يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إزالة العين في يرقات الزرد الحية لفحص النمو والتطور المعتمد على التعصيب للنظام البصري

4.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63509

⸱

فبراير 11, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

في هذه المقالة

ملخص

يشرح المقال كيفية إزالة العينين جراحيا من يرقات الزرد الحية كخطوة أولى نحو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو التكتوم البصري وتطوره. بالإضافة إلى ذلك ، توفر المقالة معلومات حول تخدير اليرقات وتثبيتها وتشريح الدماغ ، تليها الكيمياء النسيجية المناعية والتصوير البؤري.

الملخص

تظهر أسماك الزرد نموا ملحوظا مدى الحياة وقدرات تجديدية. على سبيل المثال، تدعم منافذ الخلايا الجذعية المتخصصة التي تم إنشاؤها أثناء التكوين الجنيني النمو المستمر للنظام البصري بأكمله، سواء في العين أو الدماغ. يضمن النمو المنسق بين الشبكية والتكتوم البصري رسم خرائط دقيقة للشبكية مع إضافة خلايا عصبية جديدة في العينين والدماغ. لمعالجة ما إذا كانت محاور الشبكية توفر معلومات حاسمة لتنظيم سلوكيات الخلايا الجذعية التكتالية والسلف مثل البقاء على قيد الحياة والانتشار و / أو التمايز ، من الضروري أن تكون قادرا على مقارنة الفصوص التكتالية المعصبة والمتوترة داخل نفس الحيوان وعبر الحيوانات.

الاستئصال الجراحي لعين واحدة من الزرد اليرقي الحي تليها مراقبة التكتوم البصري يحقق هذا الهدف. يوضح الفيديو المصاحب كيفية تخدير اليرقات ، وشحذ إبر التنغستن كهربائيا ، واستخدامها لإزالة عين واحدة. ويوضح بعد ذلك كيفية تشريح الأدمغة من يرقات الزرد الثابتة. وأخيرا، يقدم الفيديو لمحة عامة عن بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية وعرضا توضيحيا لكيفية تركيب الأجنة الملطخة في الأغاروز منخفض درجة الانصهار للفحص المجهري.

المقدمة

الهدف من هذه الطريقة هو التحقيق في كيفية تأثير مدخلات الشبكية على نمو وتطور التكتوم البصري ، وهو مركز المعالجة البصرية في دماغ الزرد. من خلال إزالة عين واحدة ثم مقارنة جانبي التكتوم البصري ، يمكن ملاحظة التغيرات التكتالية داخل نفس العينة وتطبيعها ، مما يتيح المقارنة عبر عينات متعددة. سوف تسفر الأساليب الجزيئية الحديثة جنبا إلى جنب مع هذه التقنية عن رؤى ثاقبة حول الآليات الكامنة وراء نمو النظام البصري وتطوره ، بالإضافة إلى الانحطاط والتجديد المحوري.

تجمع الأنظمة الحسية - البصرية والسمعية والحسية الجسدية - المعلومات من الأعضاء الخارجية وتنقل تلك المعلومات إلى الجهاز العصبي المركزي ، وتولد "خرائط" للعالم الخارجي عبر الدماغ المتوسط 1,2. الرؤية هي الطريقة الحسية السائدة لجميع الفقاريات تقريبا ، بما في ذلك العديد من الأسماك. تجمع شبكية العين، وهي النسيج العصبي في العين، المعلومات مع دائرة عصبية تتكون في المقام الأول من المستقبلات الضوئية، والخلايا ثنائية القطب، وخلايا العقدة الشبكية (RGCs)، وهي الخلايا العصبية الإسقاط في شبكية العين. تحتوي RGCs على محاور طويلة تجد طريقها عبر السطح الداخلي للشبكية إلى رأس العصب البصري ، حيث تبهر وتنتقل معا عبر الدماغ ، وتنتهي في النهاية في مركز المعالجة البصرية في الدماغ المتوسط الظهري. ويسمى هذا الهيكل التكتوم البصري في الأسماك وغيرها من الفقاريات غير الثدييات وهو متجانس مع كوليكولوس متفوقة في الثدييات3.

التكتوم البصري هو بنية متعددة الطبقات متماثلة ثنائيا في الدماغ المتوسط الظهري. في أسماك الزرد ومعظم الأسماك الأخرى ، يتلقى كل فص من التكتوم البصري مدخلات بصرية فقط من العين المقابلة ، بحيث ينتهي العصب البصري الأيسر في الفص التكتال الأيمن وينتهي العصب البصري الأيمن في الفص التكتالي الأيسر4 (الشكل 1). مثل نظيره الثدييات ، كوليكولوس المتفوق ، يدمج التكتوم البصري المعلومات البصرية مع المدخلات الحسية الأخرى ، بما في ذلك الاختبار والإحساس الجسدي ، والتحكم في التحولات في الانتباه البصري وحركات العين مثل saccades 1,5,6. ومع ذلك ، على عكس كوليكولوس الثدييات العليا ، فإن التكتوم البصري يولد باستمرار خلايا عصبية ودبقية جديدة من مكانة الخلايا الجذعية المتخصصة بالقرب من الحواف الإنسية والذيلية للفصوص التكتالية التي تسمى منطقة الانتشار التكتالي7. تساهم صيانة السلف التكاثرية في التكتوم البصري ومناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي ، جزئيا ، في القدرة التجديدية الرائعة الموثقة في الزرد8.

كشفت الأبحاث السابقة التي فحصت أدمغة الأسماك العمياء أو ذات العين الواحدة أن حجم التكتوم البصري يتناسب طرديا مع كمية تعصيب الشبكية التي يتلقاها9،10،11. في أسماك الكهوف البالغة ، التي تتدهور عيونها في التكوين الجنيني المبكر ، يكون التكتوم البصري أصغر بشكل ملحوظ من الأسماك السطحية المبصرة ذات الصلة الوثيقة9. يمكن منع تنكس عين سمكة الكهف عن طريق استبدال العدسة الداخلية بعدسة من سمكة سطحية أثناء التكوين الجنيني. عندما يتم تربية أسماك الكهوف ذات العين الواحدة هذه حتى مرحلة البلوغ ، يحتوي الفص التكتال المعصب على خلايا أكثر بنسبة 10٪ تقريبا من الفص التكتال غير المعصب9. وبالمثل ، في أسماك اليرقات اليرقات التي تم احتضانها بعلاجات كيميائية لتوليد عيون بأحجام مختلفة داخل نفس الفرد ، كان جانب التكتوم مع المزيد من التعصيب أكبر ويحتوي على المزيد من الخلايا العصبية10. تشير الأدلة المستقاة من تجارب سحق العصب البصري في الأسماك الذهبية البالغة إلى أن التعصيب يعزز الانتشار ، مع انخفاض تكاثر الخلايا التكتالية عندما تعطل التعصيب11.

وتأكيدا لهذه الدراسات الكلاسيكية وتوسيعها، تقدم العديد من التقارير الحديثة بيانات تشير إلى أن الانتشار استجابة للتعصيب يتم تعديله، جزئيا على الأقل، من خلال مسار BDNF-TrkB12,13. لا تزال هناك العديد من الأسئلة المفتوحة حول نمو التكتوم البصري وتطوره ، بما في ذلك كيفية تعامل النظام الحسي النامي مع الإصابة وانحطاط المحور العصبي ، والإشارات الخلوية والجزيئية التي تمكن مدخلات الشبكية من تنظيم نمو التكتوم البصري ، ومتى تصبح هذه الآليات نشطة ، وما إذا كان الانتشار والتمايز المرتبطان بالتعصيب يمكنان شبكية العين وأنسجتها المستهدفة من تنسيق معدلات النمو وضمان رسم خرائط دقيقة للشبكية الشبكية. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أسئلة أكبر بكثير حول التطور المعتمد على النشاط والتي يمكن معالجتها عن طريق استجواب النظام البصري لأسماك الزرد باستخدام الأساليب الجراحية مثل تلك الموضحة أدناه.

للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية التي يغير بها النشاط العصبي ، وتحديدا من المدخلات البصرية ، بقاء الخلايا وانتشارها ، يقارن النهج الموصوف مباشرة الفصوص التكتالية المعصبة والمشوهة (الشكل 1) داخل يرقات الزرد الفردية. تسمح هذه الطريقة بتوثيق تنكس محور RGC في التكتوم البصري وتأكيد أن عدد الخلايا الانقسامية يرتبط بالتعصيب.

figure-introduction-1
الشكل 1: رسومات ليرقات الزرد قبل وبعد إزالة العين من جانب واحد . (أ) رسم يرقات 5 dpf كما ينظر إليها تحت المجهر تشريح. يتم تضمين كل يرقة في الأغاروز منخفض الانصهار وتوجيهها أفقيا قبل استخدام إبرة التنغستن ذات الطرف الحاد المدمن على المخدرات لإخراج العين متجهة لأعلى (العين اليسرى في هذا المثال). (ب) رسم المنظر الظهري ليرقة 9 dpf الناتجة عن الجراحة الموضحة في A. تظهر ثلاثة محاور RGC عالية التخطيط فقط من العين اليمنى وهي تزيل اللفافة وتتصل بالخلايا العصبية في الفص التكتالي الأيسر. الاختصارات: dpf = أيام بعد الإخصاب ؛ dps = أيام ما بعد الجراحة; RGC = خلايا العقدة الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء الأساليب الواردة في هذه الورقة وفقا للمبادئ التوجيهية وموافقة لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في كلية ريد وكلية لندن الجامعية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول سلالات أسماك الزرد المستخدمة في هذه الدراسة.

1. إعداد المواد والأدوات

  1. تقديم الحلول.
    1. اصنع وسط جنين (E314) عن طريق تخفيف مخزون 60x (300 mM NaCl ، و 10.2 mM KCl ، و 20 mM CaCl 2-dihydrate ، و 20 mM MgCl2-hexahydrate في الماء منزوع الأيونات ، والأوتوكلاف ، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة). أضف 160 مل من 60x E3 إلى 10 لتر من الماء منزوع الأيونات. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
    2. اجعل 1٪ من درجة الانصهار المنخفضة (LMP) الأغاروز في E3. يذوب 1 غرام من الأغاروز LMP في 100 مل من E3 عن طريق الغليان في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة على طاقة عالية. أليكوت المنصهر الأغاروز في أنابيب microfuge 1.7 مل ، وتخزينها في 4 درجة مئوية. تغلي في حمام مائي وتمسك في كتلة حرارة 40 درجة مئوية عندما تكون جاهزة للاستخدام للتضمين.
    3. اصنع محلول مارك المعدل (MMR 15) متساوي التوتر عن طريق تخفيف مخزون 10x (1 M NaCl ، 20 mM KCl ، 10 mM MgSO4 ، 20 mM CaCl 2-dihydrate ، 50 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني المعدل إلى 7.5 مع10 M NaOH ، ثم يتم تعقيمه وتخزينه في درجة حرارة الغرفة). أضف 10 مل من 10x MMR إلى 90 مل من الماء منزوع الأيونات.
  2. صب لوحات سيلغارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مما يسمح لها بضبطها وتجفيفها لعدة أيام16.
  3. شحذ إبر التنغستن كهربائيا (بروتوكول معدل من 17).
    1. أولا ، قم بإعداد محلول KOH بنسبة 10٪ (w / v) عن طريق إضافة 200 مل من الماء منزوع الأيونات إلى وعاء زجاجي واسع الفم مع غطاء لولبي. يحرك ببطء في 20 غرام من كريات KOH.
      ملاحظة: هذا المحلول الكاوي طارد للحرارة للغاية. ارتداء القفازات وحماية العين، وتحريك الحل في غطاء المحرك.
    2. قطع طول 2-3 سم من سلك التنغستن وإدخاله في حامل الإبرة.
    3. قم بتوصيل أسلاك الكاثود والأنود بمصدر الطاقة. قم بتوصيل مشبك التمساح في نهاية سلك الكاثود بمشبك ورق مستقيم جزئيا وأدخل مشبك الورق في محلول KOH ، مع إرفاقه بجانب الجرة.
    4. بعد ذلك ، قم بإرفاق مشبك التمساح لسلك الأنود بعنق حامل الإبرة. قم بتشغيل الطاقة (إلى ~ 20 فولت) واغمس سلك التنغستن في محلول KOH ، واسحب السلك من المحلول بزاوية لشحذ السلك كهربائيا إلى طرف دقيق.
      ملاحظة: ستأتي الفقاعات من مشبك الورق أثناء استمرار التفاعل.
    5. تحقق من طرف الإبرة تحت المجهر التشريحي للتأكد من أنها حادة بما فيه الكفاية.
    6. شطف الإبرة بالماء منزوع الأيونات لإزالة جميع بقايا KOH. جعل عدة إبر في وقت مبكر والحفاظ عليها حتى جراحات اليرقات وتشريحها.
  4. اصنع شرائح حجرية لتصوير عينات الزرد باستخدام مجهر متحد البؤرة مستقيم.
    1. احصل على شرائح المجهر الزجاجي وراتنجات الايبوكسي المكونة من جزأين (انظر جدول المواد). امزج الإيبوكسي وفقا للتعليمات الموجودة على العبوة ، وقم بطلاء حلقات سميكة أو مستطيلات على الشرائح الزجاجية. اسمح للشرائح بالشفاء والجفاف في غطاء المحرك لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.

2. جمع الأجنة وتربيتها

  1. قم بإقران الأسماك البالغة من الذكور والإناث من الأنماط الجينية المطلوبة في صناديق التكاثر في وقت متأخر من بعد الظهر / في وقت مبكر من المساء. في صباح اليوم التالي ، بعد أن تفرخ ، قم بجمع البيض المخصب حديثا باستخدام مصفاة شبكية ونقلها إلى E3 في أطباق بتري 100 ملم.
  2. احتضن الأجنة عند ~ 27.5 درجة مئوية مع دورة مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات حتى يوم الجراحة. تغيير E3 يوميا أو حسب الحاجة.
  3. قم بإطعام اليرقات باستخدام قطارة مليئة بالروتيفر المحصود مرة واحدة في اليوم ، بدءا من 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) أو بعد يوم واحد من الجراحة. بعد أن يكون لدى اليرقات عدة ساعات لتناول الطعام ، قم بتغيير E3 لإزالة أي روتيفر ومنتجات النفايات المتبقية.
    ملاحظة: لا تطعم اليرقات في يوم الجراحة.

3. إعداد اليرقات للجراحة

  1. في يوم الجراحة ، استخدم ماصة باستور الزجاجية ذات التجويف العريض لنقل 10-15 يرقات إلى طبق بتري 35 مم مملوء ب E3 الطازج.
  2. تخدير اليرقات عن طريق إضافة 3-5 قطرات من 0.4 ٪ ث / ف محلول تريكاين (0.4 غرام تريكاين مذاب في 210 مللي متر تريس ، الرقم الهيدروجيني 9 ؛ الحل النهائي المعدل إلى درجة الحموضة من 7.4 إذا لزم الأمر18) إلى الطبق للحصول على تركيز نهائي من ~ 0.0015 ٪ ث / v تريكاين. ابحث عن عدم الاستجابة للمس لتحديد ما إذا كانت اليرقات مخدرة بشكل كاف. إذا كانوا لا يزالون يستجيبون للمس بعد ~ 3 دقائق ، أضف 2-3 قطرات أخرى بنسبة 0.4٪ مع محلول Tricaine وإعادة تقييمه.
    ملاحظة: في هذه المرحلة من التطور ، من الممكن مراقبة تدفق الدم ومعدل ضربات القلب بالإضافة إلى الحركة تحت المجهر التشريحي.
  3. شل حركة يرقات الزرد المخدرة عن طريق تضمينها في 1٪ من الأغاروز LMP المذاب في E3.
    1. أولا ، ضع غطاء طبق بتري 35 مم وجها لوجه تحت المجهر التشريحي. بعد ذلك ، خذ يرقة واحدة إلى ماصة باستور الزجاجية الضيقة التجويف مع كمية صغيرة فقط من E3.
    2. ثم ، شفط ~ 200 ميكرولتر من المذابة والدافئة (~ 40 درجة مئوية) 1 ٪ LMP agarose في ماصة مع اليرقات. أخيرا ، رش اليرقة والأغاروز على غطاء طبق بتري رأسا على عقب.
    3. استخدم إبرة التنغستن الباهتة للمناورة بسرعة ولكن بلطف مع اليرقة بحيث تكون جانبية ، مع توجيه عين واحدة لأعلى. انتظر حتى يتم تعيين الأغاروز (~ 5 دقائق).
      ملاحظة: إذا تصلب الأغاروز بينما اليرقة ليست جانبية ، فقم بتحريرها من الأغاروز (كما هو موضح في الخطوة 5) وأعدها إلى الطبق باستخدام E3 و tricaine.

4. إزالة العين

  1. بمجرد ضبط الأغاروز ، ووضع اليرقة أفقيا ، استخدم طرف إبرة التنغستن الدقيقة جدا والحادة كهربائيا لاختراق الجلد حول العين ، بعد حافة مدار العين.
  2. بعد ذلك ، حرك حافة الإبرة (وليس الطرف) تحت العين من الجانب الصدغي البطني للعين. استخدم الضغط المتحكم فيه لتحرير العين من المقبس.
  3. استخدم ملقط جراحي دقيق جدا لإزالة العين عن طريق قرص العصب البصري ودفع العين من الإنسي إلى الجانبي. بدلا من ذلك ، ما عليك سوى الاستمرار في الضغط على العين ظهريا وأماميا مع جانب الإبرة ، وفي النهاية تقطيع العصب البصري وإطلاق العين.
    ملاحظة: إذا تم طعن أنسجة أخرى غير العين عن طريق الخطأ أثناء الجراحة ، فقم بقتل اليرقة بسرعة وإنسانية عن طريق قطع الرأس السريع.

5. رعاية ما بعد الجراحة حتى نقطة النهاية التجريبية

  1. بعد إزالة العين بنجاح ، قم بتغطية الأغاروز بمحلول MMR.
  2. حرر كل يرقة من الأغاروز عن طريق تنظيف إبرة التنغستن بلطف حول رأسها ثم حول جسمها مع تثبيت غطاء طبق بتري بملقط.
  3. انقل اليرقات ذات العين الواحدة إلى طبق بتري 35 مم يحتوي على MMR مكمل بتخفيف 1:100 من كوكتيل البنسلين / الستربتومايسين. احتضن الأجنة عند ~ 27.5 درجة مئوية مع دورة مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات.
    ملاحظة: هذا الحل متساوي التوتر من MMR تكمله المضادات الحيوية يساعد في البداية على شفاء اليرقات والبقاء على قيد الحياة. يمكن لكل طبق أن يستوعب ما يصل إلى 15 يرقات تتعافى.
  4. في اليوم التالي ، أعد اليرقات إلى E3. بدءا من فترة ما بعد الظهر بعد الجراحة ، قم بتغذية اليرقات (~ 6 dpf وما فوق) باستخدام قطارة مليئة بالروتيفر المحصود مرة واحدة في اليوم. بعد أن يكون لدى اليرقات عدة ساعات لتناول الطعام ، قم بتغيير E3 لإزالة أي روتيفر ومنتجات نفايات متبقية.

6. إصلاح اليرقات

  1. بمجرد أن تصل اليرقات إلى مرحلة النمو المطلوبة للتحليل ، قم بتخديرها بجرعة قاتلة من التريكاين (~ 0.4٪ تركيز نهائي) حتى تتوقف قلوبهم.
  2. ماصة تصل إلى 30 يرقات لكل أنبوب microfuge 1.5 مل. قم بإزالة E3 الزائد ثم أضف 0.5-1 مل من محلول التثبيت (4٪ بارافورمالديهايد (PFA) و 4٪ سكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) لإصلاح الأنسجة. احتضان اليرقات بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  3. اغسل اليرقات باستخدام PBS في اليوم التالي عن طريق إزالة المثبت وشطف اليرقات 3-4 مرات باستخدام PBS. تخزين اليرقات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام قبل تشريح.

7. تشريح اليرقات للكشف عن الأدمغة (مقتبس من 15)

