يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رسم خرائط نقل الطاقة بالرنين Förster: منهجية جديدة لتوضيح الميزات الهيكلية العالمية

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

مارس 16, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

في هذه المقالة

ملخص

تفصل الدراسة منهجية رسم خرائط FRET بما في ذلك اختيار مواقع وضع العلامات ، واختيار الأصباغ ، والاقتناء ، وتحليل البيانات. هذه المنهجية فعالة في تحديد مواقع الربط ، والتغيرات التوافقية ، والحركات الديناميكية في أنظمة البروتين وهي مفيدة للغاية إذا تم تنفيذها بالاقتران مع المعلومات الهيكلية 3-D الحالية.

الملخص

نقل طاقة الرنين Förster (FRET) هي طريقة راسخة قائمة على التألق تستخدم لقياس المسافات بنجاح في الجزيئات الحيوية وبينها في المختبر وكذلك داخل الخلايا. في FRET ، ترتبط كفاءة نقل الطاقة ، التي تقاس بالتغيرات في شدة التألق أو العمر الافتراضي ، بالمسافة بين جزيئين أو ملصقات فلورية. إن تحديد الديناميكيات والتغيرات التوافقية من المسافات ليست سوى بعض الأمثلة على تطبيقات هذه الطريقة على الأنظمة البيولوجية. في ظل ظروف معينة ، يمكن لهذه المنهجية أن تضيف إلى الهياكل البلورية الحالية للأشعة السينية وتعززها من خلال توفير معلومات تتعلق بالديناميكيات والمرونة والتكيف مع الأسطح الملزمة. نحن نصف استخدام FRET وتحديد المسافة المرتبطة به لتوضيح الخصائص الهيكلية ، من خلال تحديد موقع ربط أو اتجاهات الوحدات الفرعية dimer. من خلال الاختيار الحكيم لمواقع وضع العلامات ، وغالبا ما نستخدم استراتيجيات متعددة لوضع العلامات ، نجحنا في تطبيق طرق رسم الخرائط هذه لتحديد الخصائص الهيكلية العالمية في مجمع البروتين والحمض النووي ونظام نقل البروتين SecA-SecYEG. في نظام SecA-SecYEG ، استخدمنا طرق رسم خرائط FRET لتحديد موقع ربط ما قبل البروتين وتحديد التشكيل المحلي لمنطقة تسلسل الإشارة المرتبطة. تحدد هذه الدراسة خطوات إجراء دراسات رسم الخرائط FRET ، بما في ذلك تحديد مواقع وضع العلامات المناسبة ، ومناقشة الملصقات المحتملة بما في ذلك بقايا الأحماض الأمينية غير الأصلية ، وإجراءات وضع العلامات ، وكيفية إجراء القياسات ، وتفسير البيانات.

المقدمة

بالنسبة للبروتينات ، يؤدي توضيح الديناميكيات إلى جانب المعرفة الهيكلية ثلاثية الأبعاد (3-D) إلى فهم معزز للعلاقات بين البنية والوظيفة للأنظمة الجزيئية الحيوية. تلتقط الطرق الهيكلية ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني المبرد ، بنية ثابتة وغالبا ما تتطلب تحديد هياكل متعددة لتوضيح جوانب ربط الجزيئات الحيوية وديناميكياتها1. تتناول هذه المقالة طريقة قائمة على الحلول لتعيين العناصر الهيكلية العالمية، مثل مواقع الربط أو تفاعلات الربط، التي يحتمل أن تكون أكثر عابرة وأقل سهولة في التقاطها بواسطة الطرق الثابتة. الأنظمة المرشحة القوية لهذه المنهجية هي تلك التي تم فيها تحديد بنية 3-D مسبقا بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي أو الطرق الهيكلية الأخرى. في هذه الحالة ، نستفيد من البنية البلورية للأشعة السينية لمجمع SecA-SecYEG ، وهو لاعب مركزي في مسار الإفراز العام للبروتين ، لرسم خريطة لموقع ربط ببتيد الإشارة باستخدام نقل طاقة الرنين Förster (FRET) قبل نقل البروتين المسبق عبر الغشاء2. إن التلاعب بالنظام البيولوجي من خلال التعديلات الجينية إلى جانب معرفتنا بالبنية ثلاثية الأبعاد مكن من تحديد تشكيل تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة مباشرة قبل إدخالها في القناة 3.

