يتم عرض ومناقشة تشكيل حزم أكتوميوزين في المختبر وقياس توليد قوة مجموعة الميوسين باستخدام ملاقط بصرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص ميكانيكا فرقة الميوسين في حزم خيوط الأكتين باستخدام ملاقط بصرية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميوسينات هي بروتينات حركية تحلل ATP لتخطو على طول مسارات خيوط الأكتين (AF) وهي ضرورية في العمليات الخلوية مثل الحركة وتقلص العضلات. لفهم آليات توليد القوة الخاصة بهم ، تم التحقيق في الميوسين II على مستوى الجزيء الواحد (SM) وكفرق من المحركات في المختبر باستخدام الطرق الفيزيائية الحيوية مثل الاصطياد البصري.
أظهرت هذه الدراسات أن سلوك توليد قوة الميوسين يمكن أن يختلف اختلافا كبيرا عند الانتقال من مستوى الجزيء الواحد في ترتيب ثلاثي الخرز إلى مجموعات من المحركات التي تعمل معا على خرزة صلبة أو سطح غطاء في ترتيب انزلاقي. ومع ذلك ، فإن إنشاءات الفحص هذه لا تسمح بتقييم ديناميكيات مجموعة الميوسين داخل التسلسل الهرمي الهيكلي اللزج المرن كما تفعل داخل الخلية. لقد طورنا طريقة باستخدام ملاقط بصرية للتحقيق في ميكانيكا توليد القوة بواسطة مجموعات الميوسين التي تتفاعل مع خيوط الأكتين المتعددة.
تسهل حزم الأكتوميوس هذه التحقيق في بيئة هرمية ومتوافقة تلتقط الاتصالات الحركية وإخراج قوة المجموعة. تسمح الطبيعة القابلة للتخصيص للفحص بتغيير الظروف التجريبية لفهم كيف تؤدي التعديلات على مجموعة الميوسين أو حزمة خيوط الأكتين أو البيئة المحيطة إلى مخرجات قوة مختلفة.
المقدمة
البروتينات الحركية ضرورية للحياة ، وتحويل الطاقة الكيميائية إلى عمل ميكانيكي1،2،3. تتفاعل محركات الميوسين مع خيوط الأكتين عن طريق اتخاذ خطوات على طول الخيوط المشابهة للمسار ، وتقوم ديناميكيات شبكات الأكتين الميوسين بتنفيذ تقلص العضلات ، وحركية الخلية ، وحلقة الانقباض أثناء الحركية الخلوية ، وحركة البضائع داخل الخلية ، من بين المهام الأساسية الأخرى3،4،5،6،7،8 . نظرا لأن الميوسين له....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. نقش أغطية
- قم بإذابة 100 غرام من KOH في 300 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ في كوب 1000 مل. يحرك المزيج بقضيب التحريك حتى تذوب غالبية KOH.
تنبيه: يمكن أن يسبب محلول KOH المركز حروقا وأضرارا للملابس. ارتداء القفازات وحماية العين ومعطف المختبر. - ضع الأغطية بشكل فردي في رفوف تنظيف الغطاء.
ملاحظة: تم تصميم الرفوف بشقوق تحمل أغطية مفردة متباعدة للسماح بالنقش والشطف على كل وجه من جوانب الغطاء ، وفتحات التصريف في القاع ، ومصنوعة من مواد يمكنها تحمل ظروف الحفر القاسية. يمكن أن تكون مصنوعة حسب الطلب أو شراؤها تجاريا. - قم بإعداد وتسمية ثلاثة أكواب سعة 1000 مل: واحدة مع 300 مل من الإيثانول واثنين من الأكواب مع 300 مل من ماء التناضح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تتميز خلايا التدفق التي تحتوي على أنظمة حزم الأكتوميوزين بتصميم قياسي ، وتتكون من شريحة مجهرية وغطاء محفور مفصول بقناة مصنوعة من شريط لاصق على الوجهين (الشكل 1). ثم يتم بناء الفحص من الغطاء إلى الأعلى باستخدام مقدمات مرحلية كما هو موضح في البروتوكول. يتكون الفحص النهائي من خيوط الأكتين الموسومة بالرودامين النموذجية. تركيز الميوسين المطلوب (تم استخدام 1 ميكرومتر للنتائج التمثيلية في الشكل 2 والشكل 3) ؛ البيوتينيل ، خيوط الأكتين اليكس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم إجراء دراسة في المختبر باستخدام ملاقط بصرية جنبا إلى جنب مع التصوير الفلوري للتحقيق في ديناميكيات مجموعات الميوسين التي تتفاعل مع خيوط الأكتين. تم تجميع حزم الأكتين-الميوسين-الأكتين باستخدام الميوسين العضلي الثاني، والأكتين الرودامين في الجزء السفلي من الحزمة وعلى سطح الغطاء، وخيوط الأكتين البيوتينيل ذات العلامات 488 في الجزء العلوي من الحزمة. تم بلمرة بروتين الأكتين من عضلة الأرانب وتثبيته باستخدام مخازن الأكتين العامة (GAB) ومخازن بلمرة الأكتين (APB). يجب إعداد GAB و APB طازجا كل يوم في المختبر باستخدام ATP.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.
شكر وتقدير
يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل زمالة أبحاث مجلس طلاب الدراسات العليا بجامعة ميسيسيبي (OA) ، وجامعة ميسيسيبي سالي ماكدونيل باركسديل مع مرتبة الشرف (JCW ، JER) ، واتحاد منح الفضاء في ميسيسيبي تحت رقم المنحة NNX15AH78H (JCW ، DNR) ، وجمعية القلب الأمريكية تحت رقم المنحة 848586 (DNR).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بروتين الأكتين (البيوتين): الهيكل العظمي للعضلات | الهيكل الخلوي | AB07-A | بروتين الأكتين البيوتينيل |
| بروتين الأكتين ، العضلات الهيكلية للأرانب | الهيكل الخلوي | AKL99-A | بروتين الأكتين |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | الأكتين و Alexa Fluor 488 وصمة عار |
| ATP | Fisher العلمية | BP413-25 | مطلوب للأكتين التجميع وحركية الميوسين |
| بيتا د-جلوكوز | فيشر | العلمي MP218069110 | جزء من نظام كسح الأكسجين المستخدم لتقليل التبييض الضوئي أثناء التصوير الفلوري |
| مانع درجة النشاف (الكازين) | Biorad | 1706404 | يستخدم لمنع السطح من الارتباط غير المحدد |
| CaCl2< / sub> | Fisher Scientific | C79500 | كلوريد الكالسيوم ، يوفر التحكم اللازم في ديناميكيات شبكة الأكتين ميوسين |
| كاتالاز | فيشر العلمي | ICN10040280 | جزء من نظام كسح الأكسجين المستخدم لتقليل التبييض الضوئي أثناء التصوير الفلوري |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544C | يستخدم لصنع خلايا التدفق |
| DTT | Fisher | العلمية AC327190010 | تستخدم لإعداد |
| العازلةالإيثانول | فيشر العلمي | A4094 | ريجنت المستخدمة لتنظيف أغطية |
| الجلوكوز أوكسيديز | فيشر العلمية | 34-538-610KU | جزء من نظام كسح الأكسجين المستخدم لتقليل التبييض الضوئي أثناء التصوير الفلوري |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | يستخدم لإعداد العازلة |
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | يستخدم لحفر الأغطية وضبطها الرقم الهيدروجيني العازل |
| MgCl 2< / sub> | Fisher Scientific | M33-500 | يستخدم لإعداد شرائح |
| المجهر | العازلة فيشر العلمي | 12-544-2 | يستخدم لصنع خلايا التدفق |
| بروتين الميوسين الثاني: عضلة الهيكل العظمي للأرانب | الهيكل الخلوي | MY02 | بروتين حركي الميوسين كامل الطول معزول من عضلة الهيكل العظمي للأرانب |
| Nanotracker2 | Bruker / JPK | NT2 | أداة الاصطياد البصري |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | مرافق التصاق خيوط الأكتين على السطح الزجاجي للغطاء |
| الخلوي | Rhodamine Phalloidin | PHDR1 | مثبت أكتين وبقع الفلورسنت الرودامين |
| حبات Streptavidin ، 1 & mu ؛ m | Spherotech | SVP-10-5 | مقبض الاصطياد البصري |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | PR H5121 | يستخدم لإعداد المخزن المؤقت |
المراجع
- Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
- Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
