مقالة منهجية

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

2.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63636

⸱

أبريل 6, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

في هذه المقالة

ملخص

إن عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة الطفيلي المجهري Nematocida parisii تمكن الديدان من إنتاج ذرية شديدة المقاومة لنفس العامل الممرض. هذا مثال على المناعة الموروثة ، وهي ظاهرة جينية غير مفهومة جيدا. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة الموروثة في نموذج دودة قابلة للسحب وراثيا.

الملخص

تصف المناعة الموروثة كيف يمكن لبعض الحيوانات أن تنقل "ذاكرة" عدوى سابقة إلى ذريتها. هذا يمكن أن يعزز مقاومة مسببات الأمراض في ذريتهم ويعزز البقاء على قيد الحياة. في حين تم الإبلاغ عن المناعة الموروثة في العديد من اللافقاريات ، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظاهرة اللاجينية غير معروفة إلى حد كبير. تؤدي عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة العامل الممرض الطبيعي Nematocida parisii إلى إنتاج الديدان ذرية مقاومة بقوة ل microsporidia. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة بين الأجيال في نموذج عدوى N. parisii -C. elegans البسيط والوراثي. تصف المقالة الحالية طرق إصابة C. elegans وتوليد ذرية مناعية. يتم إعطاء طرق أيضا لفحص مقاومة عدوى microsporidia عن طريق تلطيخ microsporidia وتصور العدوى عن طريق الفحص المجهري. على وجه الخصوص ، تمنع المناعة الموروثة غزو الخلايا المضيفة بواسطة microsporidia ، ويمكن استخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتحديد أحداث الغزو. يمكن تحديد الكمية النسبية من جراثيم microsporidia المنتجة في النسل المناعي عن طريق تلطيخ الجراثيم بصبغة ملزمة للكيتين. حتى الآن ، ألقت هذه الطرق الضوء على الحركية وخصوصية مسببات الأمراض للمناعة الموروثة ، وكذلك الآليات الجزيئية الكامنة وراءها. هذه التقنيات ، إلى جانب الأدوات الواسعة المتاحة لأبحاث C. elegans ، ستمكن من اكتشافات مهمة في مجال المناعة الموروثة.

المقدمة

المناعة الموروثة هي ظاهرة جينية حيث يمكن أن يؤدي تعرض الوالدين لمسببات الأمراض إلى تمكين إنتاج ذرية مقاومة للعدوى. وقد ظهر هذا النوع من الذاكرة المناعية في العديد من اللافقاريات التي تفتقر إلى أجهزة المناعة التكيفية ويمكن أن تحمي من الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية1. في حين أن المناعة الموروثة لها آثار مهمة على فهم كل من الصحة والتطور ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الحماية غير معروفة إلى حد كبير. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن العديد من الحيوانات التي وصفت فيها المناعة الموروثة ليست كائنات حية نموذجية راسخة للبحث. وعلى النقيض من ذلك، تستفيد الدراسات التي أجريت على الديدان الخيطية الشفافة Caenorhabditis elegans من مجموعة أدوات وراثية وكيميائية حيوية واسعة النطاق2،3، وجينوم مشروح للغاية4،5، ووقت جيل قصير. في الواقع ، مكنت الأبحاث في C. elegans من تحقيق تقدم أساسي في مجالات علم الوراثة اللاجينية والمناعة الفطرية 6,7 ، وهي الآن نموذج راسخ لدراسة الذاكرة المناعية 8,9.

Microsporidia هي مسببات الأمراض الفطرية التي تصيب جميع الحيوانات تقريبا وتسبب التهابات قاتلة في البشر الذين يعانون من نقص المناعة10. تبدأ العدوى عندما يحقن بوغ microsporidia أو "يطلق" محتوياته الخلوية (sporoplasm) في خلية مضيفة باستخدام بنية تسمى الأنبوب القطبي. يؤدي التكرار داخل الخلايا للطفيلي إلى تكوين ميرونتس ، والتي تتمايز في النهاية إلى جراثيم ناضجة يمكنها الخروج من الخلية11,12. في حين أن هذه الطفيليات ضارة بصحة الإنسان والأمن الغذائي ، لا يزال هناك الكثير لتعلمه عن بيولوجيا العدوى12. Nematocida parisii هو طفيلي ميكروسبوريديان طبيعي يتكاثر حصريا في الخلايا المعوية للديدان ، مما يؤدي إلى انخفاض الخصوبة ، وفي النهاية ، الموت. تم استخدام نموذج عدوى N. parisii -C. elegans لإظهار: (1) دور الالتهام الذاتي في إزالة مسببات الأمراض13 ، (2) كيف يمكن ل microsporidia الخروج من الخلايا المصابة بشكل غير منطقي 14 ، (3) كيف يمكن لمسببات الأمراض أن تنتشر من خلية إلى أخرى عن طريق تشكيل syncytia 15 ، (4) البروتينات N. parisii تستخدمها للتفاعل مع مضيفها 16 ، و (5) تنظيم استجابة مسببات الأمراض داخل الخلايا النسخية (IPR) 17 ، 18.

يتم وصف بروتوكولات عدوى C. elegans في العمل الحالي ويمكن استخدامها للكشف عن بيولوجيا microsporidia الفريدة وتشريح استجابة المضيف للعدوى. يظهر الفحص المجهري للديدان الثابتة الملطخة بصبغة ربط الكيتين Direct Yellow 96 (DY96) انتشار العدوى لجراثيم microsporidia المحتوية على الكيتين في جميع أنحاء الأمعاء. كما يتيح تلطيخ DY96 تصور أجنة الدودة المحتوية على الكيتين للتقييم المتزامن لجاذبية الدودة (القدرة على إنتاج الأجنة) كقراءة للياقة البدنية للمضيف.

وقد كشفت الأبحاث الحديثة أن C. elegans المصابة ب N. parisii تنتج ذرية مقاومة بقوة لنفس العدوى19. تستمر هذه المناعة الموروثة جيلا واحدا وتعتمد على الجرعة ، حيث أن النسل من الآباء المصابين بشدة أكثر مقاومة للميكروسبوريديا. ومن المثير للاهتمام ، أن النسل الجاهز ل N. parisii هو أيضا أكثر مقاومة لمسببات الأمراض المعوية البكتيرية Pseudomonas aeruginosa ، على الرغم من أنها ليست محمية ضد الممرض الطبيعي Orsay virus19. يظهر العمل الحالي أيضا أن النسل المناعي يحد من غزو الخلايا المضيفة بواسطة microsporidia. تصف الطريقة أيضا جمع النسل المناعي وكيف يمكن استخدام FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي N. parisii في الخلايا المعوية لفحص غزو الخلايا المضيفة وإطلاق الجراثيم20.

معا ، توفر هذه البروتوكولات أساسا متينا لدراسة microsporidia والمناعة الموروثة في C. elegans. ومن المأمول فيه أن يتيح العمل المستقبلي في هذا النظام النموذجي اكتشافات هامة في مجال المناعة الموروثة الوليد. ومن المرجح أيضا أن تكون هذه التقنيات نقاط انطلاق للتحقيق في المناعة الموروثة التي يسببها الميكروسبوريديا في الكائنات الحية المضيفة الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تستخدم هذه الدراسة سلالة C. elegans Bristol من النوع البري N2 التي تزرع عند 21 درجة مئوية.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. إعداد وسائط M9 وفقا للتقرير السابق21,22.
  2. تحضير وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) وفقا للتقرير السابق21,22. صب 12 مل من NGM لكل لوحة 6 سم أو 30 مل لكل لوحة 10 سم.
  3. تحضير سلالة الإشريكية القولونية OP50-1 وفقا للتقرير السابق23.
  4. قم بإعداد ألواح NGM البذرة OP50-1 باتباع الخطوات أدناه.
    1. أعد تعليق OP50-1 المركز 10x عن طريق الدوامة.
    2. استخدم ماصة مكرر لزرع الألواح في الوسط. بالنسبة لألواح 6 سم و 10 سم ، البذور بحجم 200 ميكرولتر أو 500 ميكرولتر ، على التوالي.
    3. بالنسبة لألواح 10 سم ، استخدم موزعا زجاجيا لنشر OP50-1 وإنشاء حديقة من البكتيريا. لا تنشر البكتيريا على حافة اللوحة.
      ملاحظة: يقوم الإيثانول بغمس وإشعال الموزع كل خمس أطباق لضمان العقم. اترك الموزع ليبرد لبضع ثوان قبل أن ينتشر لمنع قتل البكتيريا.
    4. اترك الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 أيام لتجف ولضمان نمو العشب البكتيري.
      ملاحظة: يمكن تخزين الألواح البذرية في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أسابيع أو عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.

2. صيانة C. elegans

  1. الحفاظ على الديدان على مصدر غذائي بكتيري ثابت على ألواح NGM البذرة OP50-1.
    ملاحظة: قد يؤدي الجوع إلى أنماط ظاهرية بين الأجيال، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج. تدعم اللوحة البذرة OP50-1 مقاس 10 سم 2500 L1s (المرحلة اليرقية الأولى من C. elegans) لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  2. إذا كانت الديدان تتضور جوعا ، فتنمو لمدة ثلاثة أجيال على OP50-1 قبل استخدام الديدان للتجارب.

3. تزامن مجموعات C. elegans باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض)

ملاحظة: هذه الخطوة حساسة جدا للوقت، لذا تأكد من توفر جهاز الطرد المركزي قبل البدء. تتوفر بروتوكولات تبييض بديلة أقل سرعة في الأدبيات ويمكن استخدامها إذا كنت تفضل ذلك. لمنع 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم من فقدان النشاط مع مرور الوقت ، قم بتخزين الكاشف في الظلام عند 4 درجات مئوية واحتفظ به لمدة تصل إلى 1 سنة.

  1. تحضير 2 مل من محلول التبييض لكل عينة عن طريق خلط 400 ميكرولتر من 1 مليون NaOH ، و 250 ميكرولتر من هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 6٪ (انظر جدول المواد) ، و 1350 ميكرولتر من الماء المقطر.
  2. اغسل الديدان البالغة (~ 72 ساعة بعد الفقس) من الألواح إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق باستخدام 1 مل من وسائط M9.
    ملاحظة: إذا بقيت العديد من الديدان على الصفائح ، فقم بتكسير الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 1400 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة supernatant باستخدام طرف ماصة 1 مل ، وقم بإجراء عمليات غسيل إضافية للصفيحة.
  3. جهاز طرد مركزي عند 1400 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان ، ثم اغسل 2x ب 1 مل من وسائط M9 لإزالة البكتيريا.
  4. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأضف 1 مل من محلول التبييض المحضر (الخطوة 3.1) ، واضبط المؤقت لمدة دقيقة واحدة. عكس الأنابيب 3-4x.
    ملاحظة: تحت المجهر الضوئي ، يمكن رؤية الديدان تتوقف عن الضرب.
  5. بعد 1 دقيقة ، قم بجهاز طرد مركزي عند 3000 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان ، ثم قم بإزالة supernatant وإضافة 1 مل من محلول التبييض الطازج.
  6. راقب الأنبوب (الأنبوب) عن كثب تحت المجهر الضوئي لتصور جثث الدودة التي تنقسم مفتوحة وتطلق الأجنة. تقدم على الفور إلى الخطوة التالية عندما انقسمت حوالي 50٪ -80٪ من الجثث مفتوحة وتم إطلاق العديد من الأجنة.
    ملاحظة: اعتمادا على عدد الحيوانات وسلالة الدودة، يمكن أن تستغرق هذه الخطوة من 15 ثانية إلى 4 دقائق. لأسباب غير معروفة ، غالبا ما تستغرق الديدان المصابة ب N. parisii وقتا أطول للتبييض من الحيوانات غير المصابة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 3000 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الأجنة ، ثم غسل 3x في 1 مل من وسائط M9.
    ملاحظة: تعمل عمليات الغسيل على تخفيف محلول هيبوكلوريت المتبقي من الأنابيب ويجب إجراؤه بسرعة لضمان عدم إتلاف محلول التبييض للأجنة.
  8. أضف 1 مل من وسائط M9 إلى الكرية النهائية وانقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 4 مل من وسائط M9. تعليق الأجنة في حجم نهائي من 5 مل.
  9. تدور الأنابيب على دوار ميكانيكي (انظر جدول المواد) عند 21 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة لتفقيس الأجنة إلى L1s.
    ملاحظة: بما أن N. parisii يصيب أمعاء الدودة ولا يغزو الخط الجرثومي ، فإن الآباء المصابين لا ينقلون العدوى إلى ذريتهم عن طريق الانتقال الرأسي19. يؤدي تبييض البالغين المصابين إلى مزامنة F1 وتدمير جراثيم N. parisii ، مما يضمن عدم إصابة ذرية F1 بالجراثيم المنقولة من الوالدين.
  10. قم بطرد الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 1800 × g في درجة حرارة الغرفة لتكوير L1s ، وتخلص من جميع ما عدا 1 مل من supernatant.
  11. ماصة 1-5 ميكرولتر من خليط L1 على صفيحة NGM غير مبذرة ، وقم على الفور بحساب عدد L1s في القطرة عن طريق التصور تحت المجهر الضوئي. كرر 3x ومتوسط الأعداد لتحديد التركيز والعدد الإجمالي ل L1s.
    ملاحظة: يجب أن تفقس غالبية الأجنة ، ويجب أن تتحرك L1s بسرعة في القطرة السائلة. إذا بقيت نسبة كبيرة من الأجنة غير المفرخة و L1s الخاملة (بطيئة الحركة) ، فهذا يشير إلى التبييض لفترة طويلة جدا.

4. إعداد جراثيم N. parisii

  1. إعداد جراثيم N. parisii بعد المراجع المنشورة سابقا19,24.

5. عدوى C. elegans مع N. parisii لإنتاج ذرية مهيأة للمناعة

  1. قبل يوم واحد من العدوى المخطط لها ، حرك العدد المطلوب من ألواح NGM غير المزروعة مقاس 10 سم من 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. مباشرة قبل الإصابة ، جهاز طرد مركزي ~ 2500 ديدان L1 متزامنة عند 1400 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق لتكوير الديدان. إزالة supernatant مع طرف ماصة لترك الديدان في ~ 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام M9.
  3. أضف 1 مل من 10x OP50-1 إلى جراثيم L1s و N. parisii إلى التركيز المطلوب (عادة ~ 2.5 مليون جراثيم). كعنصر تحكم غير مصاب ، قم بإعداد أنبوب مكافئ من L1s و OP50-1 بحجم من وسائط M9 يعادل حجم إعداد الجراثيم المستخدمة.
    ملاحظة: للحصول على ذرية مهيأة للمناعة، استخدم جرعة بوغ عالية بما فيه الكفاية بحيث يصاب >90٪ من الحيوانات بنسبة 72 ساعة (كما تم قياسها بواسطة تلطيخ DY96، الخطوة 7) ولكنها منخفضة بما فيه الكفاية بحيث لا تزال >80٪ من الحيوانات محبوضة. وهذا يضمن أن معظم النسل يأتي من الآباء المصابين وأن تبييض الوالدين ينتج عنه أجنة كافية لاختبار F1. على الرغم من أن مستحضرات بوغ تختلف في التركيز والعدوى ، إلا أن الجرعة الأبوية المناسبة عادة ما تكون بين 5-15 ميكرولتر من إعداد بوغ (~ 2.5 مليون جراثيم) لكل صفيحة 10 سم.
  4. دوامة لفترة وجيزة لخلط وطبق 1 مل أعلاه من الديدان على لوحة NGM غير المزروعة 10 سم. قم بالتدوير لضمان انتشار السائل على اللوحة بأكملها.
  5. جفف الألواح في خزانة نظيفة مع إيقاف الأغطية لمدة 10-20 دقيقة أو حتى تجف تماما ، قبل احتضانها عند 21 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  6. في الساعة 72 بعد الإصابة (hpi) ، اغسل الديدان من الألواح في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام 1 مل من وسائط M9. إذا بقيت العديد من الديدان على الألواح ، فقم بتكسير الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 1400 × g لمدة 30 ثانية ، وقم بإزالة supernatant ، وقم بإجراء عمليات غسيل إضافية للصفيحة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 1400 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لديدان الكريات ، اغسل 2x ب 1 مل من وسائط M9 أو حتى يصبح السوبرنات واضحا. أعد التعليق في مجلد نهائي من 1 مل من وسائط M9.
  8. ماصة لأعلى ولأسفل للخلط ، ثم نقل 100 ميكرولتر من الديدان العالقة إلى أنبوب جديد.
    ملاحظة: يمكن لاحقا إصلاح هذه العينة المكونة من حوالي 250 شخصا بالغا وتلوينها لتحديد لياقة الدودة الأبوية وحالة العدوى، كما هو موضح في الخطوة 7 وبداية الخطوة 3.
  9. لفتح الديدان البالغة وإطلاق أجنة F1 للاختبار ، قم بتبييض 900 ميكرولتر المتبقية من الديدان المعلقة ، كما هو موضح في الخطوة 3.
    ملاحظة: تدمر هذه الخطوة أيضا أي جراثيم N. parisii قبل فحوصات العدوى اللاحقة.

