مقالة منهجية

التصوير الجزيئي الحيوي للامتصاص الخلوي للجسيمات النانوية باستخدام المجهر البصري غير الخطي متعدد الوسائط

DOI:

10.3791/63637

⸱

مايو 16, 2022

 ,  ,  , 
1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة تكامل وحدة التركيز الطيفي وليزر النبض ثنائي الإخراج ، مما يتيح التصوير الطيفي السريع لجسيمات الذهب النانوية والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل التقنيات البصرية غير الخطية متعددة الوسائط على مجهر المسح الضوئي بالليزر القياسي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فحص جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) في الأنظمة الحية أمرا ضروريا للكشف عن التفاعل بين AuNPs والأنسجة البيولوجية. علاوة على ذلك ، من خلال دمج الإشارات الضوئية غير الخطية مثل تشتت رامان المحفز (SRS) ، والتألق المثار ثنائي الفوتون (TPEF) ، والامتصاص العابر (TA) في منصة التصوير ، يمكن استخدامه للكشف عن التباين الجزيئي الحيوي للهياكل الخلوية و AuNPs بطريقة متعددة الوسائط. تقدم هذه المقالة مجهرا ضوئيا غير خطي متعدد الوسائط وتطبقه لإجراء تصوير كيميائي محدد ل AuNPs في الخلايا السرطانية. توفر منصة التصوير هذه نهجا جديدا لتطوير AuNPs وظيفية أكثر كفاءة وتحديد ما إذا كانت داخل الأوعية الدموية المحيطة بالورم أو المساحات المحيطة بالخلية أو الخلوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت جسيمات الذهب النانوية (AuNPs) إمكانات كبيرة كمجسات تصوير متوافقة حيويا ، على سبيل المثال ، كركائز فعالة لمطيافية رامان (SERS) المحسنة سطحيا في مختلف التطبيقات الطبية الحيوية. تشمل التطبيقات الرئيسية مجالات مثل الاستشعار الحيوي والتصوير الحيوي والتحليل الطيفي المعزز للسطح والعلاج الحراري الضوئي لعلاج السرطان1. علاوة على ذلك ، يعد فحص AuNPs في الأنظمة الحية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وفهم التفاعل بين AuNPs والأنظمة البيولوجية. هناك العديد من التقنيات التحليلية ، بما في ذلك التحليل الطيفيللأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) 2 ، وقياس الطيف الكتلي المقترن بالحث بالاجتثاث بالليزر (LA-ICP-MS)3 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)4 التي تم استخدامها بنجاح للتحقيق في توزيع AuNPs في الأنسجة. ومع ذلك ، تعاني هذه الطرق من العديد من العيوب مثل كونها تستغرق وقتا طويلا وتتضمن تحضيرا معقداللعينة 3 ، أو تتطلب أوقات اكتساب طويلة ، أو عدم وجود دقة مكانية دون الميكرون 2,4.

بالمقارنة مع تقنيات التصوير التقليدية ، يوفر الفحص المجهري البصري غير الخطي العديد من المزايا لفحص الخلايا الحية و AuNPs: يحقق المجهر البصري غير الخطي عمق تصوير أعمق ويوفر قدرة التقسيم البصري 3D الجوهرية باستخدام الليزر فائق السرعة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء. مع التحسن الكبير في سرعة التصوير وحساسية الكشف ، تم إثبات مضان متحمس ثنائي الفوتون (TPEF) 5،6،7 والجيل التوافقي الثاني (SHG) 8،9،10 المجهري لزيادة تحسين التصوير غير الجراحي للجزيئات الحيوية الداخلية في الخلايا والأنسجة الحية. علاوة على ذلك ، باستخدام تقنيات بصرية غير خطية جديدة لمسبار المضخة مثل الامتصاص العابر (TA) 11،12،13،14 وتشتت رامان المحفز (SRS) 15،16،17،18 ، من الممكن اشتقاق تباين كيميائي حيوي خال من الملصقات للهياكل الخلوية و AuNPs. يعد تصور AuNPs دون استخدام الملصقات الخارجية ذا أهمية كبيرة لأن الاضطرابات الكيميائية للجسيمات النانوية ستعدل خصائصها الفيزيائية وبالتالي امتصاصها في الخلايا.

يقدم هذا البروتوكول تنفيذ وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) لليزر النبضي ثنائي الطول الموجي ، مما يتيح التصوير السريع متعدد الوسائط ل AuNPs والخلايا السرطانية. يهدف هذا العمل إلى إظهار تفاصيل تقنيات TPEF و TA و SRS المتكاملة على مجهر المسح بالليزر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تشغيل نظام الليزر

  1. قم بتشغيل نظام التعشيق وحدد ليزر الذراع قبل بدء تشغيل النظام.
  2. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر باستخدام البرنامج للتحكم في ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج.
  3. قم بتحميل البرنامج لليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج ؛ يتيح هذا البرنامج تشغيل الليزر وإيقاف تشغيله ويتحكم مباشرة في الطول الموجي لحزمة المضخة.
  4. قم بتشغيل انبعاث الليزر عن طريق الضغط باستمرار على أيقونة الطاقة للعد 3.
  5. انتظر حتى يسخن الليزر ويضيء الضوء الجاهز بالليزر باللون الأخضر في البرنامج.
  6. يتم التحكم في الطول الموجي لحزمة المضخة مباشرة من خلال البرنامج ؛ يمكن أن يتراوح هذا من 680-1300 نانومتر. للتصوير الخلوي في منطقة اهتزاز C-H Raman ، حدد 802 نانومتر.
  7. افتح مصاريع شعاع المضخة القابل للضبط وشعاع Stokes 1,045 نانومتر عن طريق الضغط باستمرار على صور الفتحة لمدة 3 ثوان.
    تنبيه: إرشادات السلامة بالليزر ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج هو ليزر نابض بالأشعة تحت الحمراء من الفئة الرابعة ويمكن أن يتسبب في تلف دائم للبصر. لذلك ، يجب اتباع جميع القواعد المحلية لسلامة الليزر أثناء تنفيذ هذا الإجراء: (i) يمكن فقط للمستخدمين المصرح لهم الذين تلقوا تدريبا على سلامة الليزر تنفيذ الإجراء. (ii) يتم الدخول إلى المختبر عن طريق الوصول إلى البطاقة الممغنطة مع قفل على باب الغرفة. (iii) بالنسبة لمعظم العملية ، تكون أشعة الليزر مغلقة بالكامل. (iv) عند تعرض شعاع الليزر ، يجب ارتداء نظارات واقية من الليزر (استخدم نظارات السلامة بالليزر LG9 ، والتي توفر OD 7+ حجبا لكل من المضخة وحزم Stokes).

2. تشغيل وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU)

  1. قم بتحميل برنامج ATM على نفس جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج الليزر ، الذي يتحكم في مراحل التأخير وموهنات الليزر في وحدة SF-TRU.
    ملاحظة: هذه الوحدة مسؤولة عن التأكد من تداخل المضخة وعوارض ستوكس مكانيا ، والتحكم في التشتت في المضخة وعوارض ستوكس ، والتحكم في التأخير الزمني بين المضخة وعوارض ستوكس. استقطاب كل من المضخة وعوارض ستوكس عمودي. لاحظ أن كل شعاع مجهز بلوحة نصف موجة للتحكم بشكل مستقل في الاستقطابات قبل الخروج من SF-TRU.
  2. تأكد من تخفيف كل من المضخة وليزر ستوكس إلى <10٪ (مضخة) و <15٪ (أشعة ستوكس). إذا لم يتم تخفيف الحزم ، يمكن أن تتسبب طاقة الليزر في تلف النظام وستحرق العينات البيولوجية.
  3. بالنسبة للتصوير الخلوي ، اضبط إعدادات الليزر المثلى على 6٪ (مضخة) و 10٪ (ستوكس) ، أي ما يعادل 12 ميجاوات و 30 ميجاوات في العينة.
  4. يحتوي SF-TRU على إعدادين: وضع الفيمتو ثانية (fs) ووضع بيكو ثانية (ps).
  5. بالنسبة لوضع fs ، ادفع المقابض على جانبي الصندوق (وهذا يزيل حواجز شبكية التشتت من مسار الشعاع).
  6. بالنسبة لوضع ps ، اسحب المقابض الموجودة على جانبي الصندوق (وهذا يضع حواجز شبكية التشتت في مسار الشعاع).
  7. للتصوير فوق الطيفي، حدد وضع ps.
  8. تأكد من أن مرحلة التأخير في الموضع الصحيح للمضخة وحزم ستوكس لتكون متداخلة مؤقتا لتصوير C-H على هذا النظام.
  9. تأكد من صحة إعدادات تشتت المضخة وشعاع ستوكس ؛ بالنسبة لمضخة 802 نانومتر ، يكون هذا 5 مم لشعاع المضخة و 30 مم لشعاع Stokes.

3. تعديل شعاع ستوكس لتصوير SRS

  1. للكشف عن SRS ، قم بتعديل شدة شعاع Stokes.
  2. قم بتشغيل مولد الإشارة لتعديل الحزمة.
  3. أذكر الإعدادات السابقة ، وهي كما يلي:
    المخرج 1: موجة مربعة: التردد = 19.5 ميجا هرتز ، السعة = 1.4 فولت.
    الناتج 2: الموجة المربعة: التردد = 19.5 ميجا هرتز ، السعة = 300 مللي فولت.
  4. قم بتشغيل المخرجات 1 و 2.
  5. قم بتوصيل الإخراج 1 بمكبر صوت ل EOM في صندوق SF-TRU عبر كابل BNC.
  6. قم بتوصيل المخرج 2 بمضخم القفل المستخدم للكشف عن SRS عبر كابل BNC.
  7. قم بتشغيل مصدر الطاقة لمكبر الصوت على القنطرة.

4. تشغيل مكبر الصوت المقفل

  1. لتصوير SRS ، استخدم وحدة الكشف SRS التي تشتمل على صمام ثنائي ضوئي كبير المساحة ومضخم قفل مصمم لهذا الغرض.
  2. قم بتشغيل مصدر الطاقة إلى مكبر الصوت المقفل على القنطرة.
  3. قم بتحميل البرنامج لمكبر الصوت المقفل "وحدة اكتشاف SRS" على جهاز الكمبيوتر.
  4. في البرنامج ، اختر الإعدادات التالية: المرحلة = 0 درجة ، الإزاحة = -80 ميغاواط ، الكسب = 58 ديسيبل.
  5. حدد ثابت وقت تكامل مكبر الصوت المقفل في البرنامج: بالنسبة للتصوير الخلوي ، فإن ثابت الوقت البالغ 2 μs يعطي صورا عالية الجودة.

5. تعمل على مجهر المسح الضوئي بالليزر

  1. قم بتشغيل مقابس جميع المعدات باستثناء صندوق التحكم عن بعد. انتظر حتى يضيء وضع الاستعداد في صندوق التحكم الموجود أعلى القنطرة.
  2. قم بتشغيل صندوق التحكم عن بعد على القنطرة وقم بتشغيل الجزء الخلفي من الصندوق. انتظر حتى يتحول ضوء جهاز التحكم عن بعد إلى اللون الأزرق (في مربع التحكم) ، واضغط على بدء التشغيل.
  3. قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بمجهر المسح بالليزر.
  4. قم بتشغيل برنامج المجهر متحد البؤر.
  5. تحقق من مسار ضوء المجهر عبر برنامج الكمبيوتر.
    ملاحظة: تم إجراء بعض التعديلات على المجهر لجعله مناسبا لتصوير SRS: (i) في مسار الشعاع ، تمت إضافة ممر قصير 775 نانومتر إلى عجلة المرشح حيث تدخل أشعة الليزر إلى وحدة المسح ، ويمكن تحديد ذلك في علامة التبويب Lightpath في برنامج الكمبيوتر. (ii) بدلا من استخدام PMTs المدمجة في المجهر متحد البؤر للكشف ، تمت إضافة كاشف مفصل إلى مسار الضوء المرسل ، والذي يسمح باكتشاف كل من SRS و CARS. (iii) يتم توصيل المخرجات من هذه الكواشف بالصندوق التناظري على القنطرة. يتم توصيل إشارة CARS من PMT عبر كابل BNC ب CD1 ويتم توصيل إشارة SRS من مضخم القفل عبر كابل BNC ب CD2.
  6. تحكم في التركيز من خلال شاشة اللمس أو مقابض التحكم عن بعد أو برنامج الكمبيوتر.
  7. حدد إعدادات الصورة المطلوبة في البرنامج ؛ يتضمن ذلك التكبير / التصغير وحجم الصورة بالبكسل ووقت بقاء البكسل.
  8. تأكد من أن سرعة التصوير (وقت السكون بالبكسل) أكبر من وقت التكامل المحدد في برنامج مضخم صوت القفل.
    ملاحظة: تم استخدام هدف الغمر في الماء NA 1.2 للتصوير.

