Method Article

عزل وتوصيف الخلايا المناعية من الضفائر المشيمية للفئران المجهرية

DOI:

10.3791/63487

⸱

February 3rd, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Brain-Immune Communication Lab, Institut Pasteur, 2Cytometry platform, CB UTechS, Institut Pasteur

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم هذه الدراسة قياس التدفق الخلوي واستراتيجيتين مختلفتين للبوابات على الضفائر الدماغية المعزولة المنتشرة في دماغ الفئران. يحدد هذا البروتوكول المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا المناعية التي تملأ بنية الدماغ هذه.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يعد الدماغ يعتبر عضوا يعمل بمعزل عن الآخرين. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن التغيرات في الجهاز المناعي المحيطي يمكن أن تشكل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر. في الواجهة بين الدماغ والدورة الدموية الجهازية ، تم تسليط الضوء على الضفائر المشيمية (CP) ، التي تشكل حاجز السائل الدموي الدماغي الشوكي ، كموقع رئيسي للتواصل المحيطي مع الدماغ. ينتج CP السائل الدماغي الشوكي ، وعوامل التغذية العصبية ، وجزيئات الإشارات التي يمكن أن تشكل توازن الدماغ. CP هي أيضا مكانة مناعية نشطة. على النقيض من حمة الدماغ ، التي تسكنها بشكل رئيسي الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل الظروف الفسيولوجية ، فإن عدم تجانس الخلايا المناعية CP يلخص التنوع الموجود في الأعضاء الطرفية الأخرى. يتغير تنوع الخلايا المناعية CP ونشاطها مع الشيخوخة والإجهاد والمرض ويعدل نشاط ظهارة CP ، وبالتالي يشكل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر. الهدف من هذا البروتوكول هو عزل CP الفئران وتحديد حوالي 90٪ من المجموعات الفرعية المناعية الرئيسية التي تملأها. هذه الطريقة هي أداة لتوصيف الخلايا المناعية CP وفهم وظيفتها في تنسيق التواصل من المحيط إلى الدماغ. قد يساعد البروتوكول المقترح في فك رموز كيفية قيام الخلايا المناعية CP بتعديل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر في الصحة وعبر مختلف الحالات المرضية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ اكتشاف الحاجز الدموي الدماغي من قبل بول إرليتش في أواخر القرن 19th ، تم اعتبار الدماغ منفصلا تقريبا عن الأعضاء الأخرى ومجرى الدم. ومع ذلك ، شهد هذا العقد الماضي ظهور مفهوم أن وظيفة الدماغ تتشكل من خلال عوامل بيولوجية مختلفة ، مثل ميكروبات الأمعاء والخلايا والإشارات المناعية الجهازية1،2،3،4. في موازاة ذلك ، تم تحديد حدود الدماغ الأخرى مثل السحايا والضفائر المشيمية (CP) كواجهات للحديث المناعي الدماغي النشط بدلا من الأنسجة الحاجزة الخاملة5،6،7،8.

يشكل CP حاجز السائل الدموي الدماغي الشوكي ، وهو أحد الحدود التي تفصل بين الدماغ والمحيط. وهي تقع في كل من البطينين الأربعة للدماغ ، أي البطينين الثالث والرابع وكلا البطينين الجانبيين ، وهي مجاورة للمناطق المشاركة في تكوين الخلايا العصبية مثل المنطقة تحت البطينية والمنطقة تحت الحبيبية من الحصين 3. من الناحية الهيكلية، يتكون CP من شبكة من الشعيرات الدموية المشتعلة محاطة بطبقة واحدة من الخلايا الظهارية، والتي ترتبط ببعضها البعض بواسطة تقاطعات ضيقة وتلتصق9,10. تتضمن الأدوار الفسيولوجية الرئيسية لظهارة CP إنتاج السائل الدماغي الشوكي ، الذي يطرد الدماغ من مستقلبات النفايات ومجاميع البروتين ، وإنتاج والتحكم في مرور الدم إلى الدماغ لجزيئات الإشارات المختلفة بما في ذلك الهرمونات وعوامل التغذية العصبية11،12،13. تشكل الجزيئات المفرزة من CP نشاط الدماغ ، أي عن طريق تعديل تكوين الخلايا العصبية ووظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة14،15،16،17،18،19 ، مما يجعل CP حاسما لتوازن الدماغ. يشارك CP أيضا في أنشطة مناعية مختلفة. في حين أن نوع الخلايا المناعية الرئيسي في حمة الدماغ في ظل ظروف غير مرضية هو الخلايا الدبقية الصغيرة، فإن تنوع مجموعات الخلايا المناعية CP واسع كما هو الحال في الأعضاء الطرفية3,7، مما يشير إلى أن قنوات مختلفة من التنظيم المناعي والإشارات تعمل في CP.

الفراغ بين الخلايا البطانية والظهارية، سدى CP، مأهول بشكل رئيسي بالبلاعم المرتبطة بالحدود (BAM)، والتي تعبر عن السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والجزيئات المتعلقة بعرض المستضد استجابة للإشارات الالتهابية3. وهناك نوع فرعي آخر من البلاعم، وهو خلايا إبلكس كولمر، الموجودة على السطح القمي لظهارة CP20. سدى CP هي أيضا مكانة للخلايا المتغصنة ، والخلايا البائية ، والخلايا البدينة ، والخلايا القاعدية ، والعدلات ، والخلايا اللمفاوية الفطرية ، والخلايا التائية التي هي في الغالب خلايا تائية مستجيبة للذاكرة قادرة على التعرف على مستضدات الجهاز العصبي المركزي 7،21،22،23،24. بالإضافة إلى ذلك، يتغير تكوين ونشاط مجموعات الخلايا المناعية في CP عند الاضطراب الجهازي أو الدماغي، على سبيل المثال، خلال الشيخوخة10،14،15،21،25، واضطراب الميكروبات7، والإجهاد26، والمرض27،28. ومن الجدير بالذكر أن هذه التغييرات قد اقترحت لتشكيل وظائف الدماغ بشكل غير مباشر ، أي أن تحول خلايا CP CD4 + T نحو التهاب Th2 يحدث في شيخوخة الدماغ ويحفز إشارات مناعية من CP قد تشكل التدهور المعرفي المرتبط بالشيخوخة14،15،21،25،29 . وبالتالي فإن إلقاء الضوء على خصائص الخلايا المناعية CP سيكون أمرا بالغ الأهمية لفهم وظيفتها التنظيمية بشكل أفضل في فسيولوجيا وإفراز ظهارة CP وبالتالي فك رموز تأثيرها غير المباشر على وظائف المخ في ظل الظروف الصحية والمرضية.

CP هي هياكل صغيرة تحتوي على عدد قليل من الخلايا المناعية. عزلها يتطلب تشريح مجهري بعد خطوة أولية من التروية. وإلا فإن الخلايا المناعية في مجرى الدم ستشكل ملوثات رئيسية. يهدف هذا البروتوكول إلى توصيف المجموعات الفرعية للخلايا النخاعية والخلايا التائية في CP باستخدام قياس التدفق الخلوي. تحدد هذه الطريقة حوالي 90٪ من مجموعات الخلايا المناعية التي تشكل CP الفئران في ظل ظروف غير التهابية ، وفقا للأعمال المنشورة مؤخرا باستخدام طرق أخرى لتشريح عدم تجانس CP المناعي 7،10،28. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لتوصيف التغيرات في حجرة الخلايا المناعية CP مع المرض والنماذج التجريبية الأخرى في الجسم الحي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات المتفق عليها مع المبادئ التوجيهية للمفوضية الأوروبية للتعامل مع المختبرات، التوجيه 86/609/EEC. تمت الموافقة عليها من قبل اللجان الأخلاقية رقم 59 ، من قبل CETEA / CEEA رقم 089 ، تحت رقم dap210067 و APAFIS # 32382-2021070917055505 v1.

1. إعداد المواد

  1. تخزين جميع الأجسام المضادة (جدول المواد) في 4 درجات مئوية ، محمية من التعرض للضوء.
  2. محلول مخزون DAPI (1 مجم / مل): أعد تعليق المسحوق في PBS-/- (جدول المواد) ، aliquot ، وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  3. حل عمل DAPI (0.1 مجم / مل): حل مخزون DAPI المخفف باستخدام PBS-/- بنسبة 1:10.
  4. المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS): قم بإعداد 2 ملليمتر من حمض رباعي أسيتيك ثنائي الفينيل الإيثيلين (EDTA) و 0.5٪ من ألبومين مصل البقر (BSA) (جدول المواد) في PBS-/-.
  5. محلول مخزون Collagenase IV (20 U / μL): أعد تعليق المسحوق في PBS +/+ (جدول المواد) ، و aliquot ، وخزنه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتطلب Collagenase IV أن يكون MgCl2 نشطا تماما. لا تقم بتجميد محلول كولاجيناز IV.
  6. محلول مسكن مخدر: مزيج 150 ميكرولتر من الكيتامين (150 مجم / كجم) ، و 25 ميكرولتر من الزيلازين (5 مجم / كجم) ، و 330 ميكرولتر من البوبريكير (0.1 مجم / كجم) في 1 مل من PBS-/-.
    ملاحظة: قم بإعداد محلول مسكن مخدر بشكل مؤقت ولا تحتفظ به لفترة أطول من يوم واحد.
  7. محلول الهيبارين (100 وحدة / مل): أعد تعليق المسحوق في PBS-/-.
  8. قم بإعداد نظام التسريب الداخلي الذي يربط أنبوبا بدورق Erlenmeyer مملوء ب PBS-/-. قم بتوصيل إبرة 23 G بطرف أنبوب التسريب. افتح الجزء الداخلي من التسريب واترك PBS يعمل حتى لا تكون هناك فقاعات في الأنبوب.
  9. تحضير العدسة مجهر مجهزة بضوء.

2. إسكان الفئران C57BL/6

  1. لتحليل الخلايا النخاعية أو التائية CP ، استخدم أربعة فئران لكل منها وقم بتجميع CP الأربعة (اثنان من كل بطين جانبي ، البطين الثالث والبطين الرابع CP ؛ لثمانية فئران في المجموع). إن عدم تجميع الإنتاج الأنظف ينطوي على خطر الفشل في اكتشاف المجموعات المناعية النادرة في الإنتاج الأنظف بسبب انخفاض وفرتها.
  2. دع الفئران تتأقلم لمدة 7 أيام على الأقل قبل أي تجربة. حافظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض في درجة حرارة ورطوبة ثابتة ، في دورة ضوء / مظلمة 12/12 ساعة أو 14/10 ساعة ، مع الماء وطعام الكريات القياسي ad.

3. تروية PBS وتشريح الدماغ

  1. قم بوزن كل ماوس وحقن 10 ميكرولتر / غرام من محلول المزيج المخدر المسكن (الخطوة 1.6) داخل الصفاق.
  2. انتظر حوالي 30 دقيقة للحصول على مسكن فعال (تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص أرقام الماوس).
  3. ضع الماوس المخدر مسطحا على ظهره ، على دعامة التشريح ، وقم بربط راحة يده بدعم التشريح.
  4. معسر جلد الحيوان مع ملقط واستخدام مقص ، وفتح البطن ، والحجاب الحاجز ، والصدر لفضح القلب.
    ملاحظة: عندما يتم فتح الصدر ، يصبح الدماغ غير مؤكسد. يجب على المرء أن يمضي بدقة وسرعة من خلال الخطوات التالية من التروية.
  5. حقن 20 ميكرولتر من محلول الهيبارين 100 U/mL مباشرة في البطين الأيسر.
  6. باستخدام المقص الدقيق ، قم بعمل شق لا يقل عن 3 مم في الأذين الأيمن للسماح للدم بالتدفق خارج الجسم.
  7. بعد ذلك مباشرة ، أدخل إبرة 23 G الموضوعة في طرف أنبوب التسريب من خلال طرف البطين الأيسر.
  8. افتح نظام التسريب بحد أقصى وانتظر التروية الكاملة: باستخدام إبرة 23 جم ، بمعدل تدفق يبلغ حوالي 6 مل / دقيقة ، يكتمل التروية في 3 دقائق.
    ملاحظة: إن تغير لون الأعضاء مثل الكبد يشهد على فعالية التروية.
  9. أغلق نظام التسريب وأزل الإبرة من بطين القلب.
  10. قم بإزالة الشريط من راحة الماوس. ضع الماوس في وضع بطني.
  11. معسر جلد الحيوان مع ملقط واستخدام مقص ، وإزالة الجلد من الجزء العلوي من الرأس من العينين إلى الأذنين.
  12. بمساعدة المقص ، قم بقطع الجمجمة أولا بين العينين ثم أفقيا من كل عين إلى الحبل الشوكي فوق عضلات الماستر مباشرة. لهذا ، استخدم طرف المقص وتابع بلطف لتجنب إتلاف الدماغ بالمقص.
  13. افتح الجمجمة بالملقط عن طريق قرصها من الطرف بين العينين.
  14. استخدم المقص لقطع الحبل الشوكي واستخراج الدماغ بالملقط ، ووضع نقطتيهما على الجانب الجانبي من الدماغ لإمالته ووضعه في طبق بتري مملوء ب PBS +/+ البارد المثلج. ثم يتم جمع الإنتاج الأنظف على الفور.
    ملاحظة: تحقق من تغير لون الدماغ للتحقق من فعالية التروية.

4. تشريح الضفيرة المشيمية من الدماغ

  1. ضع الجانب الظهري للدماغ لأعلى في طبق بتري وتحت أهداف العدسة ثنائية العين.
  2. بمساعدة الملقط للحفاظ على الدماغ في مكانه ، أدخل طرفي ملقط آخر لأسفل من خلال خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية.
  3. استخدم الملقط لسحب القشرة مع الثفني والحصين بعيدا عن الحاجز ، مما يعرض البطين الجانبي وجزء من البطين الثالث.
  4. حدد CP الجانبي كحجاب طويل يبطن البطين الجانبي الذي يشتعل في كلا الطرفين. استخدم طرفي ملقط رقيق للقبض على CP الجانبي. كن حذرا لجمع الجزء الخلفي المثلث الذي قد يكون مخفيا بواسطة الطية الخلفية للحصين.
  5. اسحب القشرة مع الجسم الثفني والحصين في نصف الكرة المقابل بعيدا عن الحاجز لفضح البطين الثالث بأكمله والبطين الجانبي المقابل.
  6. جمع مع ملقط دقيق CP الثالث ، والتي يمكن تحديدها على أنها بنية قصيرة مع جانب سطح حبيبي.
  7. جمع CP الجانبي الآخر.
  8. أدخل طرفي الملقط لأسفل بين المخيخ والدماغ الأوسط. افصل المخيخ عن البونس والنخاع لفضح البطين الرابع.
  9. حدد CP الرابع كبنية كروية طويلة ذات جانب سطحي حبيبي يبطن البطين الرابع من الطرف الأيمن الجانبي إلى الطرف الأيسر بين المخيخ والنخاع. جمع CP الرابع مع ملقط ناعم.
    ملاحظة: قد يمنع طلاء الملقط ذو القاعدة السيلانية التصاق CP على الملقط.
  10. كرر الخطوات من 3.1 إلى 4.9 لكل من الفئران السبعة الأخرى. في غضون ذلك ، يمكن الاحتفاظ بالإنتاج الأنظف الذي تم جمعه مؤقتا في أنبوب يوضع على الجليد.

5. إعداد عينات لتحليل التدفق الخلوي

  1. املأ الأنبوب الذي يحتوي على جميع CP التشريح إلى 750 ميكرولتر من PBS +/+.
    ملاحظة: ترسب CP التشريح مع ملقط رقيق في الأنبوب يجلب حجما صغيرا من PBS +/+. بدلا من ذلك ، أكمل الحجم الحالي إلى 750 ميكرولتر بدلا من إزالته واستبداله ب 750 ميكرولتر جديد من PBS +/+ لتجنب فقدان محتمل لأنسجة CP.
  2. أضف 15 ميكرولتر من محلول مخزون Collagenase IV 20 U/μL (انظر الخطوة 1.5) للحصول على تركيز نهائي 400 U/mL.
    ملاحظة: الحمض النووي I (150 ميكروغرام/مل) قد يمنع تكتل الخلايا المفرط.
  3. احتضان CP مع Collagenase IV عند 37 درجة مئوية تحت إثارة خفيفة (300 دورة في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة.
  4. قم بسحب الماصة بلطف لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات لإنهاء تفكك الإنتاج الأنظف.
  5. املأ أنبوب CP إلى 1.5 مل بمخزن MACS المؤقت (انظر خطوة الوصفة 1.4) لوقف نشاط الكولاجيناز IV.
    ملاحظة: يتم إيقاف نشاط الكولاجيناز IV عند درجة حرارة منخفضة ويتم تثبيطه بواسطة ألبومين المصل.
  6. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × g ، لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت واغسل الخلايا ب 1.5 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS.
  7. الطرد المركزي للخلايا في 500 × غرام لمدة 5 دقائق، في 4 درجة مئوية. تخلص من الخلايا الفائقة وأعد تعليقها في 220 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS.
  8. افصل أليكوت من 10 ميكرولتر عن تعليق الخلية لاستخدامه كتحكم غير ملطخ (الخطوة التالية 5.18).
  9. افصل أليكوت من 10 ميكرولتر عن تعليق الخلية لاستخدامه كعنصر تحكم أحادي اللون DAPI (الخطوة التالية 5.12).
  10. احتضن ما تبقى من 200 ميكرولتر باستخدام الأجسام المضادة المضادة المضادة للماوس CD16 / CD32 (1:100) لمدة 20 دقيقة ، عند 4 درجات مئوية ، لمنع التفاعلات غير المحددة بوساطة Fc.
  11. قسم الخلايا إلى أنبوبين 100 ميكرولتر (أحدهما لتحليل الخلايا النخاعية ، والآخر لتحليل الخلايا التائية) (الخطوة التالية 5.14).
  12. خذ العينة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من الخلايا للتحكم الأحادي اللون DAPI (الخطوة 5.9) واملأها حتى 100 ميكرولتر باستخدام مخزن MACS المؤقت (الخطوة التالية 5.14).
  13. قم بإعداد أحد عشر أنبوبا جديدا يحتوي على 100 ميكرولتر من MACS للأجسام المضادة أحادية اللون (الخطوة 5.14.4) وعناصر التحكم الملطخة بالكامل (الخطوة 5.14.5) وأضف قطرة من حبات التعويض إلى كل منها.
    ملاحظة: ستسمح ضوابط التعويض بإعداد جهد ليزر الكشف عن الفلورسنت وتقييم الكشف المحتمل عن الإشارة غير المحددة لصبغة الفلورسنت في القنوات الأخرى التي سيتم تعويضها بشكل أكبر.
  14. حضانة الأجسام المضادة للعينات:
    1. عينة النخاع الشوكي: إضافة 0.1 ملغ / مل DAPI (1:100) (انظر الخطوة 1.3) ، FITC مكافحة الماوس CD45 (1:100) ، PE-Dazzle 594 المضادة للماوس CD11b (1:100) ، APC المضادة للماوس CX3CR1 (1:100) ، BV711 المضادة للماوس Ly6C (1:100) ، PE المضادة للماوس F4/80 (1:100) ، و APC-Cy7 المضادة للماوس IA-IE (1:100).
    2. عينة الخلايا التائية: إضافة 0.1 ملغم / مل DAPI (1:100) ، FITC المضادة للماوس CD45 (1:100) ، PE-Dazzle 594 المضادة للماوس CD11b (1:100) ، APC المضادة للماوس TCRβ (1:100) ، PE المضادة للماوس CD8a (1:100) ، و APC-Cy7 المضادة للماوس CD4 (1:50).
    3. التحكم أحادي اللون DAPI (من الخطوة 5.12): أضف 0.1 مجم / مل DAPI (1:100).
    4. خرز التعويض أحادي اللون للأجسام المضادة: أضف كل من الأجسام المضادة التسعة المستخدمة سابقا لعينات الخلايا النخاعية والخلايا التائية (نفس التخفيف) ، بشكل منفصل (واحد لكل أنبوب) إلى الأنابيب التسعة التي تحتوي على الخرز.
      ملاحظة: ستسمح ضوابط التعويض أحادية اللون بتحديد القمم الإيجابية للتألق لكل علامة من علامات الفلورسنت المستخدمة أثناء خطوة التعويض. سيقوم المحلل بمقارنتها بالإشارة السلبية التي لوحظت في خلايا CP غير الملطخة بالتحكم.
    5. خرز تعويض الأجسام المضادة الملطخة بالكامل: أضف جميع الأجسام المضادة المستخدمة في تلطيخ النخاع إلى أنبوب واحد وتلك المستخدمة لتلطيخ الخلايا التائية إلى أنبوب آخر.
      ملاحظة: ستسمح عناصر التحكم في التعويض الملطخة بالكامل بإعداد الجهد الكهربي لكل اكتشاف ليزر فلورسنت وتقييم إمكانية الكشف عن الإشارة غير المحددة لصبغة الفلورسنت في القنوات الأخرى.
    6. احتضان لمدة 30-45 دقيقة على الجليد ، محمية من التعرض للضوء.
  15. املأ جميع الأنابيب حتى 1.5 مل باستخدام المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS. الطرد المركزي للخلايا وخرز التعويض عند 500 × جم ، لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
  16. تخلص من supernatant واغسل الخلايا وخرز التعويض في 1.5 مل من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS.
  17. الطرد المركزي للخلايا وخرز التعويض عند 500 × جم ، لمدة 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  18. أعد تعليق الخلايا وخرز التعويض في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS. املأ التحكم غير الملطخ (الخطوة 5.8) حتى 500 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت لنظام التشغيل MACS.
  19. قم بتصفية كل أنبوب بخلايا CP من خلال مصفاة 70 ميكرومتر (CP غير ملطخ ، وتحكم أحادي اللون DAPI ، وعينات من الخلايا النخاعية والتائية).

6. قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: تم تجهيز مقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذا البروتوكول ب 5 ليزر التالي: ليزر الأشعة فوق البنفسجية 355 نانومتر ، ليزر بنفسجي 405 نانومتر ، ليزر أزرق 488 نانومتر ، ليزر أصفر أخضر 561 نانومتر وليزر أحمر 637 نانومتر.

  1. قم بإجراء فحوصات مراقبة الجودة اليومية على مقياس الخلايا باستخدام إعداد مقياس الخلايا ، وواجهة التتبع (CST) ، وحبات التحكم في CST لضمان الاتساق بين التحليلات وجودة الأداة وكثافة التألق المستهدفة المتسقة.
  2. لإعداد تجربة قياس التدفق الخلوي، قم بإنشاء تجربة جديدة باستخدام مخططات ثنائية المتغيرات ورسوم بيانية. تأكد من تضمين قطع أراضي منطقة تشتت أمامية (FSC-A) ومنطقة تشتت جانبية (SSC-A) بالإضافة إلى مخططات الرسم البياني لكل لون لمراقبة عملية الاستحواذ.
  3. حدد مورفولوجيا الخلية عن طريق إعداد جهد PMT لمعلمات FSC-A و SSC-A على خلايا CP للتحكم غير الملطخة.
  4. تحديد الفولتية لكل علامة فلورسنت من خلال إعداد القمم السلبية للفلوروكروم على خلايا CP غير الملطخة بالتحكم والقمم الإيجابية للفلوروكروم باستخدام حبات التعويض الملطخة بجميع الأجسام المضادة وضمان عدم خروج إشارات الكاشف عن النطاق وعدم اكتشافها بقوة في القنوات الأخرى.
  5. قم بإنشاء مصفوفة تعويض لتحليل كل عنصر من عناصر التحكم في التعويض أحادية اللون. بعد تحديد مجموعات FSC-A/SSC-A المناسبة، تحقق من عناصر التحكم أحادية اللون على قطع الرسم البياني وسجل ضوابط التعويض. بعد تسجيل جميع العينات أحادية اللون ، احسب مصفوفة التعويض.
  6. سجل جميع الأحداث المكتشفة لكل من مجموعات الخلايا النخاعية والتائية.

7. CP الخلايا النخاعية بوابة

  1. حدد FSC-A مقابل SSC-A وبوابة للخلايا (استنادا إلى الحجم).
  2. قم بإنشاء بوابة فرعية للخلايا المفردة ذات ارتفاع التشتت الأمامي FSC-A مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H).
  3. إنشاء بوابة فرعية للخلايا الحية باستخدام DAPI مقابل FSC-A لاستبعاد خلايا DAPI+ .
  4. قم بإنشاء بوابة ابنة للخلايا المناعية CD45 + مع CD45 مقابل FSC-A.
  5. قم بإنشاء بوابة فرعية من خلايا CD45+ وحدد CD11b مقابل F4/80 ، وحدد المجموعتين التاليتين: CD11b + F4/80+ و CD11b + F4/80- المجموعات السكانية (الخطوة التالية 7.8).
  6. قم بإنشاء بوابة فرعية لخلايا CD11b + F4/80+ وحدد CX3CR1 مقابل IA-IE. حدد كلا من CX3CR1+ IA-IE+ BAM التي يتم تسميتها بشكل أكبر باسم CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM، والبلاعم CX3CR1+ IA-IE.
  7. قم بإنشاء بوابة فرعية ل CD11b + F4 / 80 + CX3CR1 + IA-IE- البلاعم وحدد F4/80 مقابل CD11b. حدد كلا من CD11bhigh F4/80intermediate و CD11b + F4 / 80high المجموعات السكانية التي تسمى أيضا CD11bhigh F4 / 80intermediate CX3CR1 + IA-IE- Kolmer's epiplexus macrophages و CD11b + F4 / 80high CX3 CR1+ IA-IE- BAM ، على التوالي.
    ملاحظة: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- و CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- ظهرت الخلايا مختلطة قليلا بين مستويات F4/80intermediate-F4/80high وCD11bhigh-CD11b+
  8. من CD11b + F4 / 80 - السكان (الخطوة 7.5) ، بوابة ل Ly6C مقابل IA-IE. حدد كلا من IA-IE+ Ly6C- السكان و IA-IE- Ly6C + الخلايا التي تتوافق بشكل أساسي مع الخلايا الأحادية / العدلات.
    ملاحظة: من المحتمل أن يعكس الوجود العالي لخلايا IA-IE- Ly6C + مشاكل في فعالية التروية للحيوانات دون حالة التهابية. يجب أن تكون وفرتها منخفضة.
  9. قم بإنشاء بوابة فرعية ل CD11b + F4/80- IA-IE+ Ly6C- السكان وحدد CD11b مقابل CX3CR1 ، وحدد كلا من مجموعات CD11bhigh CX3CR1low و CD11b + CX3CR1.

8. بوابات الخلايا التائية CP

  1. حدد FSC-A مقابل SSC-A وبوابة للخلايا (استنادا إلى الحجم).
  2. قم بإنشاء بوابة فرعية للخلايا المفردة ذات ارتفاع التشتت الأمامي FSC-A مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H).
  3. إنشاء بوابة فرعية للخلايا الحية باستخدام DAPI مقابل FSC-A لاستبعاد خلايا DAPI+ .
  4. قم بإنشاء بوابة ابنة للخلايا المناعية CD45 + مع CD45 مقابل FSC-A.
  5. قم بإنشاء بوابة فرعية من خلايا CD45+ وحدد TCRβ مقابل CD11b. استبعد الخلايا النخاعية CD11b + وحدد TCRβ + CD11b- T Cells population.
  6. قم بإنشاء بوابة فرعية لسكان TCRβ+ CD11b وحدد CD4 مقابل CD8a. حدد كل من خلايا CD8- CD4+ T وخلايا CD8+ CD4- T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشفت تحليلات قياس التدفق الخلوي المعروضة هنا بنجاح عن المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا النخاعية والخلايا التائية (الشكل 1 والشكل 2 ، على التوالي) ، والعدد الإجمالي النسبي لكل فأر بطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير (الشكل 3).

أظهر تحليل التدفق الخلوي للخلايا النخاعية أن CP مملوءة ب CD11b + CX3CR1 + F4 / 80high BAM ، وهو ما يمثل ما يقرب من 80٪ من الخلايا المناعية CD45 +

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ركزت الدراسات التي تهدف إلى فهم المساهمات المناعية في توازن الدماغ والمرض بشكل أساسي على الخلايا الموجودة داخل حمة الدماغ ، وإهمال حدود الدماغ مثل CP ، والتي تعد مع ذلك مساهمين حاسمين في وظائف الدماغ2,3. يعد تحليل مجموعات الخلايا المناعية في CP أمرا صعبا بسبب صغر حجم CP ، وانخفاض أعداد الخلايا المناعية المقيمة ، والوصول المعقد إلى هذا الأنسجة. لا يسمح قياس التدفق الخلوي الذي يتم إجراؤه على إجمالي خلايا الدماغ المناعية (CD45+) بتوصيف المجموعات المناعية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر معهد باستور أنيميري المركزي وأعضاء مرفق CB-UTechS على مساعدتهم. وقد حظي هذا العمل بدعم مالي من معهد باستور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مضاد للفأر CD16 / CD32BD Biosciences553142التدفق الخلوي الأجسام المضادة
الألبومين ،MP Biomedicals160069كاشف الحجب
APC المضاد للفأر CX3CR1BioLegend149008التدفق الخلوي الأجسام المضادة
APC المضادة للفأر TCRbBioLegend109212التدفق الخلوي الجسم المضاد
APC-Cy7 المضاد للفأر CD4BioLegend100414التدفق الخلوي الجسم المضاد
APC-Cy7 المضاد للفأر IA-IEBioLegend107628التدفق الخلوي الجسم المضاد
BD FACمحلل الخلايا Ymphony A5التدفقBiosciences
BV711 المضاد للفأر Ly6CBioLegend128037التدفق الخلوي الجسم المضاد
كولاجيناز IVGibco17104-019إنزيم إلى فصل أنسجة CP
DAPIThermo Scientific62248علامة حية / ميتة
EDTAأيون مخلب
مقص ناعمFST14058-11أداة تشريح
FITC مضادة للفأر CD45BioLegend103108قياس التدفق الخلوي الأجسام المضادة
تسريب وحدة التحكم في التدفقCareFusionRG-3-Cنضح الدم برنامج داخلي
FlowJoBD BiosciencesAnalysis Software
ملقطFST11018-12أداة تشريح
HeparinSigma-AldrichH3149-10KUمضاد للتخثر
ImalgeneBoehringer IngelheimKetamine ، مخدر
OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-42حبات التحكم لتحقيق تعويض
PBS - / -Gibco14190-094Buffer
PBS +/+Gibco14040-091Buffer
PE مضاد للفأر CD8aBioLegend100708قياس التدفق الخلوي الجسم المضاد
PE المضاد للفأر F4 / 80BioLegend123110التدفق الخلوي الجسم المضاد
PE-Dazzle 594 المضاد للفأر CD11bBioLegend101256قياس التدفق الخلوي الأجسام المضادة
Rompunبايرزيلازين ،
ملقط رقيقDumoxel Biology11242-40أداة تشريح
مسكنات بيطريةسيفابوبرينورفين ، مسكن
البقر محلل قياس الخلوي BD مخدر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  2. Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
  3. Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
  4. Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
  5. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  6. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  7. van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  8. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
  9. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
  10. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  11. Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
  12. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  13. Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
  14. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
  15. Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  16. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  17. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  18. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
  19. da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  20. Schwarze, E. -W. The origin of (Kolmer's) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
  21. Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
  22. Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
  23. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
  24. Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
  25. Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
  26. Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111(2019).
  27. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  28. Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
  29. Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
  30. Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967(2015).
  31. Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
  32. Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
  33. Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
  34. Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
  35. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  36. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Choroid PlexusImmune Cell IsolationFlow CytometryMouse BrainImmune Cell CharacterizationBlood Cerebrospinal Fluid BarrierMyeloid CellsT Cell GatingBorder Associated MacrophagesSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles