في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الخلايا قليلة التغصن المحملة بالأنابيب الدقيقة في نموذج لاعتلال الأنابيب من خلال نهج الفحص المجهري التوافقي الثاني البسيط والمبتكر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بصريات غير خطية خالية من الملصقات لدراسة العيوب المعتمدة على التوبولين في المايلين المركزي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمثل التصور المرضي للمكونات الهيكلية الخلوية في الدماغ تحديا. إن التوزيع في كل مكان لشبكات الأنابيب الدقيقة والشعيرات الدقيقة والخيوط الوسيطة في جميع الأنسجة العصبية ، جنبا إلى جنب مع التباين في نتائج استراتيجيات اندماج البروتين الفلوري وقابليتها المحدودة للتطبيق على الدراسات الديناميكية للأجسام المضادة والأدوية كمركبات كروموفور ، تجعل الأساليب البصرية الكلاسيكية ليست فعالة مثل البروتينات الأخرى. عندما يحتاج التوبولين إلى الدراسة ، فإن الجيل الخالي من الملصقات من التوافقيات الثانية يعد خيارا مناسبا جدا بسبب التنظيم غير المتماثل للجزيء. يمكن لهذه التقنية ، عند اقترانها بالفحص المجهري ، أن تصف نوعيا التوزيع الحجمي للحزم المتوازية من الأنابيب الدقيقة في العينات البيولوجية ، مع ميزة إضافية تتمثل في العمل مع الأنسجة الطازجة غير الثابتة وغير المنفذة. يصف هذا العمل كيفية تصوير التوبولين باستخدام إعداد مجهري تجاري من الجيل التوافقي الثاني لتسليط الضوء على الأنابيب الدقيقة في الهياكل المخصبة بالأنبوبين في الخلايا قليلة التغصن ، كما هو الحال في نقص الميالين مع ضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) اعتلال الأنابيب ، وهو اضطراب المايلين الموصوف مؤخرا.
المقدمة
التصوير البصري للهياكل الهيكلية الخلوية في الأنسجة ومستحضرات الأعضاء ليست مهمة سهلة. خيوط الهيكل الخلوي موجودة في كل مكان ، لذلك إذا تم إجراء تلطيخ عام ، على سبيل المثال ، ضد ألفا توبولين أو بيتا أكتين أو يحتمل أن يكون الكيراتين في عينة ظهارية ، فمن المحتمل أن يتم توزيع الإشارة بشكل متجانس إلى حد ما في جميع أنحاء العينة. لتقييد التلوين إلى مجموعة فرعية أكثر وضوحا من المكونات الخلوية ، يمكن للمرء إما استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير المستهدف1 أو التخطيط لاستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالشكل المتساوي. في حين أن عددا قليلا جدا من هذه الأخيرة موجودة في السوق (ويوجد عدد قليل جدا منها على الإطلاق2،3....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للقوانين والمدونات المعتمدة في العنوان السابع من لائحة قانون الصحة العامة فيما يتعلق بالبحوث الصحية للحكومة المكسيكية (NOM-062-ZOO-1999) ووفقا لتوصيات المعاهد الوطنية للصحة دليل رعاية واستخدام التجارب وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات البيولوجيا في أبحاث جامعة غواناخواتو وجامعة بينيميريتا المستقلة بويبلا.
1. إعدادات المجهر
- قم بتشغيل نظام الفحص المجهري.
- قم بتشغيل الليزر النبضي للتأكد من أنه سيكون جاهزا للتفريغ بمستوى طاقة مثالي وثابت بعد استخراج العينة وتحضيرها.
- اضبط الليزر على 810 نانومتر. لدراسة الأنابيب الدقيقة tissular ، يتم استخدام 1....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الصور التي تم الحصول عليها باستخدام هذه المنهجية لها مستوى خلفية منخفض جوهري بسبب العدد المحدود جدا من harmonophores الموجودة في الأنسجة البيولوجية ، والتي تعد واحدة من المزايا الهامة للطريقة.
عندما يتم تصوير ألياف الجسم الثفني ، يمكن العثور باستمرار على هياكل قصيرة تشبه الألياف وعناصر مستديرة في دماغ تايب (الشكل 3 ب) ، بينما يظهر الجسم الثفني في الدماغ المتحكم إشارة أكثر تباينا وخواصا في جميع أنحاء منطقة الدماغ (الشكل 3 أ). .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد الفحص المجهري SHG جزءا من مجموعة من تقنيات البصريات غير الخطية ، والتي تشمل الفحص المجهري للإثارة ثنائي الفوتون ، والمجهر من الجيل التوافقي الثالث ، والمجهر المتماسك المضاد لستوكس رامان ، والتي ساهمت في توسيع نطاق تطبيقات المجهر الضوئي التقليدي لعلوم الحياة20.
على وجه التحديد ، تتعلق القوة والضعف الرئيسية لمجهر SHG بنفس الحالة: مولد الإشارة غير متماثل21. غالبا ما توجد مثل هذه الحالة المعمارية المحددة في عالم البلورات العضوية وغير العضوية ولكن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) من خلال المنح التالية: infraestructura 226450 إلى VP-CIO ، والبنية التحتية 255277 إلى V.P. ، و FORDECYT-PRONACES / 194171/2020 إلى V.H. نحن نعترف بدعم جوفينال هيرنانديز جيفارا في CIO في صناعة الفيديو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 405/10 نانومتر مرشح ممر النطاق أحادي النطاق BrightLine (R) ؛ | سيمروك | FF01-405 / 10-25 | قطر 32 مم ، مع حلقة مبيت |
| نايلون أسود ، قماش مطلي بالبولي يوريثين | Thorlabs | بي كيه 5 | 5 قدم × 9 بوصات (1.5 م × 2.7 م) × 0.005 بوصة (0.12 مم) سميك |
| شفرات للاهتزاز | أي إعلان تجاري؛ على سبيل المثال سيف ويلكنسون | شفرات حلاقة كلاسيكية من الفولاذ المقاوم للصدأ مزدوجة الحواف | |
| أطباق زراعة الخلايا ، 35 مم | أي إعلان تجاري؛ على سبيل المثال الصقر | 351008 | |
| المجهر متحد البؤر | زييس | LSM710NLO أكسيو أوبزرفر Z1 | مجهر مقلوب ، الهدف المستخدم هو LCI Plan-Neofluar 25x / 0.8 NA & nbsp ؛ |
| مبرد | أي إعلان تجاري | يمكن أن يعمل أي صندوق بوليسترين معزول ، للحفاظ على العينة عند حوالي 37 درجة ؛ C | |
| ستش الذرة | على سبيل المثال مايزينا | من السوبر ماركت | |
| أغطية # 1.5 | أي إعلان تجاري | مستطيل | |
| غراء سيانوأكريليت | على سبيل المثال Loctite | للصق الدماغ على شريط التقنيع | |
| ملقط ناعم | أدوات العلوم الجميلة | 11412-11 | لمعالجة أقسام الأنسجة عن طريق التعامل مع السحايا |
| مقص ناعم | أدوات العلوم الجميلة | 14370-22 | لقص الجلد |
| مقص غرام طرف منحني | أدوات العلوم الجميلة | 14061-09 | لقطع على طول خط الوسط |
| الفورمالديهايد 37٪ | سيجما ألدريتش | 252549 | لتخفيف 1:10 في برنامج تلفزيوني |
| فريدمان رونجور | أدوات العلوم الجميلة | 16000-14 | لقطع العظم |
| عبوات جل | أي إعلان تجاري | تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة ؛ C ، للمساعدة في الحفاظ على درجة الحرارة داخل المبرد | |
| ماصة باستور زجاجية ، معدلة | أي إعلان تجاري | لنقل قسم الأنسجة | |
| هانكس ورئيس الوزراء. محلول الملح المتوازن (HBSS) | جيبكو | 14025-076 | يمكن تحضيرها من المساحيق |
| مرقئ كيلي | أدوات العلوم الجميلة | 13018-14 | لفصل العظم ؛ |
| شريط اخفاء | أي إعلان تجاري | لحماية سطح لوحة العينة | |
| وحدة NDD ، النوع C | زييس | 000000-1410-101 | للكشف عن الإشارة ، مما يقلل من فقدان الضوء. إسكان مجموعة مرشح 000000-1935-163 مع SP485 |
| أوفست كماش العظام | أدوات العلوم الجميلة | 16101-10 | لقطع العظم |
| محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS) | جيبكو | 10010-031 | يمكن تحضيرها من مساحيق أو علامات تبويب |
| الليزر النبضي | متماسك | رؤية الحرباء II | 680 – ليزر قابل للضبط 1080 نانومتر |
| مشرط | أي إعلان تجاري | شفرة مستقيمة مع نقطة حادة | |
| ملقط نمط قياسي | أدوات العلوم الجميلة | 11000-18 | |
| فاناس مقص زنبركي | أدوات العلوم الجميلة | 15018-10 | لقطع السحايا التي تبقى مرتبطة بكل من الشريحة التي تم الحصول عليها من القطع الاهتزازي والقسم الملصق على لوحة العينة. |
| الاهتزاز | أي إعلان تجاري؛ على سبيل المثال لايكا | المحرك VT1200 |
المراجع
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