  1. اليرقات الثابتة في قطرات PBS على صفيحة سيلغارد تحت مجهر تشريح. قم بتأمينها أفقيا عن طريق وضع اثنين من دبابيس التنغستن (عادة ما تكون إبر التنغستن القديمة التي تقل عن 2 سم) من خلال notochord ، مع دبوس واحد فقط خلف المنطقة المصطبغة التي تغطي منطقة الشريان الأورطي والغدد التناسلية وميزونفروس (AGM) وآخر يتماشى مع نهاية امتداد صفار البيض.
    ملاحظة: ضع دبابيس التنغستن في أقل عدد ممكن من المحاولات لأن الأنسجة ستصبح أكثر قابلية للتفتيت مع كل ثقب.
  2. استخدم إبرة التنغستن الحادة جدا والملقط الحاد بالإبرة لفضح الدماغ عن طريق إزالة العين (العينين) والأذن والفك والجهاز الهضمي وجلد الجمجمة الظهرية بهذا الترتيب.
    1. أولا ، قم بإزالة العين باستخدام تقنية مشابهة لإزالة العين الجراحية في الخطوة 4. ثم ، قم بفك اليرقة وقلبها إلى الجانب الآخر ، بحيث يمكن الوصول إلى العين الأخرى وتكرارها. بدلا من ذلك ، قم بكز الإبرة من خلال الفك إلى الجانب الآخر وإزالة العين دون فك.
      ملاحظة: يمكن جمع العيون في هذه المرحلة إذا كان تحليل هذا النسيج مطلوبا (على غرار 19).
    2. بعد ذلك ، استخدم إبرة التنغستن للخدش من الجانب الصدغي إلى الجانب البطني من الأذن. في نفس الإجراء / الحركة ، أحضر الإبرة الخلفية إلى الفك واسحبها بلطف إلى الأمام حتى تتم إزالة الأذن والفك.
    3. استخدم الملقط لسحب الأعضاء البطنية وأي صفار متبقي.
    4. أخيرا ، قم بعمل شق ضحل في جلد الجمجمة الظهرية بالقرب من التقاطع بين الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. ارفع الجلد باستخدام الملقط واسحبه أماميا وحول الدماغ الدماغي. إذا ثبت أن هذا صعب للغاية ، فابدأ في الشق الأولي في الدماغ الخلفي واسحب الجلد أولا أفقيا ثم بطنيا وأماميا ، مع الحرص الشديد على عدم خدش الحواف الجانبية للتكتوم.
      ملاحظة: نظرا لأن الدماغ المتوسط هو موضوع الدراسة ، يمكن قطع الدماغ الخلفي. ومع ذلك ، قد يؤدي شق عميق إلى قطع الرأس.
    5. إزالة أي الأنسجة المتبقية مع ملقط. قم بفك اليرقة ونقلها إلى PBS في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: اترك الذيل متصلا بالدماغ للحصول على رؤية أفضل عند تنفيذ بروتوكولات التثبيت الكامل.

8. جفاف الدماغ والتخزين

  1. إزالة PBS من الأدمغة وإضافة 1 مل من PBS تحتوي على 0.1٪ TritonX-100 (PBST). حضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإزالة PBST واستبدله بمحلول ميثانول: PBST بنسبة 50:50. حضانة لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل الأدمغة بالميثانول 100٪ (MeOH) مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة.
  4. تخزين الأدمغة في 100٪ MeOH في -20 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل قبل إجراء الكيمياء المناعية أو غيرها من الإجراءات الكاملة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأدمغة في MeOH لمدة تصل إلى عامين عند -20 درجة مئوية.

9. الكيمياء النسيجية المناعية

ملاحظة: يمكن العثور على البروتوكولات المعمول بها للعديد من تقنيات التركيب الكامل المفيدة في أسماك الزرد على ZFIN20. تقدم هذه المخطوطة أمثلة تقارن بين اليرقات ذات العين الواحدة والعينين التي كانت ملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة التي تتعرف إما على بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP) ، والذي يتم التعبير عنه في محاور العصب البصري في خط Tg[atoh7: RFP] (الشكل 2) ، أو هيستون H3 المفسفرة (PH3) ، والذي يسلط الضوء على الخلايا الانقسامية (الشكل 3). يتم تلخيص بروتوكول الكيمياء النسيجية المناعية القياسي للأجنة واليرقات الكاملة أدناه.

  1. أولا ، قم بإعادة ترطيب أدمغة اليرقات بسلسلة متدرجة من MeOH: PBST يغسل في درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضان العينات في 50:50 MeOH: PBST لمدة 5 دقائق ، ثم في 30:70 MeOH: PBST لمدة 5 دقائق ، وتنتهي ب 3 غسلات من PBST.
  2. لتخلل الأدمغة ، احتضنها في PBST المكمل بالبروتين K (PK) بتركيز نهائي من 20 ميكروغرام / مل PK لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تخزين aliquots من 10 ملغ / مل PK في -20 درجة مئوية وإذابتها قبل الاستخدام.
  3. قم بإزالة محلول PK واغسل أي إنزيم متبقي عن طريق شطف الأدمغة باستخدام PBST 3 مرات على مدار 15 دقيقة.
  4. قم بإصلاح الأدمغة المتخلل عن طريق احتضانها في 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة). ثم ، قم بإزالة PFA وغسل أي مثبت متبقي عن طريق شطف الأدمغة 3 مرات على مدار 15 دقيقة باستخدام PBST.
  5. استبدل شطف PBST النهائي بمخزن مؤقت مانع للمناعة (IB) طازج (10٪ مصل الماعز العادي و 1٪ DMSO في PBST) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  6. قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية إلى مخزن مؤقت IB بالتركيز المناسب (على سبيل المثال ، 1:500 ل RFP و 1:300 للأجسام المضادة PH3).
  7. قم بإزالة المخزن المؤقت IB من الأدمغة واستبدله بتخفيف الأجسام المضادة الأولية. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر مداري مع هزاز لطيف. تأكد من أن الأنابيب تستقر بشكل آمن على جوانبها.
  8. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي باستخدام ماصة دقيقة ، وشطف عدة مرات في PBST ، ثم اغسل الأدمغة في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 × 30 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام تخفيفات الأجسام المضادة الأولية مرة واحدة في غضون 7 أيام تقريبا إذا تم تخزينها عند 4 درجات مئوية.
  9. شطف الأدمغة في المخزن المؤقت IB مع تخفيف الأجسام المضادة الثانوية إلى المخزن المؤقت IB بالتركيز المناسب (على سبيل المثال ، 1: 500 ل Alexa-fluor 568 المضادة للأرانب).
  10. قم بإزالة المخزن المؤقت IB واستبدله بتخفيف الأجسام المضادة الثانوي. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على اهتزاز مداري مع هزاز لطيف من الأنابيب التي تستقر على جانبيها.
  11. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوي ، وشطفه باستخدام PBST ، ثم اغسل الأدمغة في PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 × 30 دقيقة.
  12. Counterstain مع 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) أو ToPro3 (1:5,000 في PBST عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها).
  13. في صباح اليوم التالي ، انقل أدمغة اليرقات إلى PBS وانتقل إلى خطوات التركيب والتصوير المذكورة أدناه.

10. التركيب والتصوير

  1. قم بتأمين شريحة حجرية في غطاء طبق بتري 100 مم مع شحوم التفريغ.
  2. انقل اليرقات الملطخة بالمناعة والمعالجة إلى صفيحة بئر أو شريحة اكتئاب لعرضها باستخدام مجهر تشريح.
  3. قم بتركيب اليرقات على الشريحة الحجرية في أعمدة من 1٪ LMP agarose.
    1. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، ضع يرقة واحدة على الشريحة الحجرية ، وترسب أقل قدر ممكن من PBS. مع نفس الماصة ، قم بتغطية اليرقة بأغاروز LMP المنصهر بنسبة 1٪ (~ 40 درجة مئوية).
    2. باستخدام إبرة التنغستن الحادة أو الملقط ، ارسم الأغاروز في عمود ثم ضع اليرقة بشكل متماثل قدر الإمكان ، مع رؤية السطح الظهري.
    3. كرر هذا الإجراء لليرقات المتبقية.
    4. بمجرد أن يصبح الأغاروز هلاميا ، قم بتغطيته ببضع قطرات من PBS ثم ضعه على مسرح المجهر البؤري.
  4. قم بمحاذاة العدسة الموضوعية مع العينة ، وركز المجهر باستخدام الضوء المنقول ، وأضيء العينة باستخدام أشعة الليزر المناسبة.
    ملاحظة: في هذا المثال، تم استخدام الأطوال الموجية 405 نانومتر و568 نانومتر لإثارة DAPI وRFP، على التوالي.
  5. اضبط الكسب والإزاحة وطاقة الليزر عن طريق تحريك أشرطة التمرير إلى مستوى مناسب بالنسبة للإشارة والكاشف المستخدم. تحقق من الرسوم البيانية لكل قناة وانقر فوق زر مؤشر حالة التشبع أعلى الصورة لقياس مستوى التعرض، مما يضمن عدم تشبع أي من وحدات البكسل وأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. للحصول على مثال على معلمات التصوير البؤري المثلى للدقة الخلوية ودون الخلوية داخل أسماك الزرد ، انظر 21.
  6. اضبط الحدود العليا والسفلى لمكدس الطائرات z باستخدام عجلة التمرير الموجودة على الماوس للعثور على الجزء العلوي والسفلي من العينة. انقر فوق الحدين العلوي والسفلي للحصول على الصورة، ثم قم بتشغيل التقاط z-stack بالنقر فوق الزر تشغيل الآن .
    ملاحظة: اعتمادا على مدى تناسق الدماغ ، سيكون إجمالي عمق z لدماغ الزرد اليرقي 9 dpf ~ 150-200 ميكرومتر.
  7. قم بمعالجة الصور وتلوينها مع وضع إمكانية الوصول إلى عمى الألوان في الاعتبار (على سبيل المثال ، استخدم الأزرق والبرتقالي أو الأرجواني والأخضر للصور ذات اللونين). قم بإعداد جداول البحث في البرنامج المستخدم لالتقاط الصور أو برامج معالجة الصور مثل Photoshop من Adobe.
  8. في Photoshop، يتم حفظ الصور الفوتوغرافية المجهرية الخام الملونة بتنسيق ملف الصورة المميز 8 بت (TIFF) عن طريق (i) تحويل وضع الصورة إلى RGB و (ii) الوصول إلى خيار المنحنيات ضمن Image | يقوم بضبط القوائم ثم (iii) تحريك مخرجات الضوء الملون المناسبة إلى مستويات 0 أو 255 لتحقيق اللون المطلوب. على سبيل المثال ، لتحقيق إشارة خضراء ، حدد القناة الحمراء وحرك مخرجاتها إلى 0 ؛ ثم حدد القناة الزرقاء وحرك مخرجاتها إلى 0 أيضا. وبالمثل ، لتحقيق إشارة أرجوانية ، حدد القناة الخضراء وحرك مخرجاتها إلى 0 ؛ اترك القنوات الحمراء والزرقاء كما هي.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ خطوات مماثلة في برنامج معالجة صور Gnu المجاني (GIMP).
  9. قم بقياس أعداد الخلايا التي تعرض علامة معينة يدويا باستخدام المكون الإضافي لعداد الخلايا في ImageJ22 ، المتوفر ضمن تحليل في قائمة المكونات الإضافية. يمكن العثور على أمثلة حول كيفية استخدام ImageJ لحساب الخلايا في العديد من البرامج التعليمية ، بما في ذلك 23.
  10. إنشاء تمثيلات رسومية للبيانات في البرامج الإحصائية مثل RStudio (انظر البيانات التكميلية ل . ملف RMD).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتأكد مما إذا كانت إزالة العين قد اكتملت وتقييم كيفية تغير التكتوم البصري ، تم إجراء العمليات الجراحية في سلالة Tg[atoh7: RFP] ، والتي تضع علامات على جميع RGCs مع RFP مستهدف بالغشاء ، وبالتالي ، جميع المحاور التي تظهر من شبكية العين وتشكل العصب البصري24. على الرغم من أن استخدام هذه السلالة ليس ضروريا للغاية ، إلا أنه يتيح المراقبة المباشرة والتصور للعصب البصري termini في neuropil tectum البصري. كما يمكن اتباع طرق أخرى لوضع العلامات على العصب البصري ، مثل تتبع المحور العصبي باستخدام أصباغ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

توضح التقنيات الموصوفة في هذه الورقة واحدة من العديد من الطرق لدراسة تطور النظام البصري للفقاريات في أسماك الزرد. نشر باحثون آخرون طرقا لتشريح الشبكية الجنينية وإجراء تحليلات التعبير الجيني19 أو تصور النشاط العصبي في التكتوم البصري30. تقدم هذه الورقة نهجا لاستكشاف كيفية تأثير مدخلات الشبكية التفاضلية على سلوكيات الخلايا في التكتوم البصري.

لضمان استئصال العين بنجاح وبقاء اليرقات بعد الجراحة ، من المهم أن تكون اليرقات صحية ومخدرة بشكل كاف ومجمدة في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم تمويل هذا العمل في المقام الأول من خلال أموال بدء التشغيل من كلية ريد إلى KLC ، وأموال زمالة هيلين ستافورد للأبحاث إلى OLH ، وزمالة أبحاث العلوم في كلية ريد إلى YK. بدأ هذا المشروع في مختبر ستيف ويلسون كتعاون مع الموارد البشرية ، الذي تم دعمه من قبل Wellcome Trust Studentship (2009-2014). نشكر ماتي فارغا وستيف ويلسون وأعضاء آخرين في مختبر ويلسون على المناقشات الأولية حول هذا المشروع ، ونشكر بشكل خاص فلورنسيا كافوداسي وكيت إدواردز ، الذين كانوا أول من علم KLC كيفية تركيب الأجنة في الأغاروز وإجراء تشريح دماغ الزرد. كما نشكر غريتا غلوفر وجاي إيوينغ على المساعدة في تجميع جهاز شحذ إبرة التنغستن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
< قوي > المعدات واللوازم: < / قوي >
صناديق تربيةAquaneeringZHCT100
Dow Corning شحوم عالية الفراغSigma أو مورد مكافئZ273554
قوارير Erlenmeyer (125 مل)لصنع حلقات مارك المعدلة (MMR) مع المضادات الحيوية لحضانة ما بعد الجراحة.
ملقط دقيق - Dumont # 5Fine Science Tools (FST)11252-20
ماصات باستور زجاجيةDWK Lifescience63A53 & 63A53WTلسحب الأجنة واليرقات.
يمكن طلب شرائح زجاجية للفحص المجهريVWR أو المورد المكافئ48311-703المجهر الزجاجي القياسية من العديد من موردي المختبرات المختلفين.
الأواني الزجاجية بما في ذلك الزجاجات المتدرجة والأسطواناتلصنع وتخزين المحاليل.
2-جزء راتنجات الايبوكسيACE الأجهزة أو أي مورد آخر مكافئ من Gorilla Glue أو ما يعادل0.85 أوقية حقنةhttps://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (1.7 مل)VWR أو ما يعادله22234-046
حامل دبوس مطلي بالنيكل (طول 17 سم)أدوات العلوم الدقيقة (FST)26018-17لتثبيت سلك التنغستن أثناء شحذ وإجراء العمليات الجراحية / التشريح.
مصفاة شاي شبكية من النايلون أو ما يعادلهامن Ali Express أو ما يعادلهالحصاد بيض الزرد بعد التفريخ ؛ https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
مشبكلجهاز شحذ إبرة التنغستن.
أطباق بتري 100 ممفيشر علمي أو ما يعادلها50-190-0267
أطباق بتري 35 ممفيشر علمي أو ما يعادلهاالمورد 08-757-100A
مضخة ماصةSP بيل آرت أو ما يعادلهاF37898-0000
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)سيجما909122لجهاز شحذ إبرة التنغستن. اصنع محلول وزن / حجم 10٪ من KOH في الغطاء عن طريق إضافة الكريات إلى الماء منزوع الأيونات.
امدادات الطاقة (الجهد المتغير)لجهاز شحذ إبرة التنغستن. سيعمل أي مصدر طاقة بجهد متغير (حتى لو كان يستخدم في الرحلان الكهربائي للهلام).
مجموعة المطاط الصناعي Sylgard 184Dow Corning3097358
سلك التنغستن (قطر 0.125 مم) WorldPrecision Instruments (WPI)TGW0515شحذ لإزالة العين وتشريح اليرقات.
كتلة حرارية متغيرةدرجة الحرارة BSH1001 مستودع المختبر أو المورد المكافئ أو ما يعادلهBSH1002ضبط على 40-42 درجة ؛ C قبل التجارب.
جرة زجاجية واسعة الفم مع غطاء (على سبيل المثال ، مربى نظيف أو جرة صلصة)لجهاز شحذ إبرة التنغستن.
الأسلاك مع مشبك التمساح يؤديلجهاز شحذ إبرة التنغستن.
< قوي > مجاهر: < / قوي >
تشريح المجهرسيعمل أي نوع ولكن يفضل وجود ضوء مرسل قابل للتعديل على قاعدة معكوسة.
متحد البؤر بالمسح بالليزرعالي NA ، 20-25x عدسة موضوعية بالغمس في الماء.
يتم استخدام برنامج التحكم في المجهر والتقاط الصور (NIS-Elements من نيكون) هنا ولكن أي مجهر متحد البؤر سيعمل.
<قوية>كواشف للعمليات الجراحية والتشريح: < / قوي >
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتسيجماC7902لجرس مارك المعدل (MMR) ووسط الجنين (E3).
HEPESSigmaH7006لجرس مارك المعدل (MMR).
نقطة انصهار منخفضة الاغاروزInvitrogen16520-050اصنع 1٪ في وسط الجنين (E3) أو جرس مارك المعدل (MMR).
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومسيجما1374248لوسط الجنين (E3).
كبريتات المغنيسيومSigmaM7506لجرس مارك المعدلة (MMR).
علوم المجهربارافورمالديهايد19210يخفف 8٪ (وزن / حجم) مخزون مع 2x PBS مركز (مخفف من مخزون 10x PBS).
بنسلين / ستربتومايسينسيجماP4333-20MLمخفف 1: 100 في رنين مارك المعدل.
أقراص محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)التشخيص BioSystemsDMR E404-01اصنع مخزونا 10x في الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف وخزنها في درجة حرارة الغرفة. خفف إلى 1x تركيز العمل.
كلوريد البوتاسيومسيجماP3911لجرس مارك المعدل (MMR) ووسط الجنين (E3).
كلوريد الصوديومسيجماS9888لجرس مارك المعدل (MMR) ووسط الجنين (E3).
هيدروكسيد الصوديومSigmaS5881اصنع 10 م واستخدمه لضبط درجة الحموضة من MMR إلى 7.4.
السكروزسيجماS9378
Tricaine-SPentair100Gوصفة #TRS1: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
<قوي>كواشف الكيمياء المناعية: < / strong>
Alexafluor 568 الموسومة الجسم المضاد الثانوي للكشف عن الأرانب IgGInvitrogenA-11011استخدم عند تخفيف 1: 500 للتركيب الكامل الكيمياء المناعية.
DAPI أو ToPro3Invitrogen1306 أو T3605تشكل محاليل 1 مجم / مل في DMSO ؛ 1: 5,000 تخفيف لمواجهة التلطيخ.
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD8418أحد مكونات المخزن المؤقت للكتلة المناعية.
الميثانول (MeOH)Sigma34860خلط MeOH مع المحاليل المائية مثل PBST طارد للحرارة. اصنع محاليل MeOH / PBST قبل عدة ساعات على الأقل من الموعد المحدد أو قم بتبريدها على الجليد قبل الاستخدام.
مصل الماعز العاديThermoFisher Scientific50-062Zمكون من عازلة الكتلة المناعية. يمكن تقسيسها في أحجام 1-10 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
الجسم المضاد الأساسي للكشف عن الفوسفوهيستون H3Millipore06-570استخدم عند تخفيف 1: 300 للكيمياء المناعية الكاملة.
الجسم المضاد الأساسي للكشف عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP ؛ يكتشف مشتقات dsRed)يستخدم MBL InternationalPM005عند تخفيف 1: 500 للكيمياء المناعية الكاملة.
بروتيناز K (PK)SigmaP2308-10MGتشكل محاليل مخزون 10 مجم / مل في PBS وتستخدم في 10 & ميكرو ؛ جم / مل.
Triton X-100SigmaT8787مفيد لصنع حل مخزون بنسبة 20٪ (حجم حجمي / حجم) في PBS.
<قوي>برنامج لتحليل البيانات
ImageJ (فيجي)برنامج مجاني لتحليل الصور؛ https://imagej.net/software/fiji/
RStudioمجاني للتحليل الإحصائي وتصور البيانات؛ https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
أدوبي فوتوشوب أو GIMPغالبا ما تستخدم برامج معالجة الصور الخاصة (Adobe Photoshop و Illustrator) لإنشاء الأشكال). بديل مجاني هو برنامج Gnu Image Manipulation Program (GIMP ؛ https://www.gimp.org/)
Zebrafish strins.< / strong> استخدمت هذه الدراسة سلالات AB و TU و Tg [atoh7: RFP] < / i>.متاح من  مراكز الموارد الدولية لأسماك الزرد في الولايات المتحدة (https://zebrafish.org/home/guide.php) أو في أوروبا (https://www.ezrc.kit.edu/). يمكن طلب السلالات المعدلة وراثيا المتخصصة التي لم يتم إيداعها بعد في أي من مراكز الموارد من المختبرات الفردية بعد النشر.
شرائح المتدرجة ورق يوصى باستخدام المجهر الإلكتروني

المراجع

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14(2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

السقف البصريالمحاور الشبكيةالتطور العصبيتشريح الدماغالكيمياء النسيجية المناعيةتصوير الخلايا الحيةتنكس والريانمنافذ الخلايا الجذعية
إزالة العين في يرقات الزرد الحية لفحص النمو والتطور المعتمد على التعصيب للنظام البصري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.