مقالة منهجية

بصريات غير خطية خالية من الملصقات لدراسة العيوب المعتمدة على التوبولين في المايلين المركزي

DOI:

10.3791/63449

⸱

مارس 24, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones en Óptica A.C. (CIO), 2Division of Sciences and Engineering, Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, Universidad de Guanajuato, 3Institute of Physiology, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, 4Dirección General de Desarrollo Internacional, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الخلايا قليلة التغصن المحملة بالأنابيب الدقيقة في نموذج لاعتلال الأنابيب من خلال نهج الفحص المجهري التوافقي الثاني البسيط والمبتكر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل التصور المرضي للمكونات الهيكلية الخلوية في الدماغ تحديا. إن التوزيع في كل مكان لشبكات الأنابيب الدقيقة والشعيرات الدقيقة والخيوط الوسيطة في جميع الأنسجة العصبية ، جنبا إلى جنب مع التباين في نتائج استراتيجيات اندماج البروتين الفلوري وقابليتها المحدودة للتطبيق على الدراسات الديناميكية للأجسام المضادة والأدوية كمركبات كروموفور ، تجعل الأساليب البصرية الكلاسيكية ليست فعالة مثل البروتينات الأخرى. عندما يحتاج التوبولين إلى الدراسة ، فإن الجيل الخالي من الملصقات من التوافقيات الثانية يعد خيارا مناسبا جدا بسبب التنظيم غير المتماثل للجزيء. يمكن لهذه التقنية ، عند اقترانها بالفحص المجهري ، أن تصف نوعيا التوزيع الحجمي للحزم المتوازية من الأنابيب الدقيقة في العينات البيولوجية ، مع ميزة إضافية تتمثل في العمل مع الأنسجة الطازجة غير الثابتة وغير المنفذة. يصف هذا العمل كيفية تصوير التوبولين باستخدام إعداد مجهري تجاري من الجيل التوافقي الثاني لتسليط الضوء على الأنابيب الدقيقة في الهياكل المخصبة بالأنبوبين في الخلايا قليلة التغصن ، كما هو الحال في نقص الميالين مع ضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) اعتلال الأنابيب ، وهو اضطراب المايلين الموصوف مؤخرا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصوير البصري للهياكل الهيكلية الخلوية في الأنسجة ومستحضرات الأعضاء ليست مهمة سهلة. خيوط الهيكل الخلوي موجودة في كل مكان ، لذلك إذا تم إجراء تلطيخ عام ، على سبيل المثال ، ضد ألفا توبولين أو بيتا أكتين أو يحتمل أن يكون الكيراتين في عينة ظهارية ، فمن المحتمل أن يتم توزيع الإشارة بشكل متجانس إلى حد ما في جميع أنحاء العينة. لتقييد التلوين إلى مجموعة فرعية أكثر وضوحا من المكونات الخلوية ، يمكن للمرء إما استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير المستهدف1 أو التخطيط لاستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالشكل المتساوي. في حين أن عددا قليلا جدا من هذه الأخيرة موجودة في السوق (ويوجد عدد قليل جدا منها على الإطلاق2،3،4) ، قد يتوفر نموذج حيواني معدل وراثيا. ومع ذلك ، يجب أن يحصل عليها المختبر وأن يتم إيواؤها بشكل صحيح ، مع جميع النفقات التي تنطوي عليها العملية. قد تكون بعض الأجسام المضادة أو المواد الكيميائية ، على سبيل المثال ، الأدوية المترافقة بالفلوروفور مثل phalloidin أو paclitaxel ، غير متوافقة جزئيا أو كليا مع الاستخدام في الخلايا أو الأنسجة الحية ، مما يحد من قابليتها للتطبيق على دراسات العينات الثابتة فقط.

في حالة التوبولين ، يجب أخذ جانب إضافي في الاعتبار ، وهو حساسية البوليمر للتثبيت. من المعروف أن التثبيت الكيميائي التقليدي بالفورمالديهايد غير كاف للحفاظ على سلامة الأنابيب الدقيقة على النحو الأمثل5. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد تقرير حديث أن تشابك الفورمالديهايد يؤدي إلى تغييرات طفيفة في البنية التحتية للأنابيب الدقيقة ، على غرار ما يحدث مع ربط بعض الأدوية أو الجزيئات الفسيولوجية مثل GTP6.

لذلك ، غالبا ما يكون التصور المباشر للأنابيب الدقيقة في العينات غير الملوثة وغير الثابتة أمرا مرغوبا فيه. لتحقيق ذلك ، فإن أحد الحلول التقنية هو الفحص المجهريللجيل التوافقي الثاني (SHG) 7 ، والذي يعتمد على قدرة حزم الأنابيب الدقيقة المتوازية على العمل كهارمونوفور وإصدار ضوء مضاعف التردد عند إضاءته بشكل صحيح باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي المكثف. على الرغم من أنه يمكن توليد إشارة توافقية ثانية أقوى وأكثر استقرارا من الكولاجين والميوسين ، وهما المادتان البيولوجيتان الأخريان الوحيدتان المعروفتان بأنهما قادران على مضاعفة التردد ، فقد تم استخدام الإشارة من التوبولين حتى الآن في الغالب لدراسة إعادة ترتيب المغزل الانقسامي8،9،10 ومورفولوجيا الأنابيب الدقيقة المحورية11،12،13.

في هذا العمل ، نقدم استخداما جديدا لمجهر SHG كأداة تشخيصية لتمييز أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS) المتأثرة باعتلال الأنابيب tubulin beta 4 A (TUBB4A) عن نظيراتها الصحية14. بعض الطفرات التي تحدث في هذا الشكل العصبي في الغالب من التوبولين ، مثل تلك التي تسبب نقص الميالين وضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) ، تحفز الأنابيب الدقيقة على ملء الخلايا قليلة التغصن15,16 ؛ ترتبط التغيرات الهيكلية الخلوية ، بدورها ، بتأثيرات المصب مثل خلل الميالين ، مع ضعف عميق في المسارات الحركية والحسية16،17،18،19. يعرض نموذج الفئران التايب المستخدم في هذا العمل محتوى الأنابيب الدقيقة غير الطبيعي في الخلايا قليلة التغصن ويلخص معظم الأعراض الحسية الحركية لمرضى H-ABC17. يشرح البروتوكول كيفية تصوير الهياكل مثل الجسم الثفني والمخيخ ، والتي عادة ما تكون شديدة الميالين والتي تتأثر بشدة في المرضى من البشر وكذلك في فأر تايب 19 ، لتسليط الضوء على الاختلافات في إشارات SH بين الأنسجة السليمة والمتحولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للقوانين والمدونات المعتمدة في العنوان السابع من لائحة قانون الصحة العامة فيما يتعلق بالبحوث الصحية للحكومة المكسيكية (NOM-062-ZOO-1999) ووفقا لتوصيات المعاهد الوطنية للصحة دليل رعاية واستخدام التجارب وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا في أبحاث جامعة غواناخواتو وجامعة بينيميريتا المستقلة بويبلا.

1. إعدادات المجهر

  1. قم بتشغيل نظام الفحص المجهري.
  2. قم بتشغيل الليزر النبضي للتأكد من أنه سيكون جاهزا للتفريغ بمستوى طاقة مثالي وثابت بعد استخراج العينة وتحضيرها.
  3. اضبط الليزر على 810 نانومتر. لدراسة الأنابيب الدقيقة tissular ، يتم استخدام 10 ٪ -20 ٪ من طاقة الليزر المتاحة ، والتي ، في النظام الموصوف ، تتوافق مع 13-26 ميغاواط تقاس في المستوى البؤري الخلفي للهدف.
  4. تأكد من أن المجهر محاذ لكوهلر (الملف التكميلي 1) ، مع الهدف الذي سيتم استخدامه لتصوير SHG.
    ملاحظة: هذا مهم لأنه في الإعداد التجاري المستخدم في هذا العمل ، يتم إجراء الكشف في وضع الإرسال ومن خلال المكثف.
  5. قم بإزالة المرشحات غير المرغوب فيها من مسار الكشف البصري (الشكل 1 أ).
  6. تأكد من فتح غشاء المكثف بالكامل لضمان عدم توقف أي ضوء دون داع عند هذا المستوى.
  7. قم بإعداد هدف غمر الزيت بفتحة عددية 25x/0.8 (NA) مع قطرة صغيرة من زيت الغمر في العدسة.
    ملاحظة: تم استخدام هذا الهدف لمطابقة المكثف NA بشكل أفضل ، والذي كان 0.55 (من الناحية المثالية ، NAcond ≥ NAobj).

2. الضوابط الأولية المجهر

ملاحظة: قم بإجراء عناصر التحكم المجهرية الأولية مرة واحدة، ما لم يتم تعديل الإعداد.

  1. صورة نشا الذرة الجافة محصورة بين الشرائح الزجاجية مع معلمات SHG لإنشاء صور SHG التي تكشف عن اتجاه استقطاب الليزر. اتبع الخطوات المذكورة في الملف التكميلي 2 ، باستثناء طاقة الليزر ، والتي تقل عن 5٪ لنشا الذرة.
  2. التقط صورة واحدة لحبيبات نشا الذرة المتناثرة ، وحدد اتجاه فصيصات SHG في المستوى x-y. يتوافق هذا الاتجاه مع اتجاه الليزر (الشكل 2 أ).
  3. كعنصر تحكم ، التقط صورة أخرى لنفس العينة ، وأدخل في المسار البصري لوحة نصف موجة (الموضع الموضح في الشكل 1 أ) لتغيير اتجاه تذبذب الليزر. تعرض الصورة الناتجة فصيصات إشارة SHG الدوارة (الشكل 2B ، C).
  4. إذا كنت تستخدم نوعا مختلفا من مرشح تمرير النطاق الترددي ل SHG ، فتأكد من أنه يتمتع بخصائص إرسال مثالية من خلال مقارنة الصور (الشكل 2D ، E) وشدة الإشارة بكسل تلو الآخر على طول مسح الخط (الشكل 2F).

3. استخراج الأنسجة

ملاحظة: استخدم دائما أدوات نظيفة لإجراء العمليات الجراحية.

  1. استخدم فئران تايب البالغة من العمر 6-12 شهرا وعناصر تحكم Sprague-Dawley المطابقة للعمر (WT).
  2. تخدير الحيوانات بحقن حقن خليط من الكيتامين-زيلازين (0.125 ملغ/كغ و5 ملغ/كغ) المخفف في محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪.
    1. تحقق من ردود الفعل الألم ، والمضي قدما فقط إذا كانت غائبة.
  3. التضحية بالحيوان عن طريق قطع الرأس.
  4. بمجرد عزل الرأس ، افتح عظام قبو الجمجمة بعناية على طول خط الوسط ، بدءا من النقطة الذيلية في الأعلى باتجاه الأنف ، ومن التجاويف المدارية نحو خط الوسط ، ثم من النقطة الذيلية إلى أسفل الدماغ والمخيخ.
    ملاحظة: تسمح قواطع العظام و Rongeurs بالإزالة الصحيحة لعظام الرأس دون الإضرار بهياكل الدماغ.
  5. حرر الدماغ والمخيخ من العظم. يمكن فصل نصفي الكرة الأرضية. إذا تم تقسيم نصفي الكرة الأرضية ، فاستخدم نصفا لتصوير SHG ، وقم بتثبيت النصف الآخر في 3.7٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 20 دقيقة داخل غطاء كيميائي للتقسيم والتلوين اللاحق.

