استراتيجيات التلقيح لإصابة جذور النباتات بالكائنات الحية الدقيقة التي تنقلها التربة

يسكن التربة الطبيعية عدد مذهل من الميكروبات التي يمكن أن تكون محايدة أو ضارة أو مفيدة للنباتات¹. العديد من مسببات الأمراض النباتية تنتقل عن طريق التربة ، وتحيط بالجذور ، وتهاجم العضو تحت الأرض. تنتمي هذه الكائنات الحية الدقيقة إلى مجموعة واسعة من الكلاديس: الفطريات ، oomycetes ، البكتيريا ، الديدان الخيطية ، الحشرات ، وبعض الفيروسات ^1,2. بمجرد أن تفضل الظروف البيئية العدوى ، ستصبح النباتات المعرضة للإصابة بالمرض وتنخفض غلة المحاصيل. وستؤدي آثار تغير المناخ، مثل الاحترار العالمي والظواهر الجوية المتطرفة، إلى زيادة نسبة مسببات الأمراض النباتية التي تنقلها التربة³. لذلك ، سيصبح من المهم أكثر فأكثر دراسة هذه الميكروبات المدمرة وتأثيرها على إنتاج الأغذية والأعلاف ، ولكن أيضا على النظم الإيكولوجية الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تبادلات ميكروبية في التربة تتفاعل بإحكام مع الجذور وتعزز نمو النبات وتطوره ومناعته. عند مواجهة مسببات الأمراض ، يمكن للنباتات تجنيد خصوم محددين بنشاط في الريزوسفير الذي يمكن أن يدعم بقاء المضيف عن طريق قمع مسببات الأمراض⁴،^5،6،7. ومع ذلك ، فإن التفاصيل الميكانيكية والمسارات المشاركة في التفاعلات المفيدة بين الجذر والميكروبات غالبا ما تكون غير معروفة⁶.

لذلك ، من الضروري توسيع الفهم العام للتفاعلات بين الجذر والميكروبات. تعد الطرق الموثوقة لتلقيح الجذور بالكائنات الحية الدقيقة التي تنقلها التربة ضرورية لإجراء دراسات نموذجية ونقل النتائج إلى التطبيقات الزراعية. تتم دراسة التفاعلات المفيدة في التربة ، على سبيل المثال ، مع Serendipita indica (المعروفة سابقا باسم Piriformospora indica) ، أو Rhizobium spp. المثبتة للنيتروجين ، أو الفطريات الفطرية ، في حين أن مسببات الأمراض النباتية المعروفة التي تنقلها التربة تشمل Ralstonia solanacearum ، Phytophthora spp. ، Fusarium spp. ، و Verticillium ^spp.1. الأخيران هما أجناس فطرية موزعة عالميا وتسبب أمراض الأوعية الدموية². يمكن أن يصيب Verticillium spp. (Ascomycota) مئات الأنواع النباتية - إلى حد كبير ثنائيات الفلقة ، بما في ذلك الحولية العشبية ، والنباتات المعمرة الخشبية ، والعديد من نباتات المحاصيل ^2,8. تدخل Hyphae من Verticillium الجذر وتنمو على حد سواء بين الخلايا وداخل الخلايا نحو الأسطوانة المركزية لاستعمار أوعية xylem ^2,9. في هذه الأوعية ، يبقى الفطر لمعظم دورة حياته. نظرا لأن عصارة xylem فقيرة بالمغذيات وتحمل مركبات الدفاع النباتي ، يجب أن تتكيف الفطريات مع هذه البيئة الفريدة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إفراز البروتينات المرتبطة بالاستعمار التي تمكن العامل الممرض من البقاء على قيد الحياة في مضيفه^10,11. بعد الوصول إلى الأوعية الدموية الجذرية ، يمكن أن ينتشر الفطر داخل أوعية xylem بشكل كبير إلى أوراق الشجر ، مما يؤدي إلى استعمار منهجي للمضيف ^9,12. في هذه المرحلة ، يتأثر النبات سلبا في النمو^9،10،13. على سبيل المثال ، يحدث التقزم والأوراق الصفراء وكذلك الشيخوخة المبكرة¹³،¹⁴،^15،16.

أحد أعضاء هذا الجنس هو Verticillium longisporum ، الذي يتكيف بشكل كبير مع المضيفات النحاسية ، مثل اغتصاب البذور الزيتية المهم زراعيا ، والقرنبيط ، والنبات النموذجي Arabidopsis thaliana¹². جمعت العديد من الدراسات بين V. longisporum و A. thaliana للحصول على رؤى واسعة النطاق حول أمراض الأوعية الدموية التي تنقلها التربة واستجابات الدفاع الجذري الناتجة¹³،¹⁵،^16،17. يمكن تحقيق اختبار القابلية المباشر باستخدام نظام نموذج V. longisporum / A. thaliana والموارد الوراثية الراسخة المتاحة لكلا الكائنين. يرتبط ارتباطا وثيقا ب V. longisporum هو الممرض Verticillium dahliae. على الرغم من أن كلا النوعين الفطريين يؤديان عملية مماثلة على نمط الحياة الوعائية والغزو ، إلا أن كفاءة انتشارهما من الجذور إلى الأوراق وأعراض المرض المستحثة في A. thaliana مختلفة: في حين أن V. longisporum عادة ما يحفز الشيخوخة المبكرة ، فإن عدوى V. dahliae تؤدي إلى الذبول¹⁸. في الآونة الأخيرة ، قدم ملخص منهجي استراتيجيات تلقيح جذرية مختلفة لإصابة A. thaliana ب V. longisporum أو V. dahliae ، مما ساعد في تخطيط الإعدادات التجريبية¹⁹. في هذا المجال ، يسبب V. longisporum أحيانا أضرارا كبيرة في إنتاج اغتصاب البذور الزيتية¹² ، في حين أن V. dahliae لديه مجموعة مضيفة واسعة جدا تضم العديد من الأنواع المزروعة ، مثل كرمة العنب والبطاطا والطماطم⁸. وهذا يجعل كلا من مسببات الأمراض نماذج مثيرة للاهتمام اقتصاديا للدراسة.