6. اختبار المناعة الموروثة ضد N. parisii في C. elegans

  1. قم بإجراء العدوى كما هو موضح في الخطوات 5.1.-5.6.، مع إجراء تعديلات كما هو مذكور أدناه.
    ملاحظة: يمكن تقليل مقايسات العدوى على F1s وإجراؤها على ألواح NGM مقاس 6 سم باستخدام ~ 1000 ديدان L1 و 400 ميكرولتر من 10x OP50-1. يجب أيضا استخدام جرعة "عالية" من الجراثيم ، بحيث يصاب ~ 100٪ من F1s الساذجة (أي الديدان من الآباء غير المصابين) ، وفقط ~ 10٪ من F1s الساذجة محببة. على الرغم من أن مستحضرات البوغ تختلف في التركيز والعدوى ، إلا أن الجرعة المناسبة تتراوح عادة بين 5-15 ميكرولتر (~ 2.5 مليون جراثيم) لكل صفيحة 6 سم.
  2. عند 72 حصانا، قم بالإصلاح والبقع لتحديد لياقة الدودة وحالة العدوى، كما هو موضح في الخطوة 7.

7. DY96 تلطيخ C. elegans لتصور الأجنة وجراثيم microsporidia

ملاحظة: DY96 عبارة عن صبغة فلورسنت خضراء ملزمة بالكيتين تلطخ أجنة الدودة وجدران بوغ microsporidia19،15،25. هذا يسمح بالمراقبة المتزامنة للياقة البدنية وحالة العدوى للديدان.

  1. اغسل الديدان من الألواح في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام 1 مل من وسائط M9 التي تحتوي على 0.1٪ Tween-20. إذا بقيت العديد من الديدان على الألواح ، فقم بتكسير الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 1400 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة supernatant باستخدام طرف ماصة ، وقم بإجراء عمليات غسيل إضافية للصفيحة.
  2. جهاز طرد مركزي عند 1400 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكسير الديدان ، وغسل 2x مع 1 مل من وسائط M9 التي تحتوي على 0.1٪ Tween-20 أو حتى يصبح supernatant واضحا.
  3. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأضف 700 ميكرولتر من الأسيتون واترك الديدان لتثبيتها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الديدان عند -20 درجة مئوية للمعالجة بعد عدة أشهر ، إذا رغبت في ذلك.
  4. جهاز طرد مركزي عند 10000 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان الثابتة ، وغسل 2x مع 1 مل من PBS يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (PBST).
  5. تحضير 50 مل من محلول العمل DY96: PBST ، 0.1٪ (v / v) كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، و 20 ميكروغرام / مل DY96 (من محلول مخزون 5 ملغ / مل في الماء المقطر) (انظر جدول المواد). لف الأنبوب بورق القصدير وخزنه في درج لمنع التعرض للضوء.
    ملاحظة: يمكن تخزين مخزون DY96 وحلول العمل لمدة >1 سنة في درجة حرارة الغرفة إذا تم الاحتفاظ بها في الظلام.
  6. جهاز طرد مركزي عند 10000 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان وإزالة supernatant. أضف 500 ميكرولتر من محلول العمل DY96 إلى الكريات وقم بالتدوير لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. جهاز طرد مركزي عند 10000 × g لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لتكوير الديدان. قم بإزالة supernatant وإضافة 15 ميكرولتر من وسط التركيب مع / بدون DAPI (انظر جدول المواد).
  8. ماصة 10 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على ديدان ملطخة على شريحة المجهر ووضع غطاء فوق القمة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح والعينات الإضافية عند 4 درجات مئوية في الظلام للتخزين على المدى الطويل.

