يعرض البروتوكول الإجراءات الشاملة داخل المختبر المطلوبة في الاختبارات الجينية قبل الزرع لاختلال الصيغة الصبغية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات. نقدم هنا الخطوات التفصيلية لتضخيم الجينوم الكامل ، واختيار جزء الحمض النووي ، وبناء المكتبة ، وإعداد القالب ، وتسلسل تدفق العمل مع نتائج تمثيلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الاختبار الجيني قبل الزرع لمرض الصبغيات العدلية على منصة تسلسل الجيل التالي القائمة على أشباه الموصلات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اكتسب تسلسل الجيل التالي أهمية متزايدة في التطبيق السريري في تحديد المتغيرات الوراثية. في الاختبار الجيني قبل الزرع ، تتمتع هذه التقنية بمزاياها الفريدة في قابلية التوسع والإنتاجية والتكلفة. بالنسبة للاختبار الجيني قبل الزرع لتحليل اختلال الصيغة الصبغية ، يوفر نظام تسلسل الجيل التالي (NGS) القائم على أشباه الموصلات المعروض هنا نهجا شاملا لتحديد المتغيرات الجينية الهيكلية بدقة لا تقل عن 8 ميجا بايت. من الحصول على العينات إلى التقرير النهائي ، تتطلب عملية العمل خطوات متعددة مع الالتزام الوثيق بالبروتوكولات. وبما أن الخطوات الحرجة المختلفة يمكن أن تحدد نتيجة التضخيم، وجودة المكتبة، وتغطية القراءات، ومخرجات البيانات، فإن المعلومات الوصفية مع العرض المرئي بخلاف الكلمات يمكن أن تقدم المزيد من التفاصيل للتشغيل والتلاعب، مما قد يكون له تأثير كبير على نتائج جميع الخطوات الحرجة. ستعرض الطرق المعروضة هنا الإجراءات التي ينطوي عليها تضخيم الجينوم الكامل (WGA) لخلايا Trophectoderm الخزعة (TE) ، وبناء المكتبة الجينومية ، وإدارة التسلسل ، وأخيرا ، إنشاء تقارير متغيرات عدد النسخ.
المقدمة
Aneuploidy هو خلل في عدد الكروموسومات من خلال وجود واحد أو أكثر من الكروموسومات الإضافية أو عدم وجود واحد أو أكثر من الكروموسومات. يمكن للأجنة التي تحمل نوعا من اختلال الصيغة الصبغية ، مثل فقدان كروموسوم X واحد (متلازمة تيرنر) ، أو نسخ إضافية من الأوسومات الذاتية ، مثل التثلث الصبغي من autosome 21 (متلازمة داون) ، و 13 (متلازمة باتاو) ، و 18 (متلازمة إدواردز) ، أو الكروموسومات الجنسية الإضافية مثل 47 ، XXY (متلازمة كلاينفلتر) و 47 ، XXX (متلازمة X الثلاثية) ، البقاء على قيد الحياة حتى نهاية العيوب الخلقية1. Aneuploidy هو السبب الرئيسي للإجهاض في الأشهر الثلاثة الأولى وفشل الإخصاب في المختبر (IVF)2. وتفيد التقاري....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت مراجعة جميع البروتوكولات وخزعة الأديم التغصني (قسم 1.1.1.1) المطبقة في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في المستشفى رقم 924 في 18 سبتمبر 2017 (رقم: PLA924-2017-59). قدم المرضى / المشاركون موافقتهم الخطية المستنيرة للمشاركة في هذه الدراسة.
1. عزل الحمض النووي عن خزعة الجنين البشري والتضخيم الجينومي الكامل
- بروتوكول لتضخيم الجينوم الكامل 9,10
ملاحظة: تستخدم مجموعة بيكو بلكس WGA لأداء تضخيم الجينوم بالكامل.- جمع العينات وتخزينها
- خزعة الأديم الغذائي: اسحب على ما معدله ست إلى تسع خلايا من TE المنفتق من جنين D5/6....
- جمع العينات وتخزينها
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مع انتهاء خطة التسلسلات بعد عملية التشغيل في الجهاز، يقوم نظام خادم التسلسل بالإبلاغ عن الملخص مع المعلومات الوصفية للبيانات التي تم إنشاؤها، وحالة الشريحة، ومعدل تحميل مزود خدمة الإنترنت، وجودة المكتبة، كما هو موضح في الشكل 2. في هذا العرض التوضيحي للنتائج ، تم الحصول على بيانات 17.6 G في القاعدة الإجمالية ، وكان معدل التحميل الإجمالي لمزود خدمة الإنترنت 88٪ في إجمالي آبار الرقاقة ؛ أظهرت الخريطة الحرارية أن العينة تم تحميلها بالتساوي على المساحة الإجمالية للشريحة (الشك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
اختلال الصيغة الصبغية للكروموسومات للأجنة هو سبب نسبة كبيرة من فقدان الحمل ، سواء تم تصوره بشكل طبيعي أو في المختبر الإخصاب (IVF). في الممارسة السريرية للتلقيح الاصطناعي ، يقترح أن فحص اختلال الصيغة الصبغية للجنين ونقل جنين euploidy يمكن أن يحسن نتائج التلقيح الاصطناعي. التهجين الفلوري في الموقع هو أول تقنية معتمدة لاختيار الجنس و PGT-A. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية المزيد من الخبرة التقنية من موظفي المختبر وهي كثيفة العمالة نسبيا. الدراسات المتزايدة ل PGT-A باستخدام التهجين الفلوري في الموقع لا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الدكتور تشانغيونغ مينغ والسيد رونغجي هو على مشورتهما بشأن تطبيق LIMS الموسع. يتم دعم هذه الدراسة من قبل مشاريع البحوث الخاصة PLA لتنظيم الأسرة (17JS008 ، 20JSZ08) ، وصندوق مختبر قوانغشي الرئيسي لأبحاث أمراض التمثيل الغذائي (رقم 20-065-76) ، ومشروع أبحاث العلوم والتكنولوجيا الصحية المواطن في قوانغتشو (201803010034).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.45 مو ؛ m وحدة تصفية حقنة | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 مل DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| أنابيب 15 مل | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind | Tubes Eppendorf | 30108078 | |
| 50 مل | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2 + < / sup> Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP كاشف (حبات مغناطيسية لربط الحمض النووي) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis Buffer | الجنوب الطبية | يحتوي على 40 ملي مولار Tris (درجة الحموضة 8) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي مولار EDTA ، 1 ملي مولار حمض الإيثيلين جلايكول الرباعي الأسيتيك (EGTA) ، 1٪ (حجم / حجم) تريتون X-100 ، 5 ملي صوديوم بيروفوسفات ، 2 ملي مولار وبيتا ؛ جليسيروفوسفات ، 0.1٪ SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| عازلة شطف الحمض النووي | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 | Magnet Life Technologies | 12321D | |
| الكحول الإيثيلي | مصنع الكواشف الكيميائي قوانغتشو ثيرمو فيشر علمي | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| كواشف تضخيم الجينوم الكامل المطورة بشكل مستقل | الطبية الجنوبية | تتكون الكواشف من المكونات التالية: 1. تحلل الخلية 2. تضخيم محلول مخلوط مسبقا 1) التمهيدي WGA-P2 (10 & mu; M) 2) dNTP (10 مل) ؛ 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg 2 + < / sup> Plus) 3. إنزيم التضخيم 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/&mu ؛ L) | |
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit المذكورة في الخطوة 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit ؛ | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life | Technologies 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| الأيزوبروبانول | قوانغتشو للكاشف | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| طقم تحضير المكتبة | Daan Gene Co.، Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | سيجما-ألدريتش | S5881-1KG | |
| الحياة المائية الخالية من النوكلياز | AM9932 | ||
| أوليغو WGA-P2 | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3'OneTouch | |
| 2 تقنيات حياة النظام | 4474779 | نظام تضخيم وتخصيب القالب | |
| أنابيب PCR | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| أطراف الماصة | منتجات | الجودة https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx أجهزة | |
| الطرد المركزي الصغيرة المحمولة LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 تقنيات الحياة الفلورية | Q33216 | مقياس الفلور | |
| أنابيب فحص كيوبيت تقنيات | الحياة | Q32856 | |
| كيوبيت dsDNA HS فحص كيت | تقنيات الحياة | Q32851 | |
| نظام خادم التسلسل | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite البرمجيات | |
| تسلسل تفاعلات Universal Kit | Daan Gene Co.، Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html< / > تحتوي هذه المجموعة على المكونات التالية: 1. مجموعة أدوات تحضير القالب 1.1 طقم تحضير القالب: مستحلب PCR buffer مزيج إنزيم PCR مستحلب محلول حامل القالب 1.2 حلول تحضير القالب: زيت تفاعل تحضير القالب I محلول كسر المستحلب II تحضير القالب زيت تفاعل II ماء خال من النوكلياز Tween الحل محلول إزالة الاستحلاب I محلول غسيل القالب محلول غسيل الخرزة C1 حل إعادة تعليق حبة C1 محلول إعادة تعليق القالب 1.3 مواد تحضير القالب: أنبوب الكاشف I موصل أنبوب التجميع ماصة أنبوب الكاشف I لوحة تضخيم 8 آبار strip نصائح مخصصة محول غسيل تحضير القالب مرشح تحضير القالب 2. مجموعة مجموعة أدوات التسلسل 2.1 مجموعة التسلسل: dGTP dCTP dATP dTTP حل إنزيم التسلسل بادئات التسلسل قوالب مراقبة الجودة 2.2 & nbsp ؛ حلول التسلسل: حل التسلسل II حل التسلسل IIII عازلة التلدين عازلة التحميل عامل الرغوة أقراص الكلور C1 حبة 2.3 مواد التسلسل: أنبوب الكاشف II غطاء أنبوب الكاشف أنبوب الكاشف ؛ II زجاجة الكاشف شرب زجاجات الكاشف 3. |
| رقاقة محلول هيدروكسيد الصوديوم | Sigma | 72068-100ML | |
| تقنيات حياة الدراجة الحرارية | 4375786 |
المراجع
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