وبالتالي ، تستخدم البروتوكولات التالية كلا من V. longisporum و V. dahliae كمسببات أمراض جذرية نموذجية لتجسيد النهج الممكنة لتلقيح الجذر. تم اختيار أرابيدوبسيس (أرابيدوبسيس تاليانا)، واغتصاب البذور الزيتية (براسيكا نابوس)، والطماطم (سولانوم ليكوبيرسيكوم) كمضيفين نموذجيين. يمكن العثور على أوصاف مفصلة للمنهجيات في النص أدناه والفيديو المصاحب له. وتناقش مزايا وعيوب كل نظام تلقيح. يمكن أن تساعد مجموعة البروتوكولات هذه مجتمعة في تحديد طريقة مناسبة لأسئلة بحثية محددة في سياق التفاعلات بين الجذر والميكروبات.

1. وسائل الإعلام للثقافات الفطرية وأنظمة تلقيح النباتات

1. مرق سكر العنب السائل للبطاطس (PDB): تحضير 21 جم / لتر PDB في ماء فائق النقاء في قارورة مستقرة حراريا.
2. مرق سكر العنب السائل Czapek (CDB): تحضير 42 جم / لتر CDB في ماء فائق النقاء في قارورة مستقرة حراريا.
3. متوسطة لنظام تلقيح طبق بتري: قم بإعداد قارورة مستقرة للحرارة مع 1.5 جم / لتر من موراشيج و Skoog متوسطة (MS) و 8 جم / لتر من الأجار في ماء فائق النقاء.
   ملاحظة: تجنب السكر في هذا الوسط لأنه سيؤدي إلى نمو فطري مفرط بعد التلقيح.
4. متوسطة لنظام التلقيح القائم على الكوب البلاستيكي: قم بإعداد قارورة مستقرة للحرارة مع 4.4 جم / لتر MS ، و 0.2 جم / لتر MgSO₄ ، و 1 جم / لتر KNO₃ ، و 0.5 جم / لتر 2-(N-morpholino) حمض الإيثانسلفونيك (MES) ، و 6.0 جم / لتر أجار في ماء فائق النقاء واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.7 مع 5 M KOH.
   ملاحظة: تجنب السكر في هذا الوسط لأنه سيؤدي إلى نمو فطري مفرط بعد التلقيح.
5. 1/4 مللي ثانية متوسطة: تحضير 1.2 جم/لتر من التصلب المتعدد في ماء فائق النقاء.
6. استخدم الأوتوكلاف لتعقيم جميع الحلول المذكورة أعلاه. ضع القوارير الزجاجية في السلة ، وأغلق الغطاء وقم بالتعقيم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية و 98.9 كيلو باسكال.

2. تعقيم سطح بذور النبات

ملاحظة: استخدم البروتوكول أدناه دائما لتعقيم سطح البذور من أرابيدوبسيس واغتصاب البذور الزيتية والطماطم قبل البذر.

1. انقل البذور إلى أنبوب تفاعل 2 مل. ضع الأنبوب في جهاز طرد بسعة داخلية تبلغ 5.8 لتر.
2. توليد غاز الكلور في الإكسيكتور عن طريق إضافة 6 مل من 33٪ من حمض الهيدروكلوريك (HCl) إلى 100 مل من هيبوكلوريت الصوديوم المائي 12٪ (NaClO).
3. أغلق على الفور غطاء الطارد واحتضن البذور لمدة 3 ساعات في الغاز.

3. تحضير اللقاح مع جراثيم Verticillium (conidia المشتقة اللاجنسية)

ملاحظة: زراعة V. dahliae (سلالة JR2) بنفس الطريقة مثل V. longisporum (سلالة Vl43)¹⁷،^18،19. تأكد من أن جميع المعدات والوسائط خالية من الجراثيم وأن جميع الخطوات يتم تنفيذها في غطاء تدفق صفائحي للحفاظ على أكسينيك اللقاح.

