q Path Microtwin	VWR	720-2191
، 40 & micro ؛ م شبكة ،	فالكون	352340
سم الكوليرا القابل للتصرف من Vibrio < / em>cholerae	Sigma-Aldrich	C8052
Deoxyribonuclease I من البنكرياس البقري	Sigma-Aldrich	D5025
D-glucose	Merck	108342
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM ، مسحوق ، أنابيب	الآمن من جيبكو	52100039
الجلوكوز ، 1.5 مل	شرائح التصاق Eppendorf	30120086
Epredia SuperFrost Plus شرائح التصاق	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Epredia HistoStar محطة عمل التضمين ، 220 إلى 240Vac	Thermo Fisher Scientific	12587976
الإيثانول المطلق 99.8 +٪	Thermo Fisher Scientific	10342652
مصل الأبقار الجنينية (FBS)	مكمل غذائي Sigma-Aldrich	F7524
GlutaMAX	Gibco	35050061
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HEPES Buffer Solution	Gibco	15630056
InSolution Y-27632	Sigma-Aldrich	688001
L-Glutamine (200 ملم)		من Gibco
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) ،	15505739		Corning
التجميد	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250
Nunc Biobanking and Cell Culture, Cryogenic	Tubes Thermo Fisher Scientific	375353
Paraformaldehyde للتخليق (PFA)	Merck	818715
PBS ، درجة الحموضة 7.4	Gibco	10010023
البنسلين G ملح الصوديوم	Sigma-Aldrich	P3032
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)	Gibco	15140122
الفينول الأحمر	ميرك	107241
كلوريد البوتاسيوم (KCl) ميرك		104936
بروتين EGF البشري المؤتلف ، CF	R & أنظمة D	236-EG
المؤتلف البشري FGF الأساسي / FGF2 / bFGF (157 aa) بروتين	R & أنظمة D	234-FSE
المؤتلف البشري FGF-10	Peprotech	100-26
المؤتلف البشري IGF-1	Peprotech	100-11
المؤتلف البشري IL-6	Peprotech	200-06
المؤتلف البشري	Noggin Peprotech	120-10C
المؤتلف البشري R-Spondin-1	Peprotech	120-38
المؤتلف الإنسان / الفأر FGF-8b	Peprotech	100-25
المؤتلف الماوس سونيك القنفذ / Shh (C25II) N-Terminus	R & D systems	464-SH
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
SB202190	Sigma-Aldrich	S7067
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
كلوريد الصوديوم (NaCl)	BDH	102415K
فوسفات ثنائي الهيدروجين الصوديوم 1-هيدرات	PanReac-AppliChem	A1047
الصوديوم كربونات الهيدروجين (NaHCO3)	ميرك	106329
الصوديوم البيروفات (C3H3NaO3)	سيجما ألدريتش	P5280
Stericup-GP ، 0.22 & micro ؛ m	Millipore	SCGPU02RE
Steriflip-GP وحدة تصفية علوية لأنبوب الطرد المركزي المعقم ، 0.22 & mu ؛ م	ميليبور	SCGP00525
ماء معقم	فريسينيوس	B230531
ملح كبريتات الستربتومايسين	سيجما ألدريتش	S6501
معالج الأنسجة الحراري العلمي إكسلسيور ES	12505356		الترموScientific
Titriplex III	Merck	108418
إنزيم TrypL Express (1X) ، الفينول الأحمر	الحراري فيشر ساينتفيك	12605028
مثبط التربسين من جلايسين ماكس (فول الصويا)	محلول التربسين سيجما ألدريتش	T9003
2.5٪	15090046		ثيرمو فيشر العلمي

القفل عالية مصفوفة غشاء القاعدة 25030081 الخالية من LDEV حاوية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).
Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142(2021).
Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).
Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).
Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111(2013).
Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تطوير المواد العضوية من الغدة النخامية الفأر كما في المختبر نموذج لاستكشاف بيولوجيا الخلايا الجذعية النخامية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة