يتم توضيح التحضير المكثف ل "أنابيب" البطانية الدماغية للفئران السليمة من الشرايين المتنية الدماغية لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي. علاوة على ذلك ، نوضح نقاط القوة التجريبية لنموذج الدراسة البطانية هذا للتصوير الفلوري وقياس الفيزيولوجيا الكهربية لمسارات الإشارات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك التغيرات في داخل الخلايا [Ca2+] وإمكانات الغشاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزل والتحليل الوظيفي للبطانة الشريانية لحمة دماغ الفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم نقل تدفق الدم الدماغي عن طريق الشرايين المقاومة للأوعية الدموية والشرايين المتنية في المصب. تزداد مقاومة الأوعية الدموية الثابتة لتدفق الدم مع انخفاض القطر من الشرايين إلى الشرايين التي تغذي الشعيرات الدموية في نهاية المطاف. نظرا لصغر حجمها وموقعها في الحمة ، فقد لم تتم دراسة الشرايين بشكل كاف نسبيا ومع قابلية أقل للتكرار في النتائج من الشرايين البينية السطحية. وبغض النظر عن ذلك، فإن بنية الخلايا البطانية الشريانية ووظيفتها - وهي جزء لا يتجزأ من فسيولوجيا ومسببات الأمراض التنكسية المزمنة - تتطلب تحقيقا مكثفا. على وجه الخصوص ، تظهر الأدلة الناشئة أن الوظيفة البطانية المعرضة للخطر تسبق وتفاقم الضعف المعرفي والخرف.
في دوران الأوعية الدقيقة المتني ، تعد وظيفة قناة K + البطانية أقوى حافز للتحكم بدقة في انتشار توسع الأوعية لتعزيز الزيادات في تدفق الدم إلى مناطق النشاط العصبي. توضح هذه الورقة طريقة مكررة لعزل "الأنابيب" البطانية السليمة والمقترنة كهربائيا (قطرها ، ~ 25 ميكرومتر) من الشرايين المتنية في دماغ الفأر. يتم تأمين الأنابيب البطانية الشريانية خلال الظروف الفسيولوجية (37 درجة مئوية ، درجة الحموضة 7.4) لحل المتغيرات التجريبية التي تشمل وظيفة قناة K + وتنظيمها ، بما في ذلك ديناميكيات Ca2 + داخل الخلايا ، والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وتنظيم الدهون الغشائية. الميزة التقنية المميزة مقابل البطانة الشريانية هي الدقة المورفولوجية المعززة لأبعاد الخلايا والعضيات (مثل الميتوكوندريا) ، مما يوسع فائدة هذه التقنية. ينطوي التروية الدماغية الصحية طوال الحياة على وظيفة بطانية قوية في الشرايين المتنية ، مما يربط مباشرة تدفق الدم بتغذية النشاط العصبي والدبقي في جميع أنحاء المناطق التشريحية الدقيقة من الدماغ. وبالتالي ، من المتوقع أن تقدم هذه الطريقة بشكل كبير المعرفة العامة لفسيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الأعصاب فيما يتعلق بالدماغ السليم والمريض.
المقدمة
توفر الشرايين المتنية مباشرة الأكسجين والمواد المغذية الأساسية في جميع أنحاء الدماغ1. أثناء التفاعل مع الشعيرات الدموية ، تستجيب الشرايين عالية النشاط للأوعية الدموية للإشارات الرجعية التي تبدأها قنوات الأيونات الشعرية التي تستشعر إشارات التمثيل الغذائي من مناطق عصبية محددة2. مع تلقي حمة الدماغ تاريخيا الجزء الأكبر من التحقيق ، ظهر الآن دور للخلل الوظيفي البطاني لتوضيح الآليات المرضية المرتبطة بمختلف الاضطرابات الدماغية الوعائية التي تكمن وراء الخرف (على سبيل المثال ، السكتة الدماغية الإقفارية ، مرض الزهايمر)3،4،5،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يجب على المجربين التأكد من أن الاستخدام المعين للحيوانات والبروتوكولات المرتبطة بها تتم الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) ويتم تنفيذه وفقا ل دليل رعاية واستخدام المختبر الصادر عن المجلس الوطني للبحوث (الطبعة 8 ، 2011) وإرشادات ARRIVE. وافقت IACUC من جامعة لوما ليندا وجامعة أريزونا على جميع البروتوكولات المستخدمة لهذه المخطوطة للفئران C57BL/6N و 3xTg-AD (الذكور والإناث ؛ الفئة العمرية: 2-30 شهرا). انظر الشكل 1 كنظرة عامة على عزل وفحص الأنابيب البطانية الشريانية المعزولة حديثا من الشرايين المتنية للفئران في الدماغ.