4. تقسيم الاهتزاز

  1. قم بإعداد صينية عازلة اهتزازية مملوءة بمحلول الملح المتوازن (HBSS) الدافئ (37 درجة مئوية).
  2. ثبت الدماغ على لوحة العينة باستخدام غراء cyanoacrylate عبر قطعة من الشريط اللاصق. يتصل الجزء / المنطقة الأكثر ذيلية بالغراء بحيث يمكن قطع الأجزاء الإكليلية القابلة للاستخدام من الجزء المعاكس المنقار.
    1. السماح ~ 10 ثانية للغراء لبلمرة للحصول على مرفق فعال للعينة.
      ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم توجيه الدماغ بحيث تقطع الشفرة "من أعلى إلى أسفل" بدلا من "من جانب إلى آخر" (الشكل 1 ب).
  3. انقل لوحة العينة إلى دعامتها المغناطيسية داخل الدرج العازل.
  4. ابدأ في قطع أقسام 300-500 ميكرومتر حتى تشمل الشرائح المنتجة سطح الدماغ بالكامل.
  5. عند هذه النقطة ، قلل سمك القسم إلى 160 ميكرومتر.
  6. بمجرد قطع قسم كامل 160 ميكرومتر على مستوى الجسم الثفني ، قم باستعادته باستخدام ماصة باستور زجاجية معدلة مع فتحة كبيرة ملتهبة (الشكل 1C).
  7. انقله إلى طبق بتري نظيف مع HBSS دافئ جديد أو مباشرة على الدعامة الزجاجية للفحص المجهري (غطاء غطاء أو طبق ذو قاع زجاجي).
    ملاحظة: بالنسبة للظروف التجريبية الموصوفة ، فإن إضافة غطاء فوق العينة يضر بالتصوير.

5. نقل إلى المجهر

  1. إذا كان المجهر في غرفة مختلفة ، فقم بإعداد صندوق معزول به عبوات هلام دافئة لنقل أقسام الأنسجة مع الحفاظ على درجة الحرارة. يعمل الصندوق أيضا على إبقاء الأقسام دافئة حتى يتم تصويرها.
  2. ضع العينة تحت المجهر ، وتأكد من وضعها بشكل صحيح تحت الهدف عن طريق الملاحظة المباشرة من خلال المنظار مع الضوء المرسل.
    ملاحظة: الهدف هو محاذاة هياكل الانبعاث المتوقعة مع اتجاه تذبذب الليزر لزيادة إشارة SHG المنبعثة (وبالتالي المكتشفة).
  3. قم بإزالة HBSS الزائد بحيث يغطي فيلم سائل رقيق العينة بأكملها. تحقق بصريا من الفيلم السائل كل بضع دقائق لتجنب التبخر المفرط وتجفيف العينة.
    ملاحظة: في الظروف الموضحة ، يتم استخدام قسم لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة. يؤدي تجفيف العينة إلى تأثيرات أثرية جذرية (الشكل التكميلي 1 أ). بدلا من إضافة المزيد من HBSS ، يوصى بالنقع الدوري للقسم في وسط دافئ وجديد إذا كانت هناك حاجة إلى أوقات تصوير أطول. يوصى أيضا باستخدام غرف التروية والغراء أو الأغاروز منخفض الانصهار لشل حركة الأنسجة عند إجراء تجارب أطول.
  4. قم بإعداد مرحلة المجهر للتصوير غير الممسوح ضوئيا ، والذي قد يشمل إغلاق جميع أبواب غرفة الحضانة المظلمة أو تغطية غرفة الحضانة بنسيج أسود مطلي بالنايلون البولي يوريثين.