يتضمن FRET نقل الطاقة بدون إشعاع من جزيء واحد (مانح) إلى آخر (متقبل) بطريقة تعتمد على المسافة التي تتم عبر الفضاء 4,5. يتم رصد كفاءة هذا النقل إما من خلال انخفاض في المتبرع أو زيادة في كثافة التألق المتقبل. يمكن وصف كفاءة نقل الطاقة بأنها

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

حيث تكون قيمة R0 هي المسافة التي يكون فيها النقل فعالا بنسبة 50٪6. وقد وصفت هذه التقنية سابقا بأنها مسطرة جزيئية وهي فعالة في تحديد المسافات في نطاق 2.5-12 نانومتر، اعتمادا على هوية الأصباغ المتقبلة المانحة4،7،8،9. تسمح كثافة التألق المانحة وعمرها الافتراضي مع أو بدون المتقبل بتحديد كفاءات النقل وبالتالي ، المسافات 5,8. نظرا لتوافر التكنولوجيا ، وحساسية الطريقة ، وسهولة الاستخدام ، وجدت FRET أيضا تطبيقا واسعا في مجالات مثل التحليل الطيفي الفلوري أحادي الجزيء والمجهر البؤري6. ظهور البروتينات الفلورية مثل بروتين الفلورسنت الأخضر جعل ملاحظة الديناميكيات داخل الخلايا وتصوير الخلايا الحية سهلة نسبيا10,11. تتم مناقشة العديد من تطبيقات FRET مثل هذه بالتفصيل في هذه المشكلة الافتراضية.

في هذه الدراسة ، نركز بشكل خاص على استخدام قياسات FRET لإنتاج قيم المسافة لتحديد التفاصيل الهيكلية. في السابق ، تم استخدام قياسات FRET بشكل فعال لتحديد تكوين جزيئات الحمض النووي عند ارتباطها بالبروتين 12،13،14 ، والديناميات الداخلية للبروتينات ، وتفاعلات ربط البروتين15،16،17. تكمن مزايا هذه الطريقة في القدرة على تحديد العناصر الهيكلية المرنة والديناميكية في حل بكميات منخفضة نسبيا من المواد. بشكل ملحوظ ، هذه الطريقة فعالة بشكل خاص عند استخدامها بالاقتران مع المعلومات الهيكلية الموجودة ولا يمكن استخدامها كوسيلة لتحديد هيكل 3-D. توفر هذه الطريقة أفضل رؤية وصقل للهيكل إذا كان العمل يعتمد على المعلومات الهيكلية الموجودة غالبا ما يقترن بالمحاكاة الحسابية18,19. هنا ، يتم وصف استخدام المسافات التي تم الحصول عليها من قياسات FRET ذات الحالة الثابتة والوقت المحدد لرسم خريطة لموقع ربط ، لم يكن موقعه معروفا ، على بنية بلورية موجودة لمجمع SecA-SecYEG ، البروتينات الرئيسية في مسار الإفراز العام3.

يتوسط مسار الإفراز العام ، وهو نظام محفوظ للغاية من بدائيات النوى إلى حقيقيات النوى إلى العتائق ، نقل البروتينات إما عبر الغشاء أو داخله إلى موقعها الوظيفي في الخلية. بالنسبة للبكتيريا سالبة الجرام ، مثل الإشريكية القولونية ، الكائن الحي المستخدم في دراستنا ، يتم إدخال البروتينات في الغشاء الداخلي أو نقله عبر الغشاء الداخلي إلى periplasm. ينسق مجمع قناة SecY البكتيري (المسمى translocon) مع البروتينات الأخرى لنقل البروتين المركب حديثا ، والذي يتم توجيهه إلى موقعه الصحيح في الخلية من خلال تسلسل إشارة يقع عادة في N-terminus20,21. بالنسبة للبروتينات المرتبطة بالبيريبلازما ، يرتبط بروتين ATPase SecA بنفق خروج الريبوسوم ، ومع البروتين المسبق بعد ترجمة ما يقرب من 100 بقايا22. جنبا إلى جنب مع بروتين SecB chaperone ، فإنه يحافظ على البروتين المسبق في حالة غير مطوية. يرتبط SecA ب SecYEG translocon ، ومن خلال العديد من دورات التحلل المائي ATP ، يسهل نقل البروتين عبر الغشاء23,24.

SecA هو بروتين متعدد المجالات موجود في أشكال الخلايا والمرتبطة بالغشاء. بروتين متجانس في السيتوسول ، يتكون SecA من مجال ربط ما قبل البروتين أو الربط المتقاطع25 ، ومجالين مرتبطين بالنيوكليوتيدات ، ومجال جناح حلزوني ، ومجال سقالة حلزونية ، وإصبعين حلزوني (THF) 26،27،28،29 (الشكل 1). في الدراسات البلورية السابقة لمجمع SecA-SecYEG ، اقترح موقع THF أنه شارك بنشاط في نقل البروتين والتجارب اللاحقة للربط المتبادل مع ببتيد الإشارة ، مما زاد من أهمية هذه المنطقة في نقل البروتين30,31. أظهرت الدراسات السابقة ، باستخدام منهجية رسم الخرائط FRET ، أن ببتيدات الإشارة الخارجية ترتبط بهذه المنطقة من SecA 2,32. لفهم كامل لتكوين وموقع تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة للبروتين المسبق قبل إدخاله في قناة SecYEG ، تم إنشاء وهم البروتين الذي تم فيه ربط تسلسل الإشارة وبقايا المنطقة الناضجة المبكرة ب SecA من خلال رابط Ser-Gly (الشكل 1). باستخدام هذا البناء القابل للحياة بيولوجيا ، ثبت كذلك أن تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق ترتبط ب THF بطريقة متوازية2. وفي وقت لاحق، استخدمت منهجية رسم الخرائط FRET لتوضيح تشكيل وموقع تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة في وجود SecYEG كما هو موضح أدناه3.

سمحت لنا معرفة الهيكل ثلاثي الأبعاد لمجمع SecA-SecYEG 33,34,35 والموقع المحتمل لموقع الربط بوضع ملصقات المانحين والمتقبلين بحكمة في المواقع التي يحدد فيها تقاطع مسافات FRET الفردية موقع موقع الربط. كشفت قياسات رسم الخرائط FRET هذه أن تسلسل الإشارة والمنطقة الناضجة المبكرة من البروتين المسبق يشكلان دبوس شعر مع وجود الطرف عند فم قناة SecYEG ، مما يدل على أن بنية دبوس الشعر يتم تشكيلها قبل إدخال القناة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. اختيار مواقع وضع العلامات

  1. حدد ما لا يقل عن ثلاثة مواقع محتملة لوضع العلامات لتثليث موقع الربط المفترض على هياكل البروتين الحالية. في هذه الحالة ، تم تحديد SecA و SecYEG و preprotein المرتبطة ب SecA من خلال الاندماج الجيني2.
    1. اختر مواقع وضع العلامات ضمن 25-75 Å من موقع الربط المفترض وفي المناطق الثابتة نسبيا من البروتين ، ستحدد المسافة زوج صبغة FRET المحدد الذي سيتم استخدامه36. حدد موقع وضع العلامات في مناطق البروتين المتميزة نسبيا عن بعضها البعض ، بحيث تصف المواقع رؤوس المثلث مع موقع الربط المفترض الموجود في الوسط (الشكل 1A-D).
    2. إدخال أو تحديد بقايا السيستين (Cys) في مواقع وضع العلامات ذات الأهمية في البروتين الذي لا يحتوي على بقايا Cys أخرى ، لتحسين كفاءة وضع العلامات على الموقع المحدد37,38.
    3. إدخال الأحماض الأمينية غير الطبيعية ، على سبيل المثال ، p-azidophenylalanine لوضع العلامات مع كيمياء النقر ، من أجل تسمية بروتين واحد بشكل فعال في موقعين متميزين بأصباغ مختلفة39,40.
    4. اختبار طفرات Cys لفقدان الوظيفة. تحقق من نشاط المتحور الأقل Cys ومتحور الأحماض الأمينية غير الطبيعية باستخدام فحص النشاط المناسب. في هذه الحالة ، تم التحقق من النشاط من خلال فحص النمو متبوعا بفحص ATPase الأخضر في المختبر من الملكيت32,41,42

2. وضع العلامات على البروتين

  1. تنقية البروتين أو البروتينات ذات الأهمية إلى نقاء 95٪ على الأقل لوضع العلامات الدقيقة. تنقية بروتينات SecA و SecYEG باتباع البروتوكولات المفصلة في المرجع3. تأكد من أن لديك ما لا يقل عن 5 ميكروغرام من البروتين النقي لهذه الخطوة ، حيث سيتم فقدان بعض البروتين أثناء عملية وضع العلامات.
  2. اختر صبغتين لقياسات FRET اعتمادا على قيمة R0 الخاصة بهما والمسافات المتوقعة بين المواقع المصنفة. تقدير قيم R0 ومراقبة تداخل انبعاثات الجهات المانحة وامتصاص المستقبلات باستخدام المعلومات الواردة من قاعدة بيانات البروتين الفلوري ، والتي تعطي أيضا أطياف للأصباغ شائعة الاستخدام (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    ملاحظة: يتم تعريف R0 على أنه المسافة التي تكون فيها كفاءة النقل 50٪ لزوج صبغة معين. بالنسبة لتجارب رسم الخرائط، يجب أن تكون المسافات المتوقعة قريبة من قيمة R0 لزوج الصبغة لضمان إمكانية قياس المسافات بدقة.
  3. تسمية المواضع المحددة في الخطوة 1.1.1. مع زوج صبغة المتبرع والمتقبل.
    1. قم بتسمية البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع إيلاء اهتمام خاص لمعلمات مثل تركيز البروتين الأمثل ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة وطول الوقت والمخزن المؤقت للأصباغ المحددة المستخدمة43,44.
    2. تحضير البروتين بتركيز 1-2 ملغم / مل أو حوالي 10 ميكرومتر في 25 ملليمتر Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 25 mM KCl ، 1 mM EDTA (TKE) العازل. تذوب الصبغة في ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى تركيز نهائي قدره 1 ملليمتر. أضف الصبغة قطرة إلى المحلول مع التحريك للوصول إلى صبغة: نسبة البروتين المولية 5: 1 (صبغة 50 ميكرومتر: بروتين 10 ميكرومتر).
    3. اسمح للتفاعل بالمتابعة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) في قارورة زجاجية مع هزاز لطيف أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. أوقف التفاعل بإضافة β-ميركابتوإيثانول.
      ملاحظة: إذا كان البروتين غير متوافق مع مخزن Tris المؤقت، يمكن استخدام مخازن الفوسفات أو HEPES. الحفاظ على درجة الحموضة في نطاق 7.0-7.5. إذا كان البروتين يحتوي على روابط ثاني كبريتيد ، فأضف عاملا مختزلا مثل DTT أو TCEP قبل وضع العلامات. إزالة DTT عن طريق غسيل الكلى أو الترشيح هلام قبل إضافة صبغة.
  4. للحصول على قياسات دقيقة من FRET ، قم بإزالة الصبغة الحرة باستخدام مكثف طرد مركزي مع قطع وزن جزيئي مناسب (MWCO) للسماح للصبغة الحرة بالتدفق مع الاحتفاظ بالبروتين الموسوم.
    1. قم بتحضير غشاء المكثف عن طريق وضع ~ 1 مل من الماء في الجزء العلوي من مكثف 3 مل ثم طرد الماء مركزيا من خلال الغشاء (على الأقل 10 دقائق عند 4300 × جم).
    2. قم بإزالة الصبغة الحرة عن طريق الطرد المركزي للعينة الموسومة في المكثف (20 دقيقة عند 4300 × جم). كرر 3-4 مرات وتخلص من التدفق من خلال.
    3. تحقق من كفاءة وضع العلامات على البروتين المسمى باستخدام التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: تتطلب قياسات FRET كفاءة وضع العلامات بنسبة 50٪ أو أكثر. تقلل كفاءة وضع العلامات المنخفضة من إشارة FRET ويمكن أن تؤدي إلى عدم الدقة في القياس.
    4. احصل على طيف UV-Vis للبروتين المسمى بنطاق يتراوح بين 250-700 نانومتر لمراقبة كل من نطاق امتصاص البروتين ونطاق امتصاص الصبغة الأقصى. قياس الامتصاص عند ذروة امتصاص الصبغة وعند 280 نانومتر للبروتين.
    5. أوجد تركيز البروتين وصحح أي مساهمات من الصبغة باستخدام عامل التصحيح، CF، والمعادلات التالية45,46:
      figure-protocol-1
      حيث C هو تركيز البروتين (M) ، A 280 هو امتصاص العينة عند 280 نانومتر ،والحد الأقصى هو الامتصاص عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة ، ε البروتين هو معامل الانقراض للبروتين عند 280 نانومتر و CF هو عامل التصحيح ، A'280 / A'max ، حيث A'280 هو الامتصاص عند 280 نانومتر و A'max هو الامتصاص في ذروة الحد الأقصى للصبغة فقط.
    6. تحديد كفاءة وضع العلامات باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-2
      حيث ε الصبغة هي معامل الانقراض المولي للصبغة ، C هو تركيز البروتين كما هو محدد في الخطوة 2.4.5 ، و E هو كفاءة وضع العلامات. كرر الخطوة 2.4.2 حتى تستقر قيمة كفاءة وضع العلامات وتكون أقل من 100٪.

3. تحديد قيم R 0

  1. قم بقياس قيم R0 في الموقع. قم بإعداد عينتين من البروتين بنفس تركيز البروتين الكلي ، 4 ميكرومتر ، واحدة مع البروتين المسمى بصبغة المتبرع فقط وواحدة مع البروتين الموسوم بصبغة المتقبل فقط. بالنسبة ل SecA ، يعمل تركيز البروتين البالغ 4 ميكرومتر SecA مونومر بشكل جيد لهذه القياسات.
    1. قم بإعداد أحجام عينة تبلغ 2.5 مل لكوفيت 1 سم × 1 سم ، أو 600 ميكرولتر لكوفيت 5 مم × 5 مم أو 200 ميكرولتر لكوفيت 3 مم × 3 مم.
  2. قم بتشغيل مقياس الفلورومتر وافتح برنامج الاكتساب والتحليل الطيفي في برنامج التألق إذا كنت تستخدم مقياس الطيف الفلوري. انقر فوق M الأحمر لتوصيل الكمبيوتر بالأداة (الشكل 2A) واختر أطياف الانبعاثات.
    1. أدخل معلمات المسح الضوئي مثل الطول الموجي للإثارة، ونطاق فحص الانبعاثات، ودرجة الحرارة، وموضع مغير العينة باستخدام عنصر قائمة تجميع التجربة (الشكل 2B).
    2. انقر فوق RTC وقم بتحسين إعدادات الأداة (على سبيل المثال ، الشقوق الطيفية) من خلال مراقبة انبعاث التألق في الذروة باستخدام طول موجي مثير تم تعيينه عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة. بالنسبة إلى SecA ، قم بتعيين الإعدادات التالية: bandpass ك 1 نانومتر ؛ فتحات الإثارة والانبعاثات مثل 1 و 1.5 مم على التوالي ، مع درجة حرارة 25 درجة مئوية وسرعة التحريك عند 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: لا تتجاوز سعة العد في الثانية (cps) للأداة (عادة 2 × 106 cps).
  3. ضع عينة البروتين المصنفة من قبل المتبرع في حامل العينة وانقر فوق تشغيل لإنشاء مسح انبعاث للبروتين المسمى بصبغة المتبرع فقط (بروتين المتبرع فقط) عن طريق إثارة العينة عند الحد الأقصى لامتصاص الصبغة (على سبيل المثال، 488 نانومتر ل AF488) والمسح الضوئي فوق ذروة الانبعاثات (505-750 نانومتر للمتبرع فقط بروتين SecA المسمى AF488).
  4. قم بإنشاء خط أساس للفحص عن طريق تمديد المسح الضوئي 25-50 نانومتر إلى ما بعد نهاية الذروة. قياس العائد الكمومي للبروتين المتبرع فقط ، عن طريق إجراء قياسات الامتصاص والتألق على عينات بتركيزات مختلفة كما هو موضح47. حافظ على نفس إعدادات الشق لهذه القياسات.
    1. استخدم صبغة المتبرع الحرة كمرجع للعائد الكمومي. احصل على ما لا يقل عن أربعة قياسات للبروتين المتبرع فقط والصبغة الحرة بتركيزات مختلفة لتحديد دقيق.
    2. ارسم كثافة التألق أو المنطقة المتكاملة مقابل امتصاص البروتين المتبرع فقط والصبغة الحرة أو المرجع. حدد منحدرات البروتين المانح فقط (المنحدر D) والمرجع (المنحدرR).
    3. يتم حساب العائد الكمومي (Φ) باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-3
      هنا Φ D هو العائد الكمومي للبروتين المانح فقط ، Φ R هو العائد الكمومي للصبغة الحرة (يمكن الحصول على هذا عادة من الشركة المصنعة) ، المنحدر D والمنحدر R هما المنحدران المحددان في الخطوة 3.4.2 للمتبرع فقط البروتين والمرجع ، على التوالي η D و η R تمثل مؤشر انكسار البروتين المانح فقط ومحاليل الصبغة الخالية من المراجع ، على التوالي 47.
  5. احصل على طيف امتصاص للبروتين المتقبل فقط باستخدام خلية طول مسار 1 سم. قم بإنشاء طيف معامل انقراض من البروتين المتقبل فقط عن طريق تقسيم طيف الامتصاص على تركيز الصبغة.
  6. توليد التكامل التداخل الطيفي، J (λ) باستخدام برنامج تحليل رسومي. يمكن أيضا استخدام برنامج ورقة عمل قياسي (على سبيل المثال، جدول بيانات) لهذه العملية.
    1. اضرب طيف انبعاث التألق للبروتين المانح فقط (الخطوة 3.4) في طيف معامل الانقراض للبروتين المتقبل فقط لتوليد طيف التداخل.
    2. اضرب طيف التداخل الناتج في λ4.
    3. حدد المساحة تحت المنحنى عن طريق تكامل منطقة التداخل. وتعرف منطقة التداخل بأنها المنطقة التي ينتج فيها طيف الانبعاثات المانحة مضروبا في طيف معامل الانقراض المتقبل قيما إيجابية. يعرف تكامل التداخل الطيفي على النحو التالي:
      figure-protocol-4
      حيث FD (λ) هو طيف انبعاث البروتين المانح فقط (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3.4) و εA(λ) هو طيف معامل الانقراض للبروتين المتقبل فقط وله وحدات M-1 cm-1(تم الحصول عليها في الخطوة 3.5). يجب أن يكون للتداخل الطيفي الناتج وحدات M-1 cm-1nm 4.
    4. تطبيع التكامل الطيفي المتداخل. قسم التكامل التداخل على المنطقة المتكاملة من طيف البروتين المانح فقط على نفس النطاق الطيفي:
      figure-protocol-5
    5. احسب قيمة R0 في Å باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-6
      حيث κ 2 هو عامل الاتجاه ، وعادة ما يؤخذ على أنه 2/3 للأصباغ الدوارة بحرية ، η هو مؤشر الانكسار ويمكن تقريبه إلى 1.33 للحلول المائية المخففة ، QD هو العائد الكمومي للمتبرع (الخطوة 3.4) و J (λ) هو تكامل التداخل الطيفي كما هو محدد في الخطوة 3.6.35. ملاحظة: إذا لم تكن الأصباغ تدور بحرية ، فيمكن إدخال التصحيحات كما وصفها إيفانوف 48 وتنفيذها بواسطة Auclair49 و Zhang 2,3.