1. المواد والمعدات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر عرض توضيحي للبروتوكول في الشكل 1 مع خطوات تشريح الشرايين وعزل الأنبوب البطاني في الشكل 2 والشكل 3 ، على التوالي. هنا ، تم تقييم الوظيفة البطانية عن طريق قياس [Ca 2 +] i و Vm باستخدام القياس الضوئي Fura-2 والفيزيولوجيا الكهربية الحادة (الشكل 4A) استجابة لعامل دوائي [2-methylthioadenosine diphosphate (MTA) ، وهو ناهض مستقبلات بيورينيرجي قوية (P2YR)] عند 37 درجة مئوية........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الأمراض الدماغية الوعائية (CVD) والشيخوخة ومرض الزهايمر مرتبطة ارتباطا وثيقا وهي موضوع حالي لأبحاث الخرف4،8،14،21. وبالتالي ، من الواضح أن دراسات الشبكة الدماغية الوعائية سيكون لها تأثير واسع النطاق على الصحة بينما تتطلب مواصلة التحقيق المكثف خلال ظروف المرض. كنقطة مهمة لمقاومة الأوعية الدموية للتروية الدماغية ، تم تسليط الضوء على الأهمية العامة للشرايين المتنية في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R00AG047198 & R56AG062169 إلى EJB; R00HL140106 إلى PWP) وجمعية الزهايمر (AZRGD-21-805835 إلى PWP). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو جمعية الزهايمر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مكبرات | الصوت الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية | Axoclamp 2B & amp Axoclamp 900A | |
| شاشات خط الأساس المسموعة | Ampol US LLC ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | ؛ مبرد الحمام BM-A-TM | |
| (ISOTEMP 500LCU) | 13874647 | ThermoFisher Scientific | |
| (التثبيت)الشعيرات | من Warner | Instruments G150T-6 | |
| (أقطاب كهربائية حادة) | من Warner Instruments | GC100F-10 | |
| (Trituration) | Precision Instruments (WPI) ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1B100-4 | |
| BSA: ألبومين مصل الأبقار | Sigma | A7906 | |
| CaCl2: كلوريد الكالسيوم | سيجما | 223506 | |
| كولاجيناز (مزيج من النوع H)زجاج | الغطاء Sigma | C8051 | |
| (2.4 & مرات; 5.0 سم) | ThermoFisher Scientific | 12-548-5M | |
| جزيئية محول رقمي للحصول على البيانات | ، صنيفيل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | تشريح Digidata 1550A | |
| (زجاج بتري مع قاع سيلجارد الفحم) أجهزة | أنظمة المعيشة ، مدينة سانت ألبانز ، فاتو ، الولايات المتحدة الأمريكية | DD-90-S-BLK | |
| Dithioerythritol | Sigma | D8255 | |
| DMSO: ثنائي ميثيل سلفوكسيد | Sigma | D8418 | |
| Elastase (البنكرياس الخنازير) | Sigma | E7885 | |
| Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red ، BODIPY TR Glibenclamide) | ThermoFisher Scientific | E34250 | |
| مصادر ضوء الألياف البصرية | ؛ شوت ، ماينز ، ألمانيا و KL200 ، Zeiss | Fostec 8375 | |
| صمام التحكم | التدفق Warner Instruments | ؛ | |
| ، مصباح ARC ومصدر الطاقة ، hyperswitch و PMT | Molecular Devices ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية | ملقط أنظمة | |
| (ناعم الرؤوس ، شحذ) | FST | Dumont # 5 & Dumont # 55 | |
| Function Generator | EZ Digital ، سيول ، كوريا الجنوبية | FG-8002 | |
| Fura-2 AM صبغة | Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | F14185 | |