1. املأ 150 مل من PDB السائل (الخطوة 1.1) في قارورة شيكانري سعة 500 مل واستكمل الوسط ب 500 مجم / لتر سيفوتاكسيم.
2. أضف فيرتيسيليوم كونيدا من تخزين مخزون الجلسرين إلى وسط PDB. أغلق القارورة بسدادة رغوة معقمة.
3. احتضان الثقافة لمدة 7-10 أيام في صندوق مظلم في درجة حرارة الغرفة (RT) تحت اهتزاز أفقي مستمر (اهتزاز دوار ؛ 60 دورة في الدقيقة). ينتج عن ذلك كرات فطرية بيضاء صغيرة.
4. قم بإزالة وتجاهل PDB supernatant بعناية. يجب أن تبقى معظم الفطريات في القارورة.
5. أضف 100 مل من CDB السائل (الخطوة 1.2) على الفطريات في قارورة chicanery واستكمل الوسط ب 500 مجم / لتر سيفوتاكسيم.
6. احتضان 4-5 أيام أخرى في صندوق مظلم في RT تحت اهتزاز أفقي مستمر (شاكر دوار ، 60 دورة في الدقيقة) للحث على الجراثيم. سوف يتحول السوبرناتانت إلى اللون الرمادي المصفر مع إطلاق الكونيديا.
7. قم بتصفية جزء (5-10 مل) من السائل المحتوي على الكونيديا من خلال ورقة ترشيح (مستوى الاحتفاظ بالجسيمات من 8-12 ميكرومتر) إلى أنبوب تجميع معقم سعة 50 مل. هذا يفصل الجراثيم عن الميسيليا.
8. تحديد تركيز البوغ باستخدام غرفة عد الخلايا والمجهر. تمييع مع 1/4 مللي ثانية خالية من الجراثيم المتوسطة في الماء فائق النقاء حتى يتم الحصول على تركيزات بوغ الواردة أدناه.
   ملاحظة: تحت المجهر ، تكون الكونيديا من V. longisporum في الغالب طويلة القطر وحجمها 7.1-8.8 ميكرومتر ، في حين أن V. dahliae conidia أقصر (3.5-5.5 ميكرومتر) وكروية إلى حد ما²⁰.
9. استخدم هذه الكونيديا التي تم حصادها حديثا كتلقيح. تأكد من إجراء التجارب دائما مع كونيديا طازجة الحصاد وليس مع المخزونات المجمدة ، لأن التجميد يقلل بشكل كبير من عدد الجراثيم القابلة للحياة¹⁹.
10. للتخزين على المدى الطويل ، قم بتجميد الجراثيم كمحلول بوغ عالي التركيز (حوالي 1 × 10⁸ جراثيم / مل) في 25٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية (قابل للتخزين حتى عام واحد). بالنسبة للتجارب التالية ، استخدم مخزون الجلسرين هذا لتلقيح وسط PDB في الخطوة 3.2.

4. نظام تطعيم معقم في المختبر يعتمد على أطباق بتري

ملاحظة: بالنسبة لنظام أطباق بتري¹⁷، تأكد من أن جميع المعدات والوسائط خالية من الجراثيم وأن جميع الخطوات يتم تنفيذها في غطاء تدفق صفائحي.

1. بعد التعقيم ، صب الوسط (انظر الخطوة 1.3) في أطباق بتري.
2. بعد تصلب الوسط ، أعد تعبئة أطباق بتري في كيس بلاستيكي معقم وتخزينها رأسا على عقب طوال الليل في الثلاجة (4-10 درجة مئوية). يساعد الوسط المبرد على منع انزلاق الوسط في الخطوات التالية.
3. قم بقطع وإزالة قناة العدوى والثلث العلوي من الوسط الصلب باستخدام مشرط (الشكل 1A). تجنب الحصول على السائل أو الهواء تحت وسط أجار أثناء القطع ؛ خلاف ذلك ، سوف ينزلق الوسط ويغلق قناة العدوى.
4. توزيع 50-100 بذور أرابيدوبسيس معقمة سطحيا مع طرف ماصة معقمة على السطح العلوي المقطوع. ضع البذور في الزاوية التي يلامس فيها سطح الأجار المقطوع جدار طبق بتري بحيث يمكن أن تنمو الجذور بين الوسط وجدار طبق بتري. هذا سوف يسهل التطعيم في وقت لاحق.
5. أغلق أطباق بتري وأغلقها بشريط لاصق منفذ للهواء للسماح بتبادل الغازات.
6. بعد التقسيم الطبقي لمدة يومين في الظلام عند 4 درجات مئوية ، ضع الألواح عموديا في رف مناسب وتنمو النباتات عند 22 درجة مئوية ± 1 درجة مئوية في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات ظلام) في غرفة النمو.
7. عندما تصل غالبية الجذور إلى قناة العدوى (حوالي 9-11 يوما من الشتلات) ، ضع الألواح أفقيا وافتحها وأضف 500 ميكرولتر من Verticillium conidia التي تم حصادها حديثا بتركيز 4 × 10⁵ جراثيم / مل مباشرة في قناة العدوى ، مع التأكد من توزيع السائل بالتساوي في القناة.
8. وبالمثل ، قم بإعداد لوحات التحكم عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول وهمي بدلا من الجراثيم (وسط خال من الجراثيم 1/4 MS).
9. احتضن الألواح أفقيا لبضع دقائق حتى ينقع السائل ولا يمكن أن يتسرب إلى الخارج عند إعداد الألواح عموديا مرة أخرى. ثم أغلق الغطاء وأغلق الألواح بشريط لاصق قابل للنفاذ إلى الهواء.
10. احتضان الألواح عموديا في غرفة النمو. اختياريا ، قم بتغطية أجزاء الجذر بصناديق ورقية سوداء لتغميق الجذور والفطريات التي تنقلها التربة (انظر¹⁹).
11. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح اعتمادا على سؤال البحث (راجع أساطير الشكل لمعرفة النقاط الزمنية الدقيقة المستخدمة هنا). فيما يلي بعض الاقتراحات.
    1. قطع الأوراق من الجذور والحصاد على حد سواء. أخرج شرائط الأجار من أطباق بتري للوصول بسهولة إلى الجذور واسحبها بعناية من الأجار باستخدام الملقط. تجميد جميع المواد النباتية على الفور في النيتروجين السائل.
       1. طحن العينات في النيتروجين السائل. استخراج الحمض النووي الكلي من 100 ملغ من المواد الورقية لتحديد كمية الحمض النووي الفطري بالنسبة للحمض النووي النباتي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي^(qPCR).
       2. طحن العينات في النيتروجين السائل. خذ 100 ملغ من المواد النباتية واستخرج الحمض النووي الريبي الكلي. إجراء النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) لتحديد التعبير عن الجينات النباتية (أو الجينات الفطرية) أثناء الإصابة (انظر¹⁹).
    2. قم بإزالة الجذور بعناية من الأجار لتجنب الإصابة وفحصها تحت المجهر الفلوري.
       1. تحديد تحريض جينات العلامات في خطوط مراسلي النباتات (على سبيل المثال ، luciferase ، β-glucuronidase ، أو مراسلي الفلورسنت¹⁷،^19،21).
       2. تصور الانتشار الفطري في الجذر باستخدام خطوط مراسل فطرية (على سبيل المثال ، V. longisporum التي تعبر بشكل أساسي عن بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن ، Vl-sGFP⁹) أو عن طريق تقنيات التلطيخ (على سبيل المثال ، من خلال 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminide (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸).

5. نظام تلقيح معقم في المختبر منظم بأكواب بلاستيكية

ملاحظة: كما هو مذكور في الوصف الأول لهذه التقنية¹⁹ ، تأكد من أن جميع المعدات والوسائط خالية من الجراثيم وأن جميع الخطوات يتم تنفيذها في غطاء تدفق صفائحي.

1. استخدم أكواب بلاستيكية شفافة بحجم إجمالي يبلغ 500 مل وقم بتعقيمها في حمام إيثانول بنسبة 70٪ -75٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. جفف الكؤوس في غطاء التدفق الرقائقي.
2. صب الوسط المعقم (انظر الخطوة 1.4) في الأكواب البلاستيكية. اختياريا، أضف سيفوتاكسيم (التركيز النهائي 50 ملغم/لتر) إلى الوسط المعقم لمنع التلوث البكتيري. استخدم 150 مل من الوسط لكل كوب للتجارب مع أرابيدوبسيس أو أكثر متوسطة (250-300 مل لكل كوب) للتجارب مع الأنواع النباتية الأكبر (اغتصاب البذور الزيتية والطماطم).
3. ضع طبقة بلاستيكية (معقمة من قبل عن طريق احتضان 70٪ -75٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة) على الوسط قبل أن يتصلب (الشكل 1B).
   ملاحظة: تحتوي هذه الطبقة البلاستيكية على أربعة ثقوب مسبقة الصنع في الزوايا لوضع البذور المعقمة على السطح. هذا يسمح للبذور بالوصول إلى الوسط. في وقت لاحق ، تمنع هذه الطبقة الفاصلة الأوراق من لمس الوسط المحتوي على الفطريات ، بحيث لا تستطيع الميكروبات مهاجمة الأوراق مباشرة ويجب أن تأخذ مسار الجذر. يوجد ثقب آخر في الوسط ، مما يتيح قطع قناة العدوى.
4. عندما يتصلب الوسط ، اقطع الأجار بمشرط من خلال فتحة المركز الجاهزة إلى عمق حوالي 1.5 سم. قم بإزالة الآجار المقطوع لإنشاء قناة عدوى يمكن إضافة الجراثيم الفطرية إليها لاحقا.
5. خدش وسط الأجار قليلا بطرف ماصة في الثقوب الأربعة الأصغر لمقاطعة الجلد الصلب (وهذا يسمح للبذور بامتصاص الماء من وسط الأجار المائي). ضع البذور باستخدام طرف ماصة في الثقوب الأصغر.
6. أغلق الكوب البلاستيكي بكوب بلاستيكي ثان مقلوب وأغلقه بشريط لاصق قابل للنفاذ إلى الهواء. يجب أن يسمح الشريط بتبادل الغازات.
7. بعد التقسيم الطبقي لمدة 3 أيام في الظلام عند 4 درجات مئوية ، احتضن أنظمة الكأس تحت 12 ساعة ضوء / 12 ساعة ظلام (أرابيدوبسيس ، اغتصاب البذور الزيتية) أو 16 ساعة ضوء / 8 ساعات ظروف الظلام (الطماطم) في غرف النمو عند درجة حرارة ثابتة من 22 درجة مئوية ورطوبة 60 ٪.
8. اتبع العمر الموصى به للنباتات للتلقيح: 21 يوما ل Arabidopsis ؛ 5-7 أيام لاغتصاب البذور الزيتية. 12 يوما للطماطم.
9. قم بتلقيح النباتات ب Verticillium عن طريق إضافة 1 مل من محلول conidia (التركيز الموصى به: 4 × 10⁵ جراثيم / مل) في قناة العدوى. لإعداد عينات التحكم، أضف 1 مل من المحلول الوهمي بدون جراثيم (وسط 1/4 MS خال من الجراثيم) إلى القناة.
10. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح اعتمادا على سؤال البحث (راجع أساطير الشكل لمعرفة النقاط الزمنية الدقيقة المستخدمة هنا). فيما يلي بعض الاقتراحات.
    1. التقط صورا للنباتات باستخدام كاميرا رقمية من الأعلى مع الحفاظ على المسافة نفسها لكل صورة. حدد مساحة الورقة (على سبيل المثال ، باستخدام ImageJ²² أو BlattFlaeche^17,19 ؛ استخدم طول الكؤوس لضبط المقياس) وقارن بين المجموعات المصابة والتحكم. تصنيف تطور أعراض المرض (على سبيل المثال ، أوراق أصغر أو أكثر صفراء أو نخرة).
       ملاحظة: إذا كان هناك أي سيقان على Arabidopsis ، فقم بإزالتها للحصول على صور أفضل للوريدات.
    2. إزالة الجذور وتحديد الكتلة الحيوية (الوزن الطازج) للبراعم من العينات المصابة والسيطرة عليها عن طريق الوزن. أوجد الوزن الطازج النسبي¹⁹.
    3. جمع العينات للتحليلات الجزيئية على النحو التالي.
    4. Arabidopsis: إزالة السيقان إن وجدت. قطع الورود في القاعدة من الجذور. تأكد من استبعاد جميع المواد الجذرية من العينة وحصاد الورود الكاملة. الجمع بين 4-5 وريدات من النباتات المختلفة في عينة واحدة وتجميد مادة ورقة في النيتروجين السائل.
    5. اسحب الجذور بعناية من الوسط باستخدام ملقط ، واضغط عليها وربت عليها بمنشفة ورقية لإزالة بقايا الأجار ، وادمج 4-5 جذور من نباتات مختلفة في عينة واحدة. تجميد على الفور في النيتروجين السائل.
    6. اغتصاب البذور الزيتية / الطماطم: قطع أجزاء الساق من hypocotyl (على سبيل المثال ، 1 سم في الطول ؛ دائما تأخذ نفس المنطقة الجذعية). الجمع بين المواد من 4-5 نباتات في كل عينة وتجميد في النيتروجين السائل.
    7. طحن العينات في النيتروجين السائل. استخراج الحمض النووي الكلي من 100 ملغ من الورقة أو المادة الجذعية لتحديد كمية الحمض النووي الفطري عبر qPCR بالنسبة للحمض النووي النباتي (انظر¹⁹).
    8. طحن العينات في النيتروجين السائل ، واتخاذ 100 ملغ من المواد النباتية واستخراج الحمض النووي الريبي الكلي. إجراء qRT-PCR لتحديد التعبير عن الجينات النباتية (أو الجينات الفطرية) عند الإصابة (انظر¹⁹).

6. نظام تلقيح قائم على التربة في الأواني

1. امزج التربة والرمل جيدا بنسبة حجمية 3: 1 (التربة: الرمل) لتسهيل غسل الركيزة من الجذور. صب الخليط في كيس الأوتوكلاف. إذا كان الخليط جافا جدا ، أضف كمية مناسبة من الماء واخلطه في الركيزة. البخار على درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في الأوتوكلاف لتقليل التلوث الميكروبي.
   ملاحظة: تجنب التسخين إلى أكثر من 80 درجة مئوية، لأن هذا قد يؤثر على مغذيات التربة العضوية.
2. املأ الأواني بخليط التربة والرمل وانقلها إلى صواني. أضف الماء إلى الصواني حوالي 1/3 ارتفاع الوعاء ، بحيث ينقع خليط التربة والرمل جيدا بالماء. بالإضافة إلى ذلك ، رش الركيزة بالماء بزجاجة رذاذ لضمان ظروف البدء الرطبة.
3. زرع 3-4 بذور في كل وعاء (الشكل 1C) لضمان أن البذور لديها مسافة كافية من بعضها البعض. احتفظ بها لمدة 3 أيام في الظلام عند 4 درجات مئوية للتقسيم الطبقي لمزامنة الإنبات.
   ملاحظة: قبل زراعة فائض من النباتات ، مما يتيح مجموعة مختارة من النباتات ذات الحجم المماثل لتجارب التلقيح ويقلل من الانحرافات بسبب الاختلافات الفردية.
4. دع الشتلات تنمو في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات ظلام ؛ درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 درجة مئوية ؛ رطوبة 60٪) مع سقي منتظم.
5. اتبع العمر الموصى به للنباتات للتلقيح: 21 يوما ل Arabidopsis ، 7 أيام لاغتصاب البذور الزيتية ، و 10 أيام للطماطم. اختر النباتات ذات الحجم المماثل لإجراء "تطعيم تراجع الجذر"¹⁵،¹⁷،^23،24. أخرج التربة من الأواني وحفر الجذور بعناية.
6. اغسل الجذور بلطف فقط في وعاء ماء وحافظ على الورود خارج الماء. احتضن الجذور المغسولة لمدة 60 دقيقة في طبق بتري يحتوي على محلول بوغ Verticillium (التركيز الموصى به: 2 × 10⁶ جراثيم / مل). بالنسبة لمجموعة التحكم غير المصابة ، احتضن الجذور لمدة 60 دقيقة في المحلول الوهمي بدون جراثيم (وسط 1/4 MS خال من الجراثيم).
7. قم بإعداد أواني جديدة بتربة رطبة ومعقمة بالبخار (80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) بدون رمل. استخدم طرف ماصة لعمل ثقب واحد في وسط التربة في كل وعاء.
8. ضع الجذور مباشرة في الحفرة (انقل نباتا واحدا فقط لكل وعاء). بعد إدخال الجذور ، تأكد من إعادة ملء الثقوب بعناية بالتربة. تجنب الضغط على التربة ، وإلا فإن إعادة الصب يمكن أن تسبب أعراض الإجهاد مثل الأوراق الأرجوانية.
9. زراعة المجموعات المصابة والسيطرة عليها في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء / 8 ساعات من الظلام ؛ درجة حرارة ثابتة من 22 درجة مئوية ؛ رطوبة 60 ٪) مع سقي منتظم.
10. قم بإجراء التحليلات في النقاط الزمنية المفضلة بعد التلقيح اعتمادا على سؤال البحث (راجع أساطير الشكل لمعرفة النقاط الزمنية الدقيقة المستخدمة هنا). فيما يلي بعض الاقتراحات.
    1. التقط صورا للنباتات باستخدام كاميرا رقمية من الأعلى ، مع الحفاظ على المسافة نفسها لكل صورة. حدد مساحة الورقة (على سبيل المثال ، باستخدام ImageJ²² أو BlattFlaeche^17,19 ؛ استخدم قطر الأواني لضبط المقياس) وقارن بين المجموعات المصابة والتحكم. تصنيف تطور أعراض المرض (على سبيل المثال، أوراق أصغر أو أكثر صفراء أو نخرة)¹³.
       ملاحظة: إزالة سيقان أرابيدوبسيس يسهل التقاط صور للوردات.
    2. إزالة الجذور وتحديد الكتلة الحيوية (الوزن الطازج) للبراعم من العينات المصابة والسيطرة عليها عن طريق الوزن. أوجد الوزن الطازج النسبي¹⁹.
    3. بدلا من ذلك ، قم بقياس ارتفاع النبات أو تصنيف النمو الفطري من شرائح الساق لتقييم شدة المرض¹³.
    4. جمع العينات للتحليلات الجزيئية على النحو التالي.
    5. Arabidopsis: إزالة السيقان. قطع الورود في تاج الجذر. الجمع بين 4-5 وريدات من النباتات المختلفة في عينة واحدة. تجميد مادة الأوراق في النيتروجين السائل.
       ملاحظة: في حالة الجذور ، من الصعب تنظيفها بشكل كاف من التربة دون إعادة برمجة التعبير الجيني من خلال الغسيل.
    6. اغتصاب البذور الزيتية / الطماطم: قطع أجزاء الساق من hypocotyl (على سبيل المثال ، 1 سم في الطول ؛ دائما تأخذ نفس المنطقة الجذعية). الجمع بين المواد من 4-5 نباتات في عينة واحدة وتجميدها في النيتروجين السائل.
    7. طحن العينات في النيتروجين السائل. استخراج الحمض النووي الكلي من أوراق 100 ملغ أو المواد الجذعية لتحديد عن طريق qPCR كمية الحمض النووي الفطري بالنسبة للحمض النووي النباتي (انظر¹⁹).
    8. طحن العينات في النيتروجين السائل ، واتخاذ 100 ملغ من المواد النباتية واستخراج الحمض النووي الريبي الكلي. إجراء qRT-PCR لتحديد التعبير عن الجينات النباتية (أو الجينات الفطرية) عند الإصابة (انظر¹⁹).

7. تحليل البيانات

1. احسب متوسط الانحراف والانحراف المعياري (± SD) استنادا إلى النسخ المتماثلة البيولوجية.
2. احسب القيم النسبية بقسمة جميع النتائج من المجموعة المصابة على نتيجة عنصر التحكم. اعرض المتوسط على أنه ، على سبيل المثال ، "بالنسبة إلى الوهمية" أو "بالنسبة إلى النوع البري".
3. تحديد الدلالة الإحصائية بين المجموعات.

الشكل 1: تجميع أنظمة التلقيح الثلاثة والخطوات الفردية في البروتوكولات. توضح هذه الأرقام الأنظمة مع المصنع النموذجي Arabidopsis thaliana. بالنسبة للأنواع النباتية الأخرى ، يجب تعديل التوقيت. تسليط الضوء على الصناديق البرتقالية ، والتي يوصى بإجراء التحليلات اللاحقة لها مع النظام المعني. (أ) بالنسبة لنظام التلقيح في أطباق بتري¹⁷ ، صب الوسط واتركه يتصلب. احتفظ بالأطباق في الثلاجة طوال الليل. ثم قم بقص وإزالة الثلث العلوي وكذلك قناة العدوى (IC) باستخدام مشرط (تمت إزالة المناطق البيضاء في الرسم التوضيحي من الأجار ، بينما تمثل المناطق المزرقة الأجار). ضع البذور على السطح المقطوع وأغلق أطباق بتري. بعد التقسيم الطبقي ، ضع الألواح عموديا واترك النباتات تنمو. بمجرد وصول معظم الجذور إلى قناة العدوى ، أضف محلول البوغ باستخدام ماصة مباشرة إلى القناة. تأكد من توزيع الحل بالتساوي. أغلق أطباق بتري واحتضنها عموديا في غرفة النمو. النهج التي قد تتبع هي التحليل التعبيري مع النسخ العكسي الكمي PCR (qRT-PCR) ، والفحص المجهري مع خطوط المراسل ، وتحديد كمية الحمض النووي الميكروبي. (ب) بالنسبة لنظام التلقيح في أكواب بلاستيكية¹⁹ ، صب الوسط ونقل الطبقة البلاستيكية الفاصلة مع الثقوب الجاهزة (أربعة ثقوب صغيرة في الزوايا لوضع البذور وثقب كبير واحد في وسط قناة العدوى). دع الوسط يتصلب. قطع وإزالة وسط أجار في الفتحة الوسطى مع مشرط للحصول على قناة العدوى (IC). خدش الوسط في الثقوب الصغيرة ونقل البذور. أغلق الكوب بكوب مقلوب وختم بشريط منفذ للهواء (يرمز إليه باللون الأصفر). دع النباتات تنمو. للتلقيح ، أضف محلول البوغ مع ماصة مباشرة في قناة العدوى. أغلق النظام واستمر في الزراعة في غرفة النمو. النهج التي قد تتبع هي التحليل التعبيري مع qRT-PCR ، وتحديد كمية الحمض النووي الميكروبي ، وتحديد الوزن الطازج ، ومنطقة الورقة ، أو خصائص المرض الأخرى. (ج) "التلقيح بغمس الجذر"¹⁵،¹⁷،²³،²⁴: بالنسبة لنظام التلقيح القائم على التربة^، املأ الأواني بخليط من التربة: الرمال. نقل البذور والسماح للشتلات تنمو. حفر النباتات ذات الحجم المماثل وغسل الجذور في الماء. ضع الجذور المغسولة في طبق بتري يحمل المحلول مع الجراثيم. بعد الحضانة ، أدخل نباتات مفردة في الأواني ذات التربة. النهج التي قد تتبع هي التحليل التعبيري في الأوراق مع qRT-PCR ، وتحديد كمية الحمض النووي الميكروبي ، وتحديد الوزن الطازج ، ومنطقة الأوراق ، أو غيرها من خصائص المرض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد البروتوكول ، تم زراعة النباتات وتلقيحها ب V. longisporum (سلالة Vl4325) أو V. dahliae (عزل JR218). تم تصميم سيناريوهات مختلفة لإثبات فعالية وتسليط الضوء على بعض قدرات البروتوكولات المحددة. يتم عرض النتائج التمثيلية.

يعد الحث التعبيري للجينات المشاركة في التخليق الحيوي للإندول-جلوكوزينولات (IG) المضاد للميكروبات مؤشرا موثوقا به لتقييم عدوى Verticillium 17,19,26. في أرابيدوبسيس ، MYB51 (بروتين مجال MYB 51; AT1G18570) عامل النسخ المشارك في تنشيط الجينات اللازمة للتخليق الحيوي IG27. يمكن أن يكون MYB51 بمثابة جين علامة يشير إلى الإصابة الناجحة حيث يتم تحريضه باستمرار في الجذور بواسطة V. longisporum 26 أو الفطريات الأخرى التي تنقلها التربة مثل Phytophthora parasitica26 و Fusarium oxysporum21. بعد يومين من التلقيح (2 نقطة في البوصة) في النظام القائم على طبق بتري ، تم تصور تحريض MYB51 في جذور Arabidopsis. كشف خط مصنع المراسل Prom MYB51::YFP 21 عن تنشيط المروج وأكد تحليل qRT-PCR تحريضا نسخيا كبيرا لهذا الجين (الشكل 2A-B). تهدف هذه التجارب إلى تحديد التغيرات التعبيرية في الجذور أثناء العدوى.

نظرا لأن أنواع Verticillium المستخدمة في هذه الدراسة تؤدي نمط حياة وعائي وتنتشر من الجذر إلى اللقطة عبر أوعية xylem ، يمكن تحديد كمية الحمض النووي الفطري في الأوراق كمعلمة لدرجة انتشار الفطريات. تم تلقيح أرابيدوبسيس الجذر في نظام المختبر في أكواب بلاستيكية وتم حصاد الورود بعد 12 يوما. بالمقارنة مع قيمة الخلفية المكتشفة في المكافحة الوهمية ، تم العثور على كميات كبيرة من الحمض النووي الفطري في أوراق النباتات المصابة (الشكل 2C). هذا يدل على أن العدوى قد تقدمت بنجاح. لمزيد من الفحوصات، يمكن تحديد كمية الحمض النووي الفطري في أنماط جينية نباتية مختلفة لاكتساب نظرة ثاقبة على استجابات الدفاع عن الجذر. بالإضافة إلى ذلك ، تم جمع الجذور في هذه النقطة الزمنية لاختبار تحريض الجين المميز عبر qRT-PCR. تم إثراء وفرة النسخ MYB51 بشكل كبير (الشكل 2D). يوضح هذا أنه يمكن بسهولة إجراء اختبارات الحساسية والتحليلات التعبيرية بالتوازي مع نظام الكأس ، مما يؤكد الميزة الكبيرة لهذا الإجراء.