6. التصوير

  1. حدد وضع التصوير "غير الممسوح ضوئيا" على طول مسار الإرسال. بهذه الطريقة ، سيتم تحسين التقاط إشارة SH الضعيفة للتوبولين.
  2. حدد هدف خطة LCI-Neofluar 25x / 0.8 NA.
  3. اضبط طاقة الليزر بين 13 ميجاوات و 26 ميجاوات ، مع وقت سكون بكسل يبلغ 12.6 ميكرو ثانية. التقط صورا لا يزيد حجمها عن 512 بكسل × 512 بكسل ، بسرعة 5 ومتوسط 2 ، بمتوسط وقت اكتساب يبلغ حوالي 15 ثانية.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام قوى ليزر أعلى و / أو أوقات مكوث أطول إلى إتلاف العينة (الشكل التكميلي 1 ب).
  4. التقط الصور أولا باستخدام مرشح تمرير قصير 485 نانومتر (SP485) ، وفي الخطوة الثانية ، أضف مرشح تمرير نطاق حاد 405 نانومتر (BP405; الشكل 3). اتبع الخطوات الواردة في الملف التكميلي 2.
    ملاحظة: يمكن التقاط صور الحقل الساطع الزائف من خلال نفس الكاشف باستخدام ضوء الليزر المتبقي لخط مرئي (يعمل الليزر 405 نانومتر أو 488 نانومتر بشكل أفضل).

7. معالجة المخيخ

  1. أولا ، قم بقطع المخيخ بمشرط إلى نصفي الكرة الأرضية ، ثم قم بلصقهما على دعم الاهتزاز بواسطة الجزء الأوسط (الجزء المسطح الذي تم الحصول عليه بعد القطع).
  2. قسم وصورة المخيخ بنفس الطريقة التي تم وصفها للدماغ (أقسام 160 ميكرومتر ، نفس إعدادات الاهتزاز ، نفس الشفرة ، نفس إعدادات المجهر ، إلخ).
    ملاحظة: بسبب تشريح المخيخ ، فإن اتجاهه في لحظة التقسيم ليس حرجا ؛ في معظم الشرائح المتولدة بعيدا عن السطح ، ستكون هناك ورقة مقسمة جيدا إلى المادة البيضاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصور التي تم الحصول عليها باستخدام هذه المنهجية لها مستوى خلفية منخفض جوهري بسبب العدد المحدود جدا من harmonophores الموجودة في الأنسجة البيولوجية ، والتي تعد واحدة من المزايا الهامة للطريقة.

عندما يتم تصوير ألياف الجسم الثفني ، يمكن العثور باستمرار على هياكل قصيرة تشبه الألياف وعناصر مستديرة في دماغ تايب (الشكل 3 ب) ، بينما يظهر الجسم الثفني في الدماغ المتحكم إشارة أكثر تباينا وخواصا في جميع أنحاء منطقة الدماغ (الشكل 3 أ). ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الفحص المجهري SHG جزءا من مجموعة من تقنيات البصريات غير الخطية ، والتي تشمل الفحص المجهري للإثارة ثنائي الفوتون ، والمجهر من الجيل التوافقي الثالث ، والمجهر المتماسك المضاد لستوكس رامان ، والتي ساهمت في توسيع نطاق تطبيقات المجهر الضوئي التقليدي لعلوم الحياة20.

على وجه التحديد ، تتعلق القوة والضعف الرئيسية لمجهر SHG بنفس الحالة: مولد الإشارة غير متماثل21. غالبا ما توجد مثل هذه الحالة المعمارية المحددة في عالم البلورات العضوية وغير العضوية ولكن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) من خلال المنح التالية: infraestructura 226450 إلى VP-CIO ، والبنية التحتية 255277 إلى V.P. ، و FORDECYT-PRONACES / 194171/2020 إلى V.H. نحن نعترف بدعم جوفينال هيرنانديز جيفارا في CIO في صناعة الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
405/10 نانومتر مرشح ممر النطاق أحادي النطاق BrightLine (R)   ؛سيمروكFF01-405 / 10-25قطر 32 مم ، مع حلقة مبيت
نايلون أسود ، قماش مطلي بالبولي يوريثينThorlabsبي كيه 55 قدم × 9 بوصات (1.5 م × 2.7 م) × 0.005 بوصة (0.12 مم) سميك 
شفرات للاهتزازأي إعلان تجاري؛ على سبيل المثال سيف ويلكنسون  شفرات حلاقة كلاسيكية من الفولاذ المقاوم للصدأ مزدوجة الحواف
أطباق زراعة الخلايا ، 35 ممأي إعلان تجاري؛ على سبيل المثال الصقر351008
المجهر متحد البؤرزييسLSM710NLO أكسيو أوبزرفر Z1مجهر مقلوب ، الهدف المستخدم هو LCI Plan-Neofluar 25x / 0.8 NA & nbsp ؛
مبردأي إعلان تجارييمكن أن يعمل أي صندوق بوليسترين معزول ، للحفاظ على العينة عند حوالي 37 درجة ؛ C
ستش الذرةعلى سبيل المثال مايزينامن السوبر ماركت
أغطية # 1.5أي إعلان تجاريمستطيل
غراء سيانوأكريليتعلى سبيل المثال Loctiteللصق الدماغ على شريط التقنيع
ملقط ناعمأدوات العلوم الجميلة11412-11لمعالجة أقسام الأنسجة عن طريق التعامل مع السحايا
مقص ناعمأدوات العلوم الجميلة14370-22لقص الجلد 
مقص غرام طرف منحنيأدوات العلوم الجميلة14061-09لقطع على طول خط الوسط
الفورمالديهايد 37٪سيجما ألدريتش252549لتخفيف 1:10 في برنامج تلفزيوني
فريدمان رونجورأدوات العلوم الجميلة16000-14لقطع العظم
عبوات جلأي إعلان تجاريتم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة ؛ C ، للمساعدة في الحفاظ على درجة الحرارة داخل المبرد
ماصة باستور زجاجية ، معدلةأي إعلان تجاريلنقل قسم الأنسجة
هانكس ورئيس الوزراء. محلول الملح المتوازن (HBSS)جيبكو14025-076يمكن تحضيرها من المساحيق
مرقئ كيليأدوات العلوم الجميلة13018-14لفصل العظم   ؛
شريط اخفاءأي إعلان تجاريلحماية سطح لوحة العينة
وحدة NDD ، النوع Cزييس000000-1410-101للكشف عن الإشارة ، مما يقلل من فقدان الضوء. إسكان مجموعة مرشح 000000-1935-163 مع SP485
أوفست كماش العظامأدوات العلوم الجميلة16101-10لقطع العظم
محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS)جيبكو10010-031يمكن تحضيرها من مساحيق أو علامات تبويب
الليزر النبضيمتماسكرؤية الحرباء II680 – ليزر قابل للضبط 1080 نانومتر
مشرطأي إعلان تجاريشفرة مستقيمة مع نقطة حادة
ملقط نمط قياسيأدوات العلوم الجميلة11000-18
فاناس مقص زنبركيأدوات العلوم الجميلة15018-10لقطع السحايا التي تبقى مرتبطة بكل من الشريحة التي تم الحصول عليها من القطع الاهتزازي والقسم الملصق على لوحة العينة.
الاهتزازأي إعلان تجاري؛ على سبيل المثال لايكاالمحرك VT1200

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
  2. Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
  3. Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
  4. Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
  5. Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
  6. Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530(2019).
  7. Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277(2001).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Yu, C. -H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
  10. Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758(2017).
  11. Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
  12. Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418(2009).
  13. Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292(2018).
  14. Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417(2022).
  15. Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
  16. Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
  17. Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555(2020).
  18. Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
  19. Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039(2021).
  20. Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363(2020).
  21. Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001(2017).
  22. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  23. vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466(2002).
  24. Stoller, P., Kim, B. -M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205(2002).
  25. Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
  26. Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة