Method Article

اختبار محسن للسحب أحادي الجزيء لتحديد كمية فسفرة البروتين

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إعداد العينات وتحليل البيانات لتحديد كمية فسفرة البروتين باستخدام فحص محسن للسحب أحادي الجزيء (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفسفرة هي تعديل ضروري بعد الترجمة ينظم وظيفة البروتين ويوجه نتائج إشارات الخلايا. لا يمكن للطرق الحالية لقياس فسفرة البروتين الحفاظ على عدم التجانس في الفسفرة عبر البروتينات الفردية. تم تطوير اختبار السحب أحادي الجزيء (SiMPull) للتحقيق في تكوين المجمعات الجزيئية الكبيرة عن طريق الترسيب المناعي للبروتينات على غطاء زجاجي متبوعا بتصوير جزيء واحد. التقنية الحالية هي تكيف مع SiMPull يوفر تقديرا كميا قويا لحالة الفسفرة لمستقبلات الغشاء كاملة الطول على مستوى الجزيء الواحد. يسمح تصوير الآلاف من المستقبلات الفردية بهذه الطريقة بتحديد أنماط فسفرة البروتين. يفصل البروتوكول الحالي إجراء SiMPull الأمثل ، من إعداد العينات إلى التصوير. إن تحسين إعداد الزجاج وبروتوكولات تثبيت الأجسام المضادة يزيد من تحسين جودة البيانات. يوفر البروتوكول الحالي رمزا لتحليل بيانات الجزيء الواحد الذي يحسب جزء المستقبلات المفسفرة داخل العينة. بينما يركز هذا العمل على فسفرة مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) ، يمكن تعميم البروتوكول على مستقبلات الغشاء الأخرى وجزيئات الإشارات الخلوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم ضبط الإشارات المرتبطة بالغشاء عن طريق مزيج من تنشيط مستقبلات الغشاء التي يسببها الليغاند وتوظيف البروتينات الملحقة في المصب التي تنشر الإشارة. الفسفرة من التيروزين الرئيسية في ذيول السيتوبلازم المستقبلات أمر بالغ الأهمية لبدء تشكيل مجمعات الإشارات ، أو السيلوسومات 1,2. لذلك ، فإن السؤال المهم في علم الأحياء هو كيف يتم إنشاء أنماط الفسفرة والحفاظ عليها لتجنيد شركاء الإشارات وإملاء النتائج الخلوية. ويشمل ذلك فهم عدم تجانس فسفرة المستقبلات ، سواء في الوفرة أو في أنماط الفوسفوتيروزين المحددة التي يمكن أن توفر وسيلة للتلاعب بمخرجات الإشارات عن طريق إملاء تكوين الإشارة3،....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد غطاء

ملاحظة: في هذه الخطوة ، يحتاج المرء إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) ، والتي تشمل طبقة مزدوجة من قفازات النتريل ، ونظارات السلامة أو درع الوجه ، ومعطف المختبر.

  1. أداء حفر البيرانا لإزالة الحطام العضوي من الزجاج.
    تحذير: محلول البيرانا هو عامل مؤكسد قوي قابل للتآكل وشديد التفاعل عند ملامسته للمواد العضوية. التفاعل مع الحطام العضوي طارد للحرارة ويحتمل أن يكون متفجرا. وبالتالي ، يجب تنفيذ الإجراء في غطاء دخان كيميائي مع خفض الوشاح. مطلوب الأواني الزجاجية Pyrex للتعامل مع محلول البيرانا.
    1. قم بإعداد مساحة العمل داخل غطاء الدخان الكيميائي. رتب الأغطية دون تداخل في الجزء السفلي من كوب زجاجي سعة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر الرسم الكاريكاتوري الذي يصور عملية SiMPull في الشكل 1A. يتم تشغيل Coverslips باستخدام NeutrAvidin كمرساة للأجسام المضادة المضادة ل EGFR البيوتينيل لالتقاط EGFR-GFP من إجمالي تحلل البروتين. بعد غسل البروتين غير المرتبط ، يتم وضع علامة على المستقبلات المفسفرة بجسم مضاد مضاد للفوسفوتيروزين (anti-PY)15. ويبين الشكل 1 باء صورة للمصفوفة الكارهة للماء، حيث يمكن إعداد عينات متعددة وتصويرها على نفس الغطاء. إحدى مزايا حامل العينة هذا هي أن الح.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين البروتوكول الموصوف هنا لتمكين القياسات الكمية لفسفرة المستقبلات على مستوى البروتين الواحد. تم تطوير العديد من التعديلات المباشرة ولكنها مهمة على بروتوكول SiMPull التي حسنت موثوقية القياس للكشف عن الفوسفو التيروزين ، بما في ذلك الحد من التألق الذاتي مع علاج NaBH4 وما بعد تثبيت العينة لمنع تفكك الأجسام المضادة. إن استخدام قناع القناة الخضراء لتحديد مواقع المستقبلات لحساب التوطين المشترك مع الجسم المضاد ل PY يحسن أيضا دقة القياس عن طريق إزالة القطع الأثرية المحتملة من الارتباط غير المحدد للجسم المضاد بتح.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R35GM126934 و R01AI153617 و R01CA248166 إلى DSL. تم دعم هيئة إدارة الانتخابات من خلال برنامج ASERT-IRACDA (NIH K12GM088021) و JAR من قبل برنامج UNM MARC (NIH 2T34GM008751-20). نحن نقر بامتنان باستخدام المورد المشترك للفحص المجهري الفلوري لمركز السرطان الشامل بجامعة نيو مكسيكو ، بدعم من NIH P30CA118100. نود أن نعترف بالدكتورين أنكور جاين وتايكيجيب ها ، اللذين ألهم تطويرهما الأصلي ل SiMPull هذا العمل.
ES-C الكلمة الحالية: مجموعة الديناميكا المناعية ، مختبر المناعة التكاملية للسرطان ، مركز أبحاث السرطان ، المعهد الوطني للسرطان ، بيثيسدا

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقMTC BioC2000
10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.4
10 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 8.0 / 50 ملي كلوريد الصوديومT50 العازلة
100 مم طبق زراعة الأنسجةCELLTREAT229620تخزين زجاج / صفائف سمكة البيرانا
15 مل أنبوب
الشكل 16٪ بارافورمالدهيد مائي حلولعلوم المجهر الإلكتروني15710أنبوب
مخروطيتخزين زجاجي وظيفي / إعادة استخدام KOH
50 ملي مولار Tris-HCl درجة الحموضة 7.2 / 150 ملي مولارمكون عازلة تحلل
60 مم طبق ثقافةالأنسجة كورنينج
8٪ محلول مائي جلوتارالديهايدعلوم المجهر الإلكتروني16020
(C3< / sub>H6< / sub>O)Millipore Sigma270725الخطرة
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
المؤتلف البشري الخالي منPEPROTECHAF-100-15
EGFR المضاد للإنسان (المجال الخارجي) &ndash ؛ BiotinLeinco Technologies، IncE101
الأجسام المضادة المضادة ل p-Tyr (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bath-sonicatorBranson1200
BCA Protein AssayKit بيرس23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA ، MW 5,000
ألبومينمصل البقرالتكنولوجيا الحيوية الذهبيةA-420-1Tyrode's Buffer Component
Buchner قمع
بنسن الموقد
كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer
Component Cell ScraperBioworld30900017-1
قارورة الترشيح المخروطيةفيشر ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II عداد الخلايا الآليThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Coverslips 24 × 60 # 1.5علوم المجهر الإلكتروني63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
كاميرا emCCDAndor iXon
مصل الأبقار الجنيني ، برنامج OptimaBio-TechneS12450Hالمعطلة بالحرارة
Fusion 360Autodesk
Geneticin G418 DisulfateCaisson Labs G030-5GM
حمض الخليك الجليدي (CH3< / sub>COOH)JT BakerJTB-9526-01الخطرة
الماصات المصلية الزجاجية
التحريك
الزجاجي الجلوكوز (D- (+) - الجلوكوز)Millipore SigmaD9434المكون العازل Tyrode
الفوسفوتاز وكوكتيل مثبط البروتياز (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysis Buffer Component
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrodeالمكون العازل
حمض الهيدروكلوريك (HCl)VWRBDH7204-1
بيروكسيد الهيدروجين الخطير (H2< / sub>O2< / sub>) (3٪)HX0645
بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>) (30٪)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Lysis Buffer Component
ImmEdge مختبرات ناقلات الحاجز الكارهة للماءH-4000
Immersol 518F زيت الغمرZeiss444960-0000-000
خط
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-164
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2< / sub>-6H 2< / sub>O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox ، وصندوق أدوات الحوسبة المتوازية ، وصندوق أدوات الإحصاء والتعلم الآلي
(CH3< / sub>OH) IBISScientificMX0486-1
مياهMilli-Q الخطرة
وضع العلامات على الأجسام المضادة لصبغ CF Mix-n-StainBiotium92245مجموعة الاقتران المقترحة
mPEGLaysan BiomPEG-succinimidyl valerate ، MW 5,000
N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilaneUCT United ChemicalA0700
Dangerous NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin بروتين ملزمThermo Fisher Scientific31000
نيتروجين (غاز مضغوط)NVIDIA
GPU مع CUDAابحث عن التوافق في https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MicroscopeOlympus
Parafilm M Sealing FilmThe Lab DepotHS234526C
PBS درجة الحموضة 7.4Caisson LabsPBL06
PC-200 لوحة ساخنة تناظريةCorning6795-200
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) ثيرموفيشر Scientific15140-163
مستقبلات Phospho-EGF (Tyr1068) (1H12)إشارات خليةmAb 2236BF
كلوريد البوتاسيوم (KCl)Millipore Sigma529552هيدروكسيد البوتاسيوم المكون العازل من Tyrode
(KOH)Millipore Sigma1050330500
خيوط جيش التحرير الشعبى الصينى الخطرة ، قطر 1.75 ممرفع 3DPMS: 2035U / RAL: 3028نطاق درجة حرارة الطباعة: 205-235 درجة ؛ طابعة C
Pro2 ثلاثية الأبعادرفع 3D
Pyrex 1 L دورق
PYREX زجاجات تخزين 100 مل Corning1395-100CH3< / sub>OH / C3< / sub>H6< / sub>O إعادة استخدام
أكواب
دورق Pyrex 4 L دورق
رباعي العرض الموزعQV2
أجهزة الطرد المركزي المبردةEppendorfEP-5415R
عدادات الخلايا RevCount ، شرائح عد الخلايا EVEVWR10027-446
مرشحات انبعاث Semrock: أزرق (445/45 نانومتر) ، أخضر (525/45 نانومتر) ، أحمر (600/37 نانومتر) ، أحمر بعيد (685/40 نانومتر)SemrockLF405 / 488/561 / 635-4X4M-B-000
وحدة تحكم ماصة مصلية
الماصات
تحليل الجزيء الفردي
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>)Sigma AldrichS6014
بوروهيدريد الصوديوم الخطير (NaBH4< / sub>)ميليبور سيجما452874تيرود s المكون العازل
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)Millipore SigmaS9625تنشيطه بالحرارة المتتالية ودورة الأس الهيدروجيني
هيدروكسيد الصوديومVWRBDH3247-1
أورثوفانادات الصوديوم (Na 3< / sub>VO4< / sub>)Millipore SigmaS6508
حامض الكبريتيك الخطير (H2< / sub>SO4< / sub>)Millipore Sigma258105الكريات المجهرية الخطرة
TetraSpeckThermo Fisher ScientificT7279حبات متعددة الفلورسنت
قاعدة تريس (Trizma)Millipore SigmaT1503
Trypan Blue stain ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0.05٪Thermo Fisher Scientific25300120
مخروطي خطير 50 مل كلوريد الصوديوم 430166 الأسيتون الخطير برنامج قضيب وقف فراغ داخلي مجموعات : تقنية الفأر Pyrex 250 مل الموديل المصليةتضرب حزمة https://github.com/LidkeLab/smite.git

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Related Articles