ولإدراج أدلة على أنه يمكن أيضا إدخال أنواع نباتية نموذجية أخرى، أصيب اغتصاب البذور الزيتية ب V. longisporum والطماطم ب V. dahliae في النظام في أكواب بلاستيكية. في اليوم 12 بعد التلقيح في الجذور ، تم تحديد كمية الحمض النووي الفطري كميا في شرائح جذعية مقطوعة في قاعدة الشتلات (الشكل 2E-F). كان الحمض النووي الفطري قابلا للكشف في كلا النوعين النباتيين مما يشير إلى انتشار مسببات الأمراض داخل النبات. مرة أخرى ، يمكن اختبار الأنماط الوراثية النباتية المختلفة لاكتساب المعرفة حول آليات الدفاع.

إذا لم ينتشر الميكروب المستعمر الجذري ذي الأهمية من الجذور إلى الأوراق ، فلا يمكن تحديد كمية الحمض النووي الميكروبي في الأوراق كمعلمة لشدة المرض. خيار آخر لقياس شدة المرض هو تقييم واستقراء الأعراض في المضيف. ولتوضيح ذلك، تم تلقيح أرابيدوبسيس ب V. dahliae في النظام القائم على التربة وتم تقييم منطقة الأوراق الخضراء (الشكل 2G-H). في حين أن وريدات النباتات المعالجة بالمحاكاة بدت صحية وخضراء ، فإن النباتات المصابة بمسببات الأمراض كان لها حجم أوراق أقل وأوراق صفراء أو حتى نخرة. وبهذه الطريقة ، يمكن تحليل قابلية الأنماط الوراثية النباتية المختلفة وتأكيدها ، على سبيل المثال ، عن طريق تحديد الوزن الطازج.

الشكل 2: النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باتباع البروتوكولات. (A,B) تم تلقيح جذور أرابيدوبسيس ب V. longisporum في نظام طبق بتري. كشف خط المراسل Prom MYB51::YFP 21 عن تنشيط قوي لمروج MYB51 في الجذور المصابة مقارنة بالتحكم الوهمي (الفحص المجهري عند 2 نقطة في البوصة ؛ شريط المقياس: 50 ميكرومتر). تم تأكيد الحث النسخي ل MYB51 في جذور النمط البري (WT) مع تحليل qRT-PCR (2 نقطة في البوصة). يتم إعطاء قيم العينات المصابة بالنسبة للعينات الوهمية (مضبوطة على 1) (n = 5 ؛ ± SD). (ج) الاستعمار النظامي من خلال V. longisporum: بعد تلقيح جذور أرابيدوبسيس في نظام الكأس ، تم تحديد الكمية النسبية من الحمض النووي الفطري في الأوراق بواسطة PCR الكمي (qPCR ؛ 12 نقطة في البوصة). يتم إعطاء قيم العينات المصابة بالنسبة لمستوى الخلفية في العينات الوهمية (مضبوطة على 1) (n = 3 ؛ ± SD). (د) V. تم حصاد الجذور المصابة بعدوى لونغيسبوروم والمعالجة الوهمية من نظام الكأس وتم إجراء تحليل qRT-PCR. يتم إعطاء قيم العينات المصابة بالنسبة للعينات الوهمية (مضبوطة على 1) (n = 3 ؛ ± SD). تم العثور على MYB51 مستحثة بالنسخ (12 نقطة في البوصة). (ه) تم تلقيح اغتصاب البذور الزيتية في نظام الكأس باستخدام V. longisporum وتم تحديد الكمية النسبية من الحمض النووي الفطري من خلال qPCR في الأجزاء الجذعية (12 نقطة في البوصة). يتم إعطاء قيم العينات المصابة بالنسبة لمستوى الخلفية في العينات الوهمية (مضبوطة على 1) (n = 3 ؛ ± SD). (F) تم تلقيح الطماطم في نظام الكأس باستخدام V. dahliae وتم تحديد الكمية النسبية من الحمض النووي الفطري من خلال qPCR في الأجزاء الجذعية (12 نقطة في البوصة). يتم إعطاء قيم العينات المصابة بالنسبة لمستوى الخلفية في العينات الوهمية (مضبوطة على 1) (n = 5 ؛ ± SD). (ز، ح) تم تلقيح أرابيدوبسيس الجذري ب V. dahliae في النظام القائم على التربة وتظهر صور تمثيلية للنباتات المصابة والمعالجة الوهمية (21 نقطة في البوصة). تم فحص منطقة الأوراق الخضراء. بالنسبة إلى الوهمية (مضبوطة على 1) ، كان للنباتات المصابة مساحة أوراق خضراء أقل (n = 5 ؛ ± SD). (B-F ، H) للاطلاع على أزواج التمهيدي انظر19; الإحصاء: اختبار t للطالب بالنسبة للوهمية ، * ص ≤ 0.05 ، ** ص ≤ 0.01 ، *** ص ≤ 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.