4. إجراء القياسات الطيفية FRET

  1. تحضير عينات البروتين للمتبرع فقط، والبروتين المتقبل فقط، والبروتين المانح المتقبل بنفس التركيز؛ يوصى بتركيز 4 ميكرومتر. استخدم 200 ميكرولتر من المحلول ، إذا كنت تستخدم كوفيت 3 مم × 3 مم ، أو 600 ميكرولتر إذا كنت تستخدم كوفيت 5 مم × 5 مم ، أو 2.5 مل إذا كنت تستخدم كوفيت 1 سم × 1 سم.
    1. تحضير عينة البروتين بين المتبرع والمتقبل باستخدام كميات مولية متساوية من المتبرع فقط والبروتين المتقبل فقط.
    2. الحفاظ على نفس الكمية من العينة المصنفة في المتبرع المسيطر فقط وقبول عينات البروتين فقط من خلال إدخال البروتين غير المسمى بكمية مولية متساوية إما للمتبرع فقط أو للعينات المتقبلة فقط. على سبيل المثال، بالنسبة للمحاليل التي لها نفس التركيز، ستحتوي كل عينة من FRET للمتبرعين فقط على 100 ميكرولتر من البروتين المخصص للمتبرعين فقط و100 ميكرولتر من البروتين غير المسمى لحجم 200 ميكرولتر.
  2. توليد أطياف الانبعاثات الفلورية للمتبرع فقط، والمتقبل فقط، وعينات المتبرع المتقبل. قم بتحسين الإشارة كما هو موضح في الخطوة 3.2. بمجرد تحسينها ، حافظ على نفس الإعدادات لجميع العينات.
    1. احصل على الفحص الخاص بالجهات المانحة فقط كما هو موضح في الخطوة 3.3. إثارة الحل في الحد الأقصى لامتصاص صبغة المتبرع والمسح الضوئي على المتبرع وذروة الانبعاثات (المتوقعة) المتقبل.
    2. إما استبدال العينة بالبروتين المتقبل فقط أو تغيير موضع مغير العينة إلى كوفيت يحتوي على البروتين المتقبل فقط.
    3. احصل على فحص انبعاث للبروتين المسمى بصبغة المتقبل فقط (بروتين المتقبل فقط) باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوة 4.2.1. إثارة العينة عند الطول الموجي للإثارة المانحة.
      ملاحظة: يوفر هذا الطيف تصحيحا لمقدار المتقبل المثار عند الطول الموجي للمانح (FA في الخطوة 5.1.2)
    4. تبادل العينة إلى عينة البروتين المانح المتقبل أو قم بتغيير موضع مغير العينة إلى الكوفيت الذي يحتوي على البروتين المسمى المتبرع المتقبل.
    5. احصل على فحص انبعاث لعينة البروتين بين المتبرع والمتقبل باستخدام نفس الإعدادات كما في الخطوتين 4.2.1 و4.2.3.
    6. بالنسبة لجميع الأطياف، يرجى تصحيح تألق الخلفية عن طريق طرح أعداد الخلفية التي تم قياسها في نهاية الفحص.
  3. قياس عمر المتبرع للمتبرع فقط والعينات المتبرع المتقبل المعدة كما هو موضح في الخطوة 4.1.2. استخدم أداة تألق عد الفوتون الواحد المرتبطة بالوقت والقادرة على قياس وحل الاضمحلالات الفلورية في النطاق الزمني للنانوثانية (10-9 ثانية).
    ملاحظة: بالنسبة لأزواج صبغات FRET ، قم بمطابقة مصدر ضوء الإثارة مع الحد الأقصى لامتصاص صبغة المتبرع.
    1. قم بتشغيل الأداة. افتح برنامج الاستحواذ ، واستخدم برنامج التحكم في الأداة للحصول على البيانات باستخدام مطياف التألق.
    2. للاستحواذ، حدد TCSPC Decay، مع نطاق زمني يبلغ 55 ns، وكسب 1 و 4096 قناة.
    3. احصل على وظيفة استجابة الأداة (IRF) باستخدام محلول كريمة غير الألبان أو محلول تشتت تجاري وراقب التشتت عند 490 نانومتر. اضبط إعداد الشق واستخدم مرشحات الكثافة المحايدة حسب الحاجة للحفاظ على معدل عد منخفض بما يكفي لتجنب تراكم النبض5. انقر فوق قبول ثم ابدأ. هذا سيبدأ الاستحواذ.
      ملاحظة: يتم استخدام معدل عد أقصى يبلغ 4000 cps لمعدل تكرار 180 كيلو هرتز.
    4. اجمع IRF عند 490 نانومتر حتى تحتوي قناة الذروة على 20000 عدد كحد أقصى. جمع IRF قبل وبعد قياس كل تسوس التألق.
    5. الحصول على اضمحلال التألق للمتبرع فقط والعينات المانحة المتقبلة من خلال رصد انبعاث التألق عند الطول الموجي للانبعاثات لدى المتبرع ، 520 نانومتر.
    6. اضبط إعدادات الشق للحصول على معدل عد أقصى يبلغ 4000 cps أو أقل. عادة ما تكون إعدادات الشق عبارة عن ممر نطاق 15-20 نانومتر لعينات البروتين. جمع الاضمحلال حتى يتم الحصول على 20000 عدد في قناة الذروة.
  4. تحليل الاضمحلال أو شدة التألق (I) كدالة للوقت (t) لعمر التألق (τ). ضع الاضمحلال في مجموع الأس بالمعادلة التالية:
    figure-protocol-7
    حيث α I هو العامل الأسي للمكون ith و τ I هو العمر. يتم إعادة تشكيل الملاءمة مع IRF لتتناسب مع اضمحلال التألق. احكم على جودة الملاءمة من معلمات Χ2 المخفضة.

5. تحليل بيانات FRET

  1. احسب كفاءة FRET من الانخفاض في كثافة المتبرع لعينة المتبرع المتقبل بالنسبة للمتبرع فقط بالمعادلة التالية.
    figure-protocol-8
    حيث FDA هي شدة التألق لعينة المتبرع المتقبل و FD هي شدة التألق للعينة المانحة فقط في ذروة التألق المانح. استخدم المناطق المتكاملة للقمم إذا كانت البيانات صاخبة.
    1. صحيح لأي اختلافات في وضع العلامات بين العينات المانحة فقط وعينات المتبرع المتقبل. احسب التصحيحات بناء على درجة وضع العلامات من قبل المتبرع على النحو التالي.
      figure-protocol-9
      حيث f DA هي كفاءة وضع العلامات على الجهات المانحة في عينة المتبرع - المتقبل و fD هي كفاءة وضع العلامات في عينة المتبرع فقط.
    2. صحيح لأي مساهمات من التألق المتقبل في الطيف المتحمس للمانح من خلال طرح طيف البروتين المتقبل فقط (الخطوة 4.2) من طيف البروتين بين المتبرع والمتقبل.
      figure-protocol-10
    3. صحيح للاختلافات في كفاءة وضع العلامات على البروتين المتقبل فقط بالنسبة لعينة البروتين المتبرع المتقبل التي تنتج المعادلة التالية لحساب الكفاءة:
      figure-protocol-11
      حيث يشير fA إلى المقدار الكسري لوضع العلامات على المتقبل. تتضمن هذه المعادلة جميع التصحيحات بسبب وضع العلامات على الصبغة وتألق المستقبل.
    4. احسب مسافات FRET من الكفاءات باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-12
      باستخدام قيمة R0 التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6.5.
    5. احسب كفاءة FRET باستخدام العمر الفلوري للمتبرع فقط والعينات المتقبلة للمتبرع المقاسة في الخطوة 4.3.3-4.3.5:
      figure-protocol-13
    6. استخدم العمر الافتراضي المرجح بالسعة لحساب كفاءات FRET ومقارنتها بنتائج الحالة الثابتة5.
      figure-protocol-14
    7. احسب المسافة كما في الخطوة 5.1.4 من الكفاءات التي يحددها عمر التألق. قارن قيم الحالة الثابتة والقيم التي تم حلها عبر الزمن لكفاءة FRET والمسافات وتأكد من أنها تقع ضمن خطأ بعضها البعض.

6. رسم خرائط المسافات

  1. استخدم المسافات المحسوبة لتعيين موقع الربط على الهيكل ثلاثي الأبعاد. احسب المسافات والأخطاء لجميع أزواج الأصباغ والمواقع التي تم فحصها باستخدام المعادلة الواردة في قيم الخطوة 5.1.4 وR0 التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6.5 لكل زوج FRET.
    1. استخدم برنامج عرض رسومي ثلاثي الأبعاد مثل PyMOL50 لتعيين المسافات على الهيكل (البرنامج النصي الوارد في الملف التكميلي). يمكن إدخال الأوامر من البرنامج النصي مباشرة في نافذة الأوامر مع معلومات المسافة المناسبة.
    2. قم بإنشاء غلاف لكل مسافة تم قياسها والخطأ المرتبط بها (الشكل 3 ، الشكل 4 ، الأشكال التكميلية 1-3).
    3. رسم خريطة للموقع من خلال تقاطع الأصداف المختلفة (الأشكال التكميلية 1-3). تم تعيين موقع ربط ببتيد الإشارة من خلال المواقع الثلاثة المختلفة على SecA و SecYEG وأربعة مواقع مختلفة على ببتيد الإشارة (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ركزت هذه الدراسة على تحديد موقع ربط ما قبل البروتين على SecA قبل إدخال البروتين المسبق في قناة SecYEG. لرسم خريطة لموقع الربط ، تم إجراء تجارب FRET بين مناطق مختلفة من البروتين المسبق وثلاثة مواقع متميزة على بروتينات SecA و SecYEG (الشكل 1A-D). من المسافات التي تم الحصول عليها والهياكل ثلاثية الأبعاد ل SecA و SecYEG و preprotein ، تم التنبؤ بموقع ربط ما قبل البروتين. بدلا من استخدام ثلاثة كيانات منفصلة (SecA و SecYEG و preprotein) لإجراء هذه القياسات ، تم إر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من خلال استخدام منهجية رسم الخرائط FRET ، حددنا موقع ربط تسلسل الإشارة على بروتين SecA. الأهم من ذلك ، أن وجود بنية بلورية 3-D للمجمع سهل دراستنا بشكل كبير. تكمن قوة منهجية رسم الخرائط هذه في القدرة على استخدام هيكل موجود لتحديد المواقع لوضع العلامات. لا يمكن استخدام هذه المنهجية لتحديد هيكل 3-D. ومع ذلك ، فإن تحديد العناصر الهيكلية56 ، أو صقل هيكل موجود49 ، أو تحديد موقع ملزم 2,32 ، أو توضيح الحركة الديناميكية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R15GM135904 (الممنوحة ل IM) ومنحة المعاهد الوطنية للصحة GM110552 (الممنوحة ل DBO).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
490 نانومتر ليزر LEDHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide // DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide / DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra & ss. 4 مرشح طرد مركزي (50 كيلو دالتون MWCO)سيجماUFC805008
دوديسيلمالتوسيد (DDM)AnatraceD310
< م > إي قولونية < م > ببتيد إشارة الفوسفاتيز القلوية SP22الجزيئات الحيوية الغرب الأوسطN / Aعنصر مخصص مركب
ببتيد إشارة موسعة SP41الجزيئات الحيوية الغرب الأوسطN / Aعنصر مخصص مركب
FluorEssenceHoribaالإصدار 2.4لمقياس الطيف الفلوري Fluoromax4
مقياس الطيف الفلوري 4HoribaN / A
GlobalsWEمختبر ديناميكيات التألق ، جامعة كاليفورنيا ، برنامج التحليل الطيفي في إيرفينللاضمحلال الذي تم حله بمرور
الوقت H & خجول ؛ 4 وخجول. Azido &ss; Phe &ss; OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) مرقفيشر ScientificBP9723
Ludox HS-40 السيليكا الغروية (تعليق 40 بالوزن في H2O)420816Sigma-Aldrichلعمل حل تشتت مناسب
PTI Felix GXHoribaالإصدار 4.1.0.4096الاستحواذ الطيفي ل PTI Time Master Instrument
PTI Time Master أداةHoribaNA
Pymol برنامج الرسومات الجزيئيةشرودنجرالإصدار 2.4
حمام مائيحراري علميNESLAB RTE 10
برنامج الاستحواذ الطيفي هناك حاجة إلى تخفيف برنامج

المراجع

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FRET DNA SecA SecYEG
رسم خرائط نقل الطاقة بالرنين Förster: منهجية جديدة لتوضيح الميزات الهيكلية العالمية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.