نقدم هنا بروتوكولا حول كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران لتصوير فيديو الفاصل الزمني ل Ca2+ داخل الخلايا للبحث في الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري في نموذج الفئران hSOD1G93A .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الثقافات الأولية للخلايا النجمية للفئران والخلايا الدبقية الصغيرة واستخدامها في دراسة التصلب الجانبي الضموري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوضح هذا البروتوكول كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة فئران Sprague Dawley وكيفية استخدام هذه الخلايا لغرض دراسة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في نموذج الفئران hSOD1G93A . أولا ، يوضح البروتوكول كيفية عزل وزراعة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة الفئران بعد الولادة ، ثم كيفية توصيف واختبار هذه الثقافات من أجل النقاء عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام علامة البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) للخلايا النجمية وجزيء محول الكالسيوم المتأين 1 (Iba1) علامة الخلايا الدبقية الصغيرة. في المرحلة التالية ، يتم وصف طرق تحميل الصبغة (Fluo 4-AM الحساسة للكالسيوم) للخلايا المستزرعة وتسجيلات تغييرات Ca2+ في تجارب تصوير الفيديو على الخلايا الحية.
تتكون أمثلة تسجيلات الفيديو من: (1) حالات تصوير Ca2+ للخلايا النجمية المستزرعة المعرضة بشكل حاد للغلوبولين المناعي G (IgG) المعزول من مرضى ALS ، مما يدل على استجابة مميزة ومحددة مقارنة بالاستجابة ل ATP كما هو موضح في نفس التجربة. تظهر الأمثلة أيضا ارتفاعا عابرا أكثر وضوحا في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الذي يثيره ALS IgG في الخلايا النجمية hSOD1G93A مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا. (2) تصوير Ca 2+ للخلايا النجمية المستزرعة أثناء استنفاد مخازن الكالسيوم بواسطة thapsigargin (Thg) ، وهو مثبط غير تنافسي للشبكة الإندوبلازمية Ca 2+ ATPase ، متبوعا بدخول الكالسيوم الذي يتم تشغيله في المتجر الناتج عن إضافة الكالسيوم في محلول التسجيل ، مما يوضح الفرق بين تشغيل مخزن Ca 2+ في hSOD1G93A وفي الخلايا النجمية غير المعدلة وراثيا ؛ (3) تصوير Ca2+ للخلايا الدبقية الصغيرة المستزرعة يظهر في الغالب عدم الاستجابة ل ALS IgG ، في حين أن تطبيق ATP أثار تغيير Ca2 +. تؤكد هذه الورقة أيضا على المحاذير والتحذيرات المحتملة فيما يتعلق بكثافة الخلايا الحرجة ونقاء الثقافات ، واختيار التركيز الصحيح لصبغة Ca2+ وتقنيات تحميل الصبغة.
المقدمة
أدت تقنيات زراعة الخلايا إلى العديد من التطورات في مجالات متنوعة من الفيزيولوجيا العصبية الخلوية في الصحة والمرض. على وجه الخصوص ، تسمح مزارع الخلايا الأولية ، المعزولة حديثا من الأنسجة العصبية لحيوان المختبر ، للمجرب بدراسة سلوك الخلايا المتنوعة عن كثب في وسائط كيميائية حيوية وإعدادات فسيولوجية مختلفة. يوفر استخدام مؤشرات فسيولوجية فلورية مختلفة مثل الأصباغ الحساسة ل Ca2+ مع الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني رؤية أفضل للعمليات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي.
ALS هو مرض تنكسي عصبي مدمر يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية1. هذا المرض لديه إمراض معقد من النوع الع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب وفقا لتوجيهات الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات للأغراض العلمية وبإذن من اللجنة الأخلاقية لكلية الأحياء بجامعة بلغراد (رقم الموافقة EK-BF-2016/08). فيما يتعلق بمواد المريض (الأمصال ل IgGs) ، تم جمعها للفحص السريري الروتيني بموافقة المريض المستنيرة وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية (إعلان هلسنكي) للتجارب التي تشمل البشر. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للمركز السريري في صربيا (رقم 850/6).
1. إعداد زراعة الخلايا الأولية
- عزل أنسجة المخ
ملاحظة: يجب إجراء العزل على الجليد باستخدام محاليل الثلج الباردة.- استخدم الجراء حديثي الولادة بعمر 1-3 أيام لز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توصيف أنواع الخلايا الدبقية المختلفة في الثقافة
عادة ما يستغرق إنتاج الخلايا النجمية للتجارب من 15 إلى 21 يوما ، بينما تستغرق الخلايا الدبقية الصغيرة من 10 إلى 15 يوما لتنمو. تم إجراء التلوين المناعي لتقييم نقاء الخلايا في الثقافة. يوضح الشكل 1 التعبير عن وضع العلامات المزدوجة للعلامة النجمية GFAP والعلامة الدبقية الصغيرة Iba1 في الثقافات المعنية.
من المعروف أن تصوير الكالسيوم يكشف عن الاختلافات في فسيولوجيا الخلية للخلايا النجمية السليمة والمر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يقدم هذا البحث طريقة زراعة الخلايا الأولية كأداة سريعة و "على الميزانية" لدراسة الجوانب المختلفة لفسيولوجيا الخلية (المرضية) مثل ALS في نموذج الفئران hSOD1G93A . وبالتالي فإن هذه التقنية مناسبة للدراسات على مستوى الخلية الواحدة التي يمكن استقرائها والتحقيق فيها بشكل أكبر على مستوى أعلى من التنظيم (أي في شرائح الأنسجة أو في حي). ومع ذلك ، فإن زراعة الخلايا كتقنية لها بعض المحاذير. من الأهمية بمكان القيام بعزل أنسجة المخ وتفكك الخلايا على الجليد وإجراء هذه المراحل والمراحل اللاحقة من العزل والتحضير في أقصر وقت م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والعلوم والتنمية التكنولوجية في جمهورية صربيا رقم العقد رقم 451-03-9 / 2021-14 / 200178 ، ومشروع مجموعة التعليم والتدريب FENS - NENS "الدورة الثلاثية حول الخلايا الدبقية في الالتهاب العصبي" ، ومنحة EC H2020 MSCA RISE #778405. نشكر ماريا أدزيتش ومينا بيريتش على تزويدهما بصور الكيمياء الهيستولوجية المناعية ودانييلا باتافيليتش للمساعدة في الكتابة الورقية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب 15 مل | Sarstedt ، ألمانيا | 62 554 502 | |
| 2 مل أنبوب | Sarstedt ، ألمانيا | 72.691 | |
| 21 G إبرة | نيبرو ، اليابان | HN-2138-ET | |
| 23 G إبرة | نيبرو ، اليابان | HN-2338-ET | |
| 5 مل حقنة | نيبرو ، اليابان | SY3-5SC-EC | |
| 6 مم غطاء زجاجي دائري | Menzel Glasser ، ألمانيا | 630-2113 | |
| 60 ملم طبق بتري | ThermoFisher Sientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | 130181 | |
| ATP | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | A9062 | |
| AxioObserver A1 | Carl Zeiss ، ألمانيا | ||
| زلاليم مصل البقر | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | B6917 | |
| كلوريد الكالسيوم | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | 2110 | |
| جهاز طرد | مركزي Eppendorf ، ألمانيا | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | 10236276001 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | 158968 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | D5648 | |
| الحمار المضاد للماعز AlexaFluor 647 IgG الأجسام المضادة | Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | A-21447 | |
| الحمار المضاد للفأر AlexaFluor 488 IgG الأجسام المضادة | Infitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية | A-21202 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | EDS-100G | |
| EGTA | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | E4378 | |
| " تطور "-EM 512 نظام | الكاميرا الرقمية القياسات الضوئية ، مصل الأبقار الجنينية بالولايات المتحدة الأمريكية | ||
| (FBS) | Gibco ، ThermoFisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10500064 | |
| Fiji ImageJ Software | مفتوح المصدر بموجب | ||
| Licenses | FITC Chroma Technology Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| Fluo-4 AM | Molecular Probes ، الولايات المتحدة الأمريكية | F14201 | |
| الماعز المضاد ل Iba1 | Fujifilm Wako Chemicals ، الولايات المتحدة الأمريكية | 011-27991 | |
| HEPES | Biowest ، فرنسا | P5455 | |
| نظام تبادل الحلول عالي السرعة | ALA Scientific Instruments ، حاضنة الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| Memmert GmbH + Co. KG ، ألمانيا | |||
| كلوريد المغنيسيوم | سيجما ألدريتش ، ألمانيا | M2393 | |
| برنامج Matlab | Math Works ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| Mouse anti-GFAP | Merck Millipore ، الولايات المتحدة الأمريكية | MAB360 | |
| Mowiol 40-88 | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | 324590 | |
| مصل الحمار العادي | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | D9663 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | 158127 | |
| Penicilin و Streptomycin | ThermoFisher Sientific ، الولايات المتحدة الأمريكية | 15140122 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | P5899 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | P5405 | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم | كواشف Carlo Erba ، إسبانيا | 471686 | |
| Shaker DELFIA PlateShake | PerkinElmer Life Sciencies ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| بيكربونات الصوديوم | سيجما ألدريتش ، ألمانيا | S3817 | |
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش ، ألمانيا | S5886 | |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي الهيدرات | Carl ROTH GmbH | X987.2 | |
| بيروفات الصوديوم | سيجما ألدريتش ، ألمانيا | P5280 | |
| Thapsigargine | Tocris Bioscience ، المملكة المتحدة | 1138 | |
| Triton X - 100 | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | T8787 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich ، ألمانيا | T4799 | |
| Vapro مقياس ضغط بخار Vapro 5520 | Wescor ، ELITechGroup Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| نظام تصوير ViiFluor | Visitron System Gmbh ، ألمانيا | ||
| VisiChrome Polychromator System | Visitron System Gmbh ، ألمانيا | ||
| VisiView إعداد عالي الأداء | Visitron System Gmbh ، ألمانيا | ||
| مصباح زينون قصير القوس | أوشيو ، اليابان |
المراجع
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Gleichman, A. J., Carmichael, S. T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