6. تركيب عينة في مرحلة المجهر

  1. تحضير عينات الخلية للتصوير على النحو التالي.
    1. زراعة خلايا سرطان الثدي للفأر 4T1 في RPMI-1640 تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS). تغيير الوسط كل 2 أيام وتمرير الخلايا في التقاء 70٪ -80٪.
      ملاحظة: تم استخدام المقاطع 8-10 طوال التجارب الموصوفة هنا.
    2. لتجارب التصوير ، احتضان 1 × 10 5 خلايا على أغطية مربعة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ،5 ٪ CO2. بعد ذلك ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واحتضانه بجسيمات الذهب النانوية (تخفيف 1: 100 في وسط زراعة الخلية ، تركيز المخزون: 2.3 ×10 10 جسيمات / مل ، القطر: 60 نانومتر) لمدة 4 ساعات.
    3. قبل التصوير ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج وقم بإصلاحها بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا باستخدام PBS 3x ، ثم قم بالتركيب بين غطاءين للتصوير.
  2. ضع قطرة من الماء المقطر فوق هدف الغمر في الماء الذي يركز أشعة الليزر في العينة بين الهدف والعينة. ثم ضع العينة على مرحلة المجهر.
  3. يجمع المكثف مع NA 1.4 الضوء المنتشر إلى الأمام. ضع قطرة ماء بين المكثف والعينة للتصوير. اضبط ارتفاع المكثف على حوالي 1 مم فوق العينة لجمع أكبر قدر ممكن من الضوء.
  4. كاشف SRS موجود على حامل متحرك ، مما يسمح بانزلاقه للداخل والخارج من المسار البصري للمجموعة. من أجل التركيز على العينة باستخدام الضوء الأبيض ، حرك كاشف SRS خارج مسار الحزمة.
  5. ضع الكاشف مرة أخرى في مسار الحزمة ، جاهزا لتصوير SRS.

7. تغيير إزاحة رامان وجمع مكدس بيانات فائق الطيفية

ملاحظة: يعتمد تحول رامان الذي يحدث فيه التصوير على موضع مرحلة التأخير في صندوق SF-TRU والطول الموجي لشعاع المضخة من نظام الليزر.

  1. للتغييرات الكبيرة في إزاحة رامان ، قم بتغيير الطول الموجي لليزر. على سبيل المثال ، لتصوير اهتزازات CH بين 2,800-3,100 سم -1 ، حدد 802 نانومتر ، بينما ، للتصوير حوالي 1,600 سم -1 لذروة الأميد I ، حدد شعاع المضخة عند 898 نانومتر. اضبط هذا عبر البرنامج.
  2. لتحقيق تعديلات صغيرة في إزاحة Raman ، قم بمسح مرحلة التأخير في وحدة SF-TRU.
  3. يعطي SF-TRU مواضع مرحلة التأخير بالمليمترات (مم). لتحويل موضع مرحلة التأخير من مم إلى سم-1 ، قم بإجراء مسح المعايرة الطيفي باستخدام عينة من حبات البوليسترين وقارن مواضع الذروة الموجودة في مسح المعايرة مع تلك المأخوذة في إعداد رامان التلقائي. سيوفر هذا معادلة خطية ، والتي تحول موضع مرحلة التأخير بالملليمتر إلى إزاحة رامان في سم -1.
  4. لإنشاء مسح فائق الطيفية ، التقط سلسلة زمنية من الصور في مواضع مختلفة لمرحلة التأخير.
  5. لمزامنة الحصول على الصور وحركة مرحلة التأخير ، استخدم الوحدة التناظرية لإرسال واستقبال إشارات TTL من وإلى نظام SF-TRU.
    ملاحظة: للقيام بذلك ، يحتوي المربع التناظري على التوصيلات التالية: (i) TRIG OUT VD1 - يتم توصيله ب SF-TRU عبر BNC ويرسل إشارة TTL لإخبار مرحلة التأخير بتحريك زيادة +1. (ii) TRIG في 1 - هنا ، يتم استقبال إشارة عبر BNC عندما تنتهي مرحلة التأخير من حركتها ، ويستخدم هذا لتشغيل الصورة التالية في السلسلة الزمنية.
  6. بالنسبة لمجموعة البيانات الطيفية ، حدد الإعدادات التالية في برنامج المجهر متحد البؤر:
    1. في علامة التبويب المشغل ، حدد البدء بمشغل TTL (تشغيل) والمشغل (كل إطار).
    2. في علامة التبويب سلسلة، قم بتعيين تشغيل السلسلة الزمنية وإيقاف تشغيل السلسلة z.
    3. قم بتعيين عدد الإطارات في السلسلة الزمنية لمطابقة عدد الخطوات في برنامج ATM (يتم استخدام 101 خطوة هنا).
  7. في برنامج ATM ، انتقل إلى علامة التبويب تشغيل .
    1. اضبط مواضع مرحلة التأخير بالمليمترات لبدء وإيقاف المسح الطيفي. بالنسبة لمنطقة الرقم الموجي العالي CH ، استخدم موضع البدء = 90.25 مم وموضع التوقف = 92.25 مم.
    2. تأكد من أن عدد الخطوات يطابق عدد الإطارات في برنامج المجهر متحد البؤر.
  8. بعد التحقق من الإعدادات الصحيحة ، ابدأ تشغيل المكدس الطيفي في برنامج المجهر متحد البؤر أولا. انتقل إلى اكتساب وانقر فوق بدء المسح الضوئي. ثم ، في برنامج ATM ، انقر فوق ابدأ. يؤدي هذا إلى بدء جمع سلسلة من الصور ، مع زيادات تدريجية في موضع مرحلة التأخير بين مواضع البدء والإيقاف المحددة
  9. قم بتصدير سلسلة الصور الطيفية كملف .tif متعدد الإطارات واستخدم حزمة برامج مناسبة لإجراء المعايرة.
  10. بمجرد اكتمال المعايرة، استخدم معادلة المعايرة الخطية لتحويل موضع مرحلة التأخير إلى إزاحات رامان.
  11. للتبديل بين التصوير في المنطقة الاهتزازية CH (2800-3100 سم -1) إلى منطقة أميد I الاهتزازية 1500-1700 سم -1) ، قم بما يلي.
    1. قم بتغيير الطول الموجي للمضخة في برنامج الليزر من 802 نانومتر إلى 898 نانومتر.
    2. قم بتغيير إعداد تشتت Stokes في برنامج ATM من 30 مم إلى 5 مم.
    3. قم بإجراء تعديل بسيط على المرآة في مسار تشتت شعاع المضخة داخل صندوق SF-TRU. يتم ذلك عن طريق ضبط المقبض السفلي على حامل المرآة ، والذي يغير زاوية المرآة بمقدار متزايد.
    4. عند إجراء مسح فائق الطيفية فوق منطقة amide I ، اضبط مواضع البدء والإيقاف في برنامج ATM على 89 و 91 مم ، على التوالي
      تنبيه: يجب ارتداء نظارات واقية من الليزر لهذه الخطوة حيث سيتم الكشف عن شعاع الليزر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم وحدة توقيت التركيز الطيفي وإعادة التركيب (SF-TRU) بين ليزر الفيمتو ثانية ثنائي الإخراج ومجهر المسح الضوئي بالليزر المعدل. يحتوي نظام الليزر فائق السرعة القابل للضبط المستخدم في هذه الدراسة على منفذي إخراج يوفران شعاعا واحدا بطول موجي ثابت يبلغ 1045 نانومتر والحزمة الأخرى قابلة للضبط في نطاق 680-1300 نانومتر. تم تصوير مخطط تفصيلي لوحدة SF-TRU ومنصة التصوير متعدد الوسائط في الشكل 1. يتم استخدام SF-TRU لزقزقة حزمتي ليزر فيمتو ثانية إلى نبضات بيكو ثانية ويتداخل مع حزمتين مكانيا وزمانيا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمت هذه الدراسة مزيجا من وحدة SF-TRU ونظام الليزر ثنائي الإخراج فائق السرعة الذي أظهر تطبيقاته في التحليل الطيفي متعدد الوسائط. بفضل قدرتها على التحقيق في امتصاص الخلايا السرطانية لجسيمات الذهب النانوية (AuNPs) ، يمكن لمنصة التصوير متعدد الوسائط تصور الاستجابات الخلوية لعلاجات السرطان شديدة الحرارة عندما تمتص AuNPs أشعة الليزر.

علاوة على ذلك ، يتم تحقيق تصوير سريع محدد كيميائيا ودقة طيفية عالية من خلال استخدام تقنية التركيز الطيفي ، باستخدام مجموعتين من أزواج الشبكة للتحكم في الزقزقة في كل شع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل منح EPSRC: Raman Notheranostics (EP / R020965 / 1) ومرفق CONTRAST (EP / S009957 / 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدة الكشف عن APE SRSAPE (Angewandte Physik & amp Elektronik GmbH)لوحدة قفل APEيحتوي على صمام ثنائي ضوئي Si بمساحة كبيرة للكشف عن شعاع المضخة جنبا إلى جنب مع مضخم قفل للكشف عن تعديلات الشعاع
المسح متحد البؤرOlympusFV 3000وحدة المسح متحد البؤر المستخدمة لتصوير
حبات اللاتكس CML ، 4٪ وزن / حجم ، 1.0 وميكرو ؛ mInvitrogenC37483كريات مجهرية من البوليسترين
CoverslipsThorlabsCG15CH222 مم × 22 مم أغطية لخلايا البذر
FBSGibco10500-064مصل بقري الجنين (معطل حراريا)
المجهر المسح الضوئي بالليزرFlouviewOlympusFV31S-SW
وظيفة مولدBX الدقة40543تستخدم لتوليد وظيفة الموجة المربعة التي يتم تغذيتها إلى EOM في SF-TRU لإنتاج تعديلات في شعاع ستوكس
الجسيمات النانوية للذهبNanopartzA11-60جسيمات الذهب الكروية النانوية ، بقطر 60 نانومتر
واجهة إخراج الإدخالOlympusFV30 ANALOGتسمح هذه الوحدة بإدخال قراءات الجهد من PMT و LockIn في برنامج المسح متحد البؤر وتسمح بإرسال نبضات التوقيت بين مجهر أوليمبوس و SF-TRU وحدة.
InSight X3NewportSpectra-Physicsليزر نبضي مزدوج الإخراج فيمتو ثانية. قابل للضبط (680 – 1300 نانومتر) ومخرجات ليزر ثابتة (1045 نانومتر) بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز.
إطار المجهرأوليمبوسIX83مجهر مقلوب
فأر 4T1 خلاياATCCCRL-2539خلايا سرطان الثدي للفأر
NA 1.2 الغمر في الماءالهدف أوليمبوسUPLSAPO60XW / الأشعة تحت الحمراءالهدف متعدد الفوتون 60x لديه مسافة عمل 0.28 مم. يمكن استخدام أهداف أخرى مماثلة.
NA 1.4 مكثفنيكونCSC1003يمكن أيضا استخدام مكثفات أخرى ذات NA أعلى من هدف الإثارة.
PMTHamamatsuR3896PMT يستخدم للكشف عن الصور المضادة للستوك لموصل PMT المجهري CARS
موصلHamamatsuC13654-01-Y002
لإمدادات الطاقةRSRSPD-3303 Cطاقة قابل للبرمجة يستخدم لتوفير الجهد الصحيح ل PMT
RPMI-1640GibcoA10491-01منذ ذلك الحين تم العثور على معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 Medium مناسبا لمجموعة متنوعة من خلايا الثدييات.
SF-TRUنيوبورت نيوبورت فيزياء الأطيافSF-TRUمصمم للتحكم في التأخير الزمني وتشتت مخرجات الليزر 2 ولإجراء تعديلات الشعاع المطلوبة ل SRS
نظام مدمج وحدة برنامج التحكم في PMT مصدر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1903441(2020).
  2. Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
  3. Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
  4. Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), Deerfield Beach, Fla. 5049-5056 (2015).
  5. Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), Weinheim, Baden-Württemberg, Germany. 1801735(2019).
  6. Wang, C. -C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034(2009).
  7. Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
  8. Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
  9. Wang, C. -C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702(2010).
  10. Li, F. -C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
  11. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
  12. Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
  13. Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
  14. Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Wang, C. -C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108(2018).
  17. Wang, C. -C., Yoong, F. -Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928(2017).
  18. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  19. Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980(2018).
  20. Wang, C. -C., Wu, R. -J., Lin, S. -J., Chen, Y. -F., Dong, C. -Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706(2010).
  21. Wang, C. -C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329(2015).
  22. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  23. Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283(2022).
  24. Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
  25. Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Gold NanoparticlesNonlinear Optical MicroscopyStimulated Raman ScatteringTwo Photon FluorescenceTransient AbsorptionMultimodal ImagingCancer CellsCellular UptakeHyperspectral ImagingMolecular Imaging

مقالات ذات صلة