8. تصوير وتحليل الديدان الملطخة ب DY96 لتقييم لياقة الدودة وحالة العدوى

  1. لتحليل الديدان الملطخة ب DY96 (المثبتة على الشرائح ، كما هو الحال في الخطوة 7.8.) ، قم بإجراء التصوير باستخدام قناة GFP للمجهر الفلوري.
  2. لتحديد مدى ملاءمة مجموعات الديدان ، استخدم هدفا 5x أو 10x لفحص جاذبية >100 دودة لكل حالة.
    ملاحظة: تعتبر الديدان التي تحمل جنينا ≥1 محبوصة. يمكن أن تساعد عدادات الخلايا الميكانيكية في تقليل الخطأ البشري عند العد. أجنة الدودة أقل تلطيخا (أقل فلورسنت) من جراثيم ميكروسبوريديا19. الأجنة بيضاوية ، ~ 50 ميكرومتر × ~ 30 ميكرومتر ، وتوجد في منتصف الجسم من البالغين C. elegans الأصحاء. يحمل البالغون الأصحاء غير المصابين 10-20 جنينا منظما في صفوف على طول الجسم26.
  3. للكشف عن اختلافات أكثر دقة في اللياقة البدنية ، قم بإجراء تعداد الأجنة. لهذا ، قم بحساب عدد الأجنة يدويا في 20-30 دودة فردية لكل حالة.
  4. لتحديد مدى إصابة مجموعات الديدان ، استخدم هدفا 5x-40x لتقييم حالة العدوى >100 دودة لكل حالة. تعتبر الديدان التي تضم أي عدد من جراثيم الأمعاء داخل الخلايا مصابة.
    ملاحظة: جراثيم ميكروسبوريديا أكثر إشراقا من أجنة الدودة. الجراثيم على شكل حبة من N. parisii هي ~ 2.2 ميكرومتر × ~ 0.8 ميكرومتر ويتم إنتاجها في الخلايا المعوية للدودة من ~ 48 hpi15. لا تعتبر الديدان التي تظهر فيها الجراثيم حصريا في تجويف الأمعاء وليس على طول جدران الأمعاء مصابة19. وذلك لأن هذه الجراثيم من المحتمل أن تمثل جراثيم تم تناولها حديثا ولا تنتج عن إصابة الفرد.
  5. باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) ، حدد عبء الطفيلي وحجم الدودة باتباع الخطوات أدناه.
    1. صورة 20-30 ديدان مثبتة على شرائح المجهر باستخدام مجسمة مستقيمة فلورسنت لكل عينة. التقط الصور في قنوات Brightfield و DAPI و GFP. اختر تعرضا مناسبا في قناة GFP بحيث لا يكون التألق في العينات الأكثر إصابة مشبعا.
      ملاحظة: لا يزال من الممكن تصور العدوى في العينات الأقل إصابة. عادة ما يتم التقاط الصور باستخدام هدف 5x.
    2. افتح الملفات في FIJI/ImageJ. اعتمادا على نوع الملف، قد تكون هناك حاجة إلى المكون الإضافي Bio-Formats Importer لفتح الصور في ImageJ.
    3. حدد 20-30 ديدان فردية في الصور باستخدام صور brightfield أو DAPI وأداة تحديد المضلع في شريط الأدوات . احفظ كل مخطط تفصيلي باستخدام أدوات تحليل > > إدارة مناطق الاهتمام (ROI) في القائمة المنسدلة بالنقر فوق إضافة [t]. حدد الحيوانات المرئية بالكامل في الإطار.
      ملاحظة: يمكن إعادة النظر في المخططات التفصيلية للفيروس المتنقل لاحقا عن طريق حفظ الملف مع المخططات التفصيلية كملف Tiff.
    4. انقر فوق إلغاء التحديد في مدير عائد الاستثمار لإزالة جميع الخطوط العريضة من الصورة وانقر فوق صورة > مكررة في القائمة المنسدلة. اكتب الرقم المقابل لقناة الاهتمام في مربع "القنوات" لتكرار قناة GFP لعبء الطفيلي (على سبيل المثال، 2).
    5. عتبة هذه القناة باستخدام الصورة > ضبط عتبة > إلى مستوى يتم فيه التقاط عبء الطفيلي الساطع ولكن التألق الباهت من أجنة الدودة ليس كذلك ، ثم انقر فوق تطبيق. لاحظ قيم العتبة المطبقة واستخدمها باستمرار لجميع صور التجربة نفسها.
      ملاحظة: تحقق من أن العتبة هي قيمة مناسبة لكل من العينات الأقل والأكثر إصابة قبل تحليل كافة الصور.
    6. حدد تحليل > تعيين القياسات وحدد المربع الخاص بكسر المساحة. حدد الخطوط العريضة للدودة المفردة بدورها من مدير عائد الاستثمار وانقر على وظيفة تحليل > القياس. ستوفر نافذة النتائج قياسا للمساحة المئوية (أي عبء الطفيليات ٪).
      ملاحظة: إذا كان التألق من الأجنة ساطعا لدرجة أنه يتجاوز العتبة، يمكن استخدام أداة فرشاة الطلاء باللون الأسود في شريط الأدوات لمسح هذه المناطق يدويا قبل قياس ٪Area.
    7. لتحديد حجم الدودة كقراءة للياقة البدنية، قم بتخطيط الديدان كما هو موضح في الخطوة 8.3. حدد تحليل > تعيين القياسات وحدد المربع الخاص بالمساحة. حدد الخطوط العريضة للدودة المفردة بدورها من مدير عائد الاستثمار وانقر على وظيفة تحليل > قياس . ستوفر نافذة النتائج قياس النسبة المئوية للمساحة.

9. فحص FISH لتقييم غزو C. elegans بواسطة microsporidia وإطلاق بوغ

ملاحظة: يتعرف مسبار MicroB FISH على منطقة محفوظة من الحمض النووي الريبوزي المرسال 18s ويمكن استخدامه لتسمية الجراثيم داخل الخلايا (أي الخلايا المضيفة الغازية) والمادة الوراثية داخل الجراثيم.

  1. إصابة 6000 ديدان L1 متزامنة مع 4 ملايين جراثيم من N. parisii و 10 ميكرولتر من 10x OP50-1 في حجم نهائي من 400 ميكرولتر يتكون من وسائط M9.
  2. يوضع الخليط على طبق NGM غير منزوع البذور بحجم 6 سم ، ويجف في خزانة نظيفة لمدة 10-20 دقيقة ، ويوضع على حرارة 21 درجة مئوية.
  3. بعد 30 دقيقة ، اغسل الحيوانات من الألواح باستخدام 1 مل من وسائط M9 التي تحتوي على 0.1٪ Tween-20.
  4. قم بتكوير الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 1400 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام طرف ماصة ، وأضف 700 ميكرولتر من الأسيتون ، واتركها تجلس لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الديدان عند -20 درجة مئوية للمعالجة في وقت لاحق.
  6. قم بإجراء فحص FISH بين عشية وضحاها باستخدام مسبار MicroB بعد التقارير المنشورة سابقا27,19.
    ملاحظة: لتقييم إطلاق البوغ ، استكمل المخزن المؤقت النهائي 500 ميكرولتر من الغسيل ب 20 ميكروغرام / مل من DY96 إلى العينات وقم بالتدوير لمدة 30 دقيقة عند 21 درجة مئوية قبل الاستمرار في البروتوكول كالمعتاد.
  7. قم بتخزين الشرائح في صندوق شرائح عند 4 درجات مئوية. للتخزين على المدى الطويل (أي عدة أشهر) ، قم بتخزين عينات إضافية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  8. لتقييم الغزو في الديدان الملطخة بالأسماك ، انظر إلى الديدان باستخدام القناة الحمراء للمجهر الفلوري. تصور أحداث العدوى عند التكبير العالي (هدف 63x) حيث أن L1 صغيرة ، وستكون sporoplasms في المراحل المبكرة من التكرار. لتقييم إطلاق البوغ ، استخدم هدفا 63x وقنوات التألق الحمراء والخضراء.
    ملاحظة: تعتبر الجراثيم التي تتعايش فيها إشارة GFP و mCherry غير مشتعلة؛ تعتبر حالات بوغ GFP الفارغة مطلقة.
  9. لفحص الغزو أو إطلاق البوغ ، قم بحساب عدد الأبواغ يدويا (بؤر mCherry في الخلايا المعوية) أو النسبة المئوية للجراثيم التي تم إطلاقها في 20-30 ديدان لكل حالة. اضبط التركيز البؤري في المستوى z لالتقاط جميع أحداث العدوى والجراثيم ، والتي غالبا ما توجد في مستويات مختلفة.
    ملاحظة: تم العثور على Sporoplasms حصريا داخل الخلايا المعوية. عادة ما يتم العثور على أعلى تركيز من sporoplasms مباشرة بعد البلعوم. إذا كانت العينات ملطخة أيضا ب DY96 ، فابحث عن وجود البلازما الجراثيمية التي لا تتعايش مع البوغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه الدراسة ، أصيب السكان الأبوون من C. elegans (P0) في مرحلة L1 بجرعة منخفضة من جراثيم N. parisii. عادة ما تستخدم حالات العدوى هذه للحصول على أعداد كبيرة من ذرية F1 المقاومة للميكروسبوريديا من خلال تبييض الوالدين. تم تثبيت السكان الأبوين المصابين والضوابط غير المصابة عند 72 hpi وملطخة ب DY96 لتصور أجنة الدودة وجراثيم microsporidia (الشكل 1A). الحيوانات المصابة صغيرة ، وتحتوي على العديد من جراثيم microsporidia ، وتنتج أجنة أقل من الضوابط الصحية غير المصابة. أظهر تقييم ج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول دراسة microsporidia والمناعة الموروثة في نموذج عدوى N. parisii -C. elegans بسيط وقابل للسحب وراثيا.

إعداد بوغ هو بروتوكول مكثف ينتج عادة ما يكفي من الجراثيم لمدة 6 أشهر من التجارب ، اعتمادا على الإنتاجية24. الأهم من ذلك ، يجب تحديد العدوى لكل "الكثير" بوغ جديد قبل استخدامه في التجارب. نظرا للتباين في العدوى بين مستحضرات البوغ ، يجب استخدام كمية واحدة باستمرار لجميع مرات تكرار التجربة. لا ينبغي إذابة الأليكوتات الفردية وإعادة تجميدها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لويني جاو وين تشن وان لتقديمهما تعليقات مفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (المنحة رقم 522691522691).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2.0 مم حبات زركونياBiospec Products Inc.11079124ZX
10 مل حقنةفيشر العلمي1482613
5 & مرشح mMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2مجهر Zeiss-Fluorescent لتصوير الديدان الملطخة ب DY96 و FISH على شرائح المجهر
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom MicroscopeZeiss-للتصويرالمباشر للحيوانات المعدلة وراثيا الفلورية لتصور IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean BenchBaker-
مزعج الخرزة ، Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor ، شريحةخلية T9FB893150الصناعية
فولت ، مقاييس الخلايا لعدد المنوية القابل للتصرف من الألفيةSciences Fisher ScientificDRM600
أصفر مباشر 96Sigma-AldrichS472409-1G
EverBrite Mounting Medium مع DAPIBiotium23001
EverBrite Mounting Medium بدون DAPIBiotium23002
Fiji / ImageJ SoftwareImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
الدوار الميكانيكيThermo Sceintific415110 / 1834090806873يستخدم لتدوير أنابيب الأجنة المبيضة لتفقيس MicroB
FISH ProbeBiosearch Technologies Inc.-تم تصنيعه مع تعديل Quasar 570 (Cy3) 5 'و HPLC منقى ، CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2من النوع البري ، سلالة بريستولالسلالة الافتراضيةمركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC)
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) محلولهيدروكسيد الصوديوم Sigma-AldrichL3771-100G
(5 N) محلولالصوديوم FLSS256500فيشر الكيميائي
(6٪ )فيشر كيماويكالSS290-1
Stemi 508 مجهر ستيريوزايس-للصيانة اليومية للديدان وعد الديدان L1 لإعداد الفحص
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500
العالمية 120 هيبوكلوريت

المراجع

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741(2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011(2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023(2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200(2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458(2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227(2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309(2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425(2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Nematocida parisii DY96

مقالات ذات صلة