Method Article

الكشف عن تراكم الفجوات بعد التكرار وإصلاحها في الخلايا البشرية باستخدام فحص ألياف الحمض النووي

DOI:

10.3791/63448

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo, 2Division of Oncology, Department of Internal Medicine, Washington University in St. Louis

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نصف تعديلين لفحص ألياف الحمض النووي للتحقيق في فجوات الحمض النووي المفردة في تكرار الحمض النووي بعد تحريض الآفة. يتيح فحص الألياف S1 الكشف عن الفجوات اللاحقة للتكرار باستخدام endonuclease S1 الخاص ب ssDNA ، في حين يسمح فحص ملء الفجوات بالتصور وتحديد كمية إصلاح الفجوة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص ألياف الحمض النووي هو طريقة بسيطة وقوية لتحليل ديناميكيات شوكة النسخ المتماثل ، استنادا إلى الكشف المناعي لنظائر النيوكليوتيدات التي يتم دمجها أثناء تخليق الحمض النووي في الخلايا البشرية. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لها دقة محدودة تبلغ بضعة آلاف من الكيلوجرامات. وبالتالي ، فإن فجوات الحمض النووي المفردة بعد النسخ المتماثل (ssDNA) التي لا يمكن اكتشافها بواسطة الفحص القياسي. هنا ، نصف نسخة معدلة من فحص ألياف الحمض النووي الذي يستخدم نوكلياز S1 ، وهو إنزيم يشق ssDNA على وجه التحديد. في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل ، سيستهدف نوكليز S1 الفجوات ويشقها ، مما يولد مساحات أقصر يمكن استخدامها كقراءة لفجوات ssDNA على الشوكات المستمرة. تتشكل فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل عندما يتم تكرار الحمض النووي التالف بشكل متقطع. يمكن إصلاحها عبر آليات غير مقترنة من تكرار الجينوم ، في عملية تعرف باسم سد الفجوة أو إصلاح ما بعد التكرار. نظرا لأن آليات سد الفجوات تنطوي على تخليق الحمض النووي بشكل مستقل عن المرحلة S ، يمكن أيضا استخدام التعديلات في مخطط وضع العلامات على ألياف الحمض النووي لمراقبة أحداث سد الفجوات. إجمالا، هذه التعديلات على فحص ألياف الحمض النووي هي استراتيجيات قوية لفهم كيفية تشكيل الفجوات اللاحقة للتكرار وملئها في جينوم الخلايا البشرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمت الأعمال المنوية دليلا على تراكم الفجوات الأحادية التي تقطعت بها السبل (ssDNA) بعد النسخ المتماثل عند العلاج بعوامل ضارة بالحمض النووي في البكتيريا1 والخلايا البشرية 2,3. أثناء تكرار قوالب الحمض النووي التالفة ، قد تتجاوز آلية تخليق الحمض النووي الآفات عن طريق استخدام بوليميراز الحمض النووي التخليقي الانتقالي المحدد أو من خلال آليات تبديل القوالب. بدلا من ذلك ، قد يتخطى المضاد ببساطة الآفة تاركا فجوة ssDNA وراءه ، ليتم إصلاحها لاحقا. في الآونة الأخيرة ، أظهرت دراسة بوضوح أن العلاج بالعوامل السامة للوراثة يؤدي إلى فجوات ssDNA في حقيقيات النوى من خلال استخدام المجهر الإلكتروني لتصور ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لأن الدراسة تستخدم خلايا بشرية ، فقد تمت الموافقة على العمل من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو (ICB-USP ، رقم الموافقة #48347515.3.00005467) للبحث مع عينات بشرية.

ملاحظة: تم استخدام البروتوكولات الموضحة هنا في المنشورات السابقة مع تعديلات طفيفة14،16،28. هنا ينصب التركيز على استخدام الأشعة فوق البنفسجية C (UVC) كعامل ضار بالحمض النووي. ومع ذلك ، فقد تم استخدام عوامل أخرى ضارة بالحمض النووي مثل سيسبلاتين وهيدروكسي يوريا بنجاح28. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في مجموعة من خطوط الخلايا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في فحص الألياف S1 ، إذا أدى العلاج بعامل سام وراثيا إلى فجوات ssDNA بعد التكرار ، فإن الأطوال الإجمالية لألياف الحمض النووي من النوى المعالجة ب S1 ستكون أقصر عند العلاج بتلف الحمض النووي مقارنة بالعينات غير المعالجة وكذلك العينات التي عولجت بالعامل السام الوراثي ولكن لم يتم تقديمها إلى الانقسام S1 (الشكل 1).

بدلا من ذلك ، إذا كان العلاج باستخدام نوكليز S1 لا يؤثر بشكل كبير على طول ألياف الحمض النووي مقارنة بالخلايا غير المعالجة ، فمن الممكن إجراء تفسيرات مختلفة: (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوقشت الخطوات الحاسمة لبروتوكول فحص ألياف الحمض النووي القياسي في منشور سابق32. هنا ، نصف الإصدارات المعدلة من فحص ألياف الحمض النووي القياسي للتحقيق في وجود فجوات ssDNA بعد النسخ المتماثل وكذلك إصلاحها عن طريق ملء الفجوات ، الموصوفة في البداية في14. في سياق وجود فجوة ssDNA بعد النسخ المتماثل ، من المرجح أن يكون استخدام نوكليز S1 في بروتوكول الألياف S1 مناسبا بعد التعرض لعامل سام وراثي لمدة لا تقل عن 1 ساعة لإتاحة الوقت لتشكيل الفجوة والكشف اللاحق. ومع ذلك ، من الضروري ملاح.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم العمل في مختبر C.F.M.M. من قبل Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP ، ساو باولو ، البرازيل ، المنح # 2019/19435-3 ، # 2013/08028-1 و 2017/05680-0) في إطار أبحاث التعاون الدولي من FAPESP والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO ، هولندا) ؛ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Financial Code 001).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الخليك ،المركب64-19-7بدلا من ذلك ، BSA - Biosera - REF PM-T1725 / 100
هيدروكسيد الأمونيومسينث1336-21-6أو ما شابه ذلك
من الأجسام المضادة المضادة للفأر IgG1 Alexa Fluor 594InvitrogenA11005-الأجسام
المضادة للفئران Alexa Fluor 488InvitrogenA21470-Antibody
Mouse Antibody Anti-BrdUBecton Disckson347580-Antibody
Rat anti-BrdUAbcam  Ab6326-غطاء
الأمن البيولوجيPachanePA 410استخدم غطاء المحرك الموجود في المختبر
BSA (ألبومين مصل الأبقار)Sigma-AldrichA3294أو
مكشطة خليةThermo Scientific179693أو ما شابه
ذلك CldUMillipore-SigmaC6891-Cloridric
acid Synth7647-01-0أو سلسلة
Zeiss LSM متحدة البؤر مماثلة (7 أو 8 أو 9)Zeiss-orما شابه
ذلك من زجاج الغطاء (أو أغطية)Thermo Scientific152460بدلا من ذلك ، Olen - زجاج غطاء Kasvi (24 × 60 مم) - K5-2460
DMEM - ارتفاع نسبة الجلوكوزLGC / GibcoBR30211-05 / 12100046استخدم وسائط الثقافة الخاصة بخط الخلية المستخدمة.
EDTA (ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك)Sigma-AldrichE5314أو ما شابه ذلك
من مجهر Epifluorescence Axiovert 200Zeiss-orما شابه
ذلك FBS (مصل الأبقار الجنينية)Gibco12657-029أو ما شابه
ذلك من Forma Series II Water Jacketed CO2 حاضنةThermo Scientific 311013-998-074استخدم حاضنة الخلية الموجودة في مختبر
زجاج جرة منزلقةSigma-AldrichS5516أو ما شابه ذلك
من الجلسرينسيجما-ألدريتش56-81-5أو ما شابه
ذلك IduMillipore-SigmaI7125-Magnesium
ChlorideSynth7791-18-6أو ما شابه
ذلك من الميثانولMerck67-56-1أو
شرائحمجهر مماثلةDenvilleM1021بدلا من ذلك ، Olen - شرائح مجهر Kasvi - K5-7105 <قوي>أو < / قوي> خط زجاجي دقيق - 7105-1
MOPS (Á cido 3-morfolinopropano 1-sulf & ocirc ؛ nico)Synth1132-61-2أو ما شابه
ذلك NocodazoleSigma-Aldrich31430-18-9-PBS
(محلول ملحي عازل للفوسفات) LifeThechnologies3002أو ما شابه
ذلك Penicillin-StreptomycinGibco15140122أو ما شابه ذلك
ProLong Gold AntiFade MountantInvitrogenP36930أي محلول مضاد للتلاشي ل يمكن استخدام التألق المناعي
نوكلياز S1 المنقى من Aspergillus oryzae< / em>Invitrogen18001-016التخفيف المسبق للنوكلياز S1 (1/100 - 1/200) في المخزن المؤقت لتخفيف نوكلياز S1 الذي توفره الشركة المصنعة ، aliquote وتخزينه عند -20 درجة ؛ C
SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)BioRad161-0302أو ما شابه
ذلك من أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدراتسيجما-ألدريتش6131-90-4أو ما شابه
ذلك من كلوريد الصوديومموالفة  ؛ 7647-14-5أو ما شابه
ذلك من السكروزSigma-Aldrich57-50-1أو ما شابه
Tris BaseWest Lab ResearchBP152-1أو ما شابه
ذلك Triton X-100Synth9002-93-1أو ما شابه
ذلك TrypsinGibco25200072أو ما شابه
Tween 20Sigma-AldrichP1379أو مصباح UVC مماثل
غير محددأساسي: طول انبعاث 254 نانومتر
VLX-3W مقياس الأشعة فوق البنفسجيةVilber Loumart-أو ما شابه
من أسيتات الزنكSigma-Aldrich557-34-6أو ما شابه
الجليدي مماثلة ذلك ذلك ذلك ذلك

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, W. D., Howard-Flanders, P. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation. Journal of Molecular Biology. 31 (2), 291-304 (1968).
  2. Meneghini, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Fiber AssayReplication Fork DynamicsPost Replicative GapsS1 NucleaseSingle Stranded DNAGap Filling AssayDNA Replication StressGenome IntegrityImmunodetection MethodDNA Damage Repair

Related Articles