| الجلوكوز | سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية) | G7021 | |
| حمض الهيدروكلوريك: حمض الهيدروكلوريك | ThermoFisher Scientific (بيتسبرغ ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) | A466250 | |
| Headstages | الجزيئية الأجهزة | HS-2A & HS-9A | |
| HEPES: (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض ) | سيجما | H4034 | |
| سخان المحلول | المضمن Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl: كلوريد البوتاسيوم | Sigma | P9541 | |
| MgCl2: كلوريد المغنيسيوم | Sigma | M2670 | |
| Microforge | Narishige ، إيست ميدو ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | MF-900 | |
| Micromanipulator | Siskiyou | مجتذب الماصات الدقيقة MX10 | |
| (رقمي) | Sutter Instruments، نوفاتو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية | P-97 أو P-1000 | |
| (مقلوب من نيكون) | Nikon Instruments Inc، ميلفيل، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية | مجهر TS2 | |
| (مقلوب من نيكون) | أهداف Nikon Instruments Inc | Eclipse TS100 | |
| Microscope | Nikon Instruments Inc | 20X (S-Fluor) و 40X (Plan Fluor) | |
| منصة المجهر (الألومنيوم المؤكسد ؛ القطر ، 7.8 & nbsp ؛ سم) | Warner Instruments | PM6 أو PH6 | |
| مرحلة المجهر (الألومنيوم) | Siskiyou ، Grants Pass ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية | 8090P | |
| Microsyringe Pump Controller | World Precision Instruments (WPI) ، ساراسوتا ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية | SYS-MICRO4 | |
| MTA: 2-Methylthioadenosine ثنائي الفوسفات ملح ثلاثي الصوديوم | Tocris | 1624 | |
| كلوريد الصوديوم: كلوريد الصوديوم | سيجما | S7653 | |
| هيدروكسيد الصوديوم: هيدروكسيد الصوديوم | Sigma | S8045 | |
| وصمة عار نووية (كاشف NucBlue Live ReadyProbes; Hoechst 33342) | ThermoFisher Scientific | R37605 | |
| راسم الذبذبات | Tektronix ، بيفرتون ، أوريغون ، الولايات المتحدة الأمريكية | ؛ TDS 2024B | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| أهداف تباين المرحلة | Nikon Instruments Inc | ( Ph1 DL ؛ 10X & 20X) | |
| صبغة غشاء البلازما (CellMask أحمر غامق) | ThermoFisher Scientific | C10046 | |
| غرفة الصهر الزجاجي | Warner Instruments ، كامدن ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية | RC-27 | |
| مقص (شفرات 3 مم و 7 مم) | العلوم الدقيقة (أو FST) ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية | مقص موريا MC52 & 15000-00 | |
| (نمط Vannas ؛ 9.5 & nbsp ؛ مم & 3 شفرات مم) | أدوات الدقة العالمية | 555640S ، 14364 | |
| المجاهر المجسم | زايس ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | حقنة Stemi 2000 و 2000-C | |
| (0.22 & micro ؛ م) | ThermoFisher Scientific | 722-2520 | |
| وحدة تحكم في درجة الحرارة (قناة مزدوجة) | Warner Instruments | TC-344B أو C | |
| نظام التحكم في الصمام | Warner Instruments | VC-6 | |
| التصنيع الفني لجدول عزل الاهتزاز | ، Peabody ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | & nbsp ؛ مايكرو ز |
المراجع
- Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
- Longden, T. A., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
