يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم للغدة الثديية

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63674

⸱

يونيو 24, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تقنية سهلة للتصوير داخل الجسم للغدة الثديية للفأر المرضعة عن طريق المسح المجهري البؤري ومتعدد الفوتونات بالليزر.

الملخص

تشكل الغدة الثديية نموذجا بامتياز للتحقيق في الوظائف الظهارية ، بما في ذلك إعادة تشكيل الأنسجة وقطبية الخلية وآليات الإفراز. أثناء الحمل ، تتوسع الغدة من شجرة الأقنية البدائية المضمنة في وسادة دهنية إلى شبكة سنخية متفرعة للغاية مهيأة لتكوين وإفراز اللبأ والحليب. بعد الولادة ، توفر الغدة جميع العناصر الغذائية اللازمة لبقاء الأطفال حديثي الولادة ، بما في ذلك قطرات الدهون المغلفة بالغشاء (LDs) والبروتينات والكربوهيدرات والأيونات والماء. يتم تصنيع مكونات الحليب المختلفة ، بما في ذلك اللاكتوز ومذيلات الكازين وبروتينات الحليب الخالي من الدسم ، داخل الخلايا السنخية وتفرز من الحويصلات عن طريق الإخراج الخلوي على السطح القمي. يتم نقل LDs من مواقع التوليف في الشبكة الإندوبلازمية الخشنة إلى قمة الخلية ، مغلفة بأغشية خلوية ، وتفرز بواسطة آلية مفرزة فريدة. يتم نقل المكونات الأخرى مسبقة التشكيل ، بما في ذلك الأجسام المضادة والهرمونات ، من الجانب المصلي للظهارة إلى الحليب عن طريق نقل الخلايا. هذه العمليات قابلة للفحص المجهري داخل الجسم لأن الغدة الثديية هي غدة جلدية ، وبالتالي ، يمكن الوصول إليها مباشرة للتلاعب التجريبي. في هذه الورقة ، تم وصف إجراء سهل للتحقيق في حركية إفراز LD في الموقع ، في الوقت الفعلي ، في الفئران الحية المخدرة. يستخدم البورون ديبيروميثين (BODIPY) 665/676 أو أحادي البنتان لتسمية الجزء الدهني المحايد للفئران المعدلة وراثيا ، والتي إما تعبر عن EGFP القابل للذوبان (بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن) في السيتوبلازم ، أو الببتيد المستهدف بالغشاء المنصهر إما مع EGFP أو tdTomato. تعمل بروتينات الاندماج الموسومة بالغشاء كعلامات لأسطح الخلايا ، وتحلل الأصباغ الدهنية LDs ≥ 0.7 ميكرومتر. يمكن تسجيل صور الفاصل الزمني عن طريق الفحص المجهري القياسي للمسح بالليزر حتى عمق 15-25 ميكرومتر أو بواسطة المجهر متعدد الفوتونات للتصوير بشكل أعمق في الأنسجة. قد يتم غمر الغدة الثديية بالعوامل الدوائية أو الأصباغ الفلورية طوال الجراحة ، مما يوفر منصة للتلاعب التجريبي الحاد حسب الحاجة.

المقدمة

يجذب الفحص المجهري داخل الجسم للغدة الثديية للفأر اهتماما متزايدا كطريقة قوية لتحليل مجموعة كاملة من الظواهر البيولوجية ، بما في ذلك أصل وتمايز الخلايا الجذعية 1,2 ، وتطور الأورام النقيلية3،4،5 ، ودور الضامة الأقنية في جميع أنحاء تطور الثدي والتطور6. من خلال تطوير الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم (ISMic)7 ، تم توسيع نطاق التحقيقات لتشمل حركة مرور الغشاء وآليات الإفراز أثناء الرضاعة 8,9 ، والانقباض بوساطة الأوكسيتوسين للخلايا الظهاريةالعضلية 9,10. تم تطوير طريقتين رئيسيتين تستفيدان من إمكانية الوصول إلى الغدة بين الجلد وجدار الجسم.

في الطريقة الأولى ، يتم إدخال نافذة أكريليك أو زجاجية في الجلد وتثبيتها بحلقة تثبيت معدنية1،3،11. تتحمل الفئران الجراحة جيدا ، ويمكن تحليل الظواهر المختلفة على أساس متقطع في نفس على مدار عدة أسابيع. أثبتت هذه الطريقة أنها مفيدة بشكل خاص لتتبع النسب 1,12 ومراقبة غزو وتطور أورام الثدي في الموقع 3,11. ومع ذلك ، فقد ثبت أن الدقة تحت مستوى الخلية بأكملها صعبة لأن الغدة لا تزال متصلة بجدار الجسم وبالتالي فهي عرضة لآثار الحركة الناتجة عن التنفس ونبض القلب.

في النهج الثاني ، تتعرض الغدة جراحيا على رفرف جلدي مع الأوعية الدموية السليمة وتستقر على مرحلة المجهر مع الفواصل4،9،13. وبالتالي يتم فصل جزء من الغدة بشكل فعال عن جدار البطن ، ويتم تقليل القطع الأثرية الحركية. في معظم الحالات ، يتم وضع الحمة المكشوفة مباشرة على غطاء الغطاء مع الجانب البطني للفأر لأسفل على مجهر مقلوب. في تعديل حديث ، تم وضع الفأر مستلقا على مجهر مستقيم ، وكانت الغدة المكشوفة محمية في خلية مملوءة بالسوائل مختومة بغطاء2. يسمح هذا التكوين الأخير بالوصول إلى سطح متني للتلاعب التجريبي أثناء التصوير. تسمح الدقة التي تصل إلى <1 ميكرومتر ، في كلتا الحالتين ، بتحليل العمليات داخل الخلايا ، كما يتضح من تتبع قطرات الدهون (LDs) في الخلايا الظهارية الثديية9.

يفصل البروتوكول الحالي طريقة سهلة للتصوير داخل الجسم للخلايا الظهارية الثديية على المستوى دون الخلوي باستخدام التكوين الحيوي ونقل وإفراز LDs أثناء الرضاعة كمثال. ينطبق هذا النهج على نطاق واسع على العديد من العمليات الأخرى ، بما في ذلك نقل وإفراز بروتينات الحليب14 ، ونقل البروتينات من الجانب المصلي من الظهارة إلى التجويف السنخي15,16 ، وإعادة تشكيل الغدة أثناء الارتداد17,18.

تفضل الفئران التي تعبر عن بروتين الفلورسنت لمعظم التجارب داخل الحيوية لتسهيل اختيار المناطق المناسبة للتصوير وكعلامة مرجعية مورفولوجية. تتوفر مجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا والطرق المناسبة ، والتي تعبر عن علامات البروتين الفلوري في المقصورات الخلوية وعناصر الهيكل الخلوي والأغشية والعضيات19. في الأمثلة المقدمة ، تم استخدام فأرEGFP cyto FvB ، حيث يستهدف البروتين الفلوري الأخضر المعزز (EGFP) السيتوبلازم في معظم الخلايا20 (يشار إليه ب EGFPcyto) ، وفأر C57BL / 6J Tomato (mT / mG)21 ، وهو خط Cre فلوري مزدوج يشفر جينات tdTomato و EGFP. يتم تمكين تعبير EGFP من خلال الاستئصال بوساطة Cre لجين tdTomato . يستهدف أي من الفلوروفور غشاء البلازما في معظم الخلايا من خلال تسلسل مشتق من بروتين MARCKS21. في هذا العمل ، يشار إلى الفئران التي تعبر عن tdFluorophore الأحمر tdTomatomembr (mT) ، والفئران التي تعبر عن EGFP ، بعد استئصال جين tdTomato يشار إلى EGFPmembr (mG).

تحتوي الفئران على خمسة أزواج من الغدد الثديية على جانبي خط الوسط البطني ، ثلاثة في المنطقة الصدرية (مرقمة 1-3) واثنان في المنطقة الأربية (مرقمة 4-5) (الشكل 1 أ). بالنسبة ل ISMic ، فإن الغدد الأربية هي الأكثر سهولة وأسهل في الاستقرار ، لأنها أبعد ما تكون عن الحركات العالمية المرتبطة بالتنفس ونبضات القلب في الصدر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة لمركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة وفقا لدليل المجلس القومي الأمريكي للبحوث لرعاية واستخدام المختبر ، وسياسة خدمة الصحة العامة الأمريكية بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر ، ودليل رعاية واستخدام المختبر. لهذا العمل ، تم تحضير عدد 4 غدد من الفئران البدائية الإناث (الذين تتراوح أعمارهم بين 4-5 أشهر ، اليوم 10 من الرضاعة) جراحيا في وضع الاستلقاء الأيمن (الشكل 1 أ).

1. إعداد

  1. قم بوزن الماوس على ميزان التحميل العلوي لحساب كمية المخدر المطلوبة.
  2. أثناء وبعد تطبيق التخدير ، حافظ على درجة حرارة الجسم عن طريق وضع الماوس على وسادة الاحترار.
  3. تخدير الفأر عن طريق التعرض القصير للأيزوفلوران (3.0٪ -3.5٪) في غرفة التنفس المشبعة بالأكسجين (انظر جدول المواد) لمدة 1-2 دقيقة ، يليه حقن داخل الصفاق لمزيج من 100 مجم / كجم من الكيتامين و 10 مجم / كجم من الزيلازين.
  4. الحفاظ على تحت مستوى عميق من التخدير أثناء كل من الجراحة والتصوير عن طريق تطبيق جرعات معايرة من الزيلازين والكيتامين (نصف إلى ربع الجرعة الأولية الموضحة في الخطوة 1.3) من خلال قسطرة ساكنة (انظر الخطوة 3.4) كل 45 دقيقة أو نحو ذلك ، حسب الحاجة.
    ملاحظة: يتم الحفاظ على المستوى الأمثل للتخدير بسهولة عن طريق التحقق من ردود الفعل الجفن وإصبع القدم كل 10-20 دقيقة. درجة حرارة الفئران الواعية هي 36.5-38 درجة مئوية ، والتي تنخفض إلى 34.5 درجة مئوية تحت التخدير.
  5. عبر رعاية الجراء22 إذا توفرت الفئران المانحة في مرحلة مماثلة من الرضاعة ؛ خلاف ذلك ، القتل الرحيم القمامة.
    ملاحظة: يجب القتل الرحيم للجراء الذين تبلغ أعمارهم <10 أيام عن طريق التعرض ل 3.0٪ إيزوفلوران متبوعا بقطع الرأس. يجب القتل الرحيم للجراء الذين تبلغ أعمارهم ≥10 أيام عن طريق استنشاق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم.

2. إجراء الجراحة

  1. حافظ على دفء الفأر طوال الجراحة على وسادة التدفئة. حلق الفراء من الجلد المحيط بالغدد الثديية رقم 4 و 5 (مستلق ، الجانب الأيمن) باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية محمولة باليد. نظف المنطقة المحلوقة بثلاثة مقشرات بيتادين وكحول بالتناوب.
  2. امسح جميع الأدوات الجراحية بالكحول بنسبة 70٪. قم بعمل شق في منتصف الخط ~ 1 سم بالقرب من الحلمة الرابعة عن طريق قرص الجلد بملاقط وقطع الجلد المرتفع بمقص حاد. قم بعمل شقوق دائرية حول الغدة في كلا الاتجاهين القحفي والذيلي وقشر الجلد بعناية بعيدا عن البطن. حافظ على رطوبة الجلد المكشوف بالمحلول الملحي الفسيولوجي.
  3. لتقليل فقدان الدم ، أغلق أي أوعية دموية بارزة باستخدام جهاز كي محمول باليد (انظر جدول المواد) قبل قطعها. يجب إزالة أي دم خارجي على الفور باستخدام محلول ملحي فسيولوجي لتجنب فقدان الدقة البصرية لاحقا.
  4. قم بإزالة الأنسجة الضامة والدهنية السطحية عن طريق إغاظة الطبقة السطحية بلطف بملقط دقيق.
  5. حافظ على رطوبة الغدة المكشوفة بالمحلول الملحي الفسيولوجي واحم جدار البطن بالهلام وفيلم شبه شفاف ومرن ولدن بالحرارة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الخطوات 2.2-2.5 تخلق سديلة من الجلد مع جزء من الغدة والأوعية الدموية المرتبطة بها منفصلة عن جدار البطن (الشكل 1Bi-iv).
  6. إذا لزم الأمر ، عالج الغدة بعوامل خارجية ، على سبيل المثال ، العوامل الدوائية أو الأصباغ الخاصة بالعضيات ، عن طريق الاستحمام في الغدة المكشوفة أثناء الجراحة.
    ملاحظة: في الأمثلة المقدمة ، تم تمييز LDs في فأر EGFPcyto أو EGFPmembr (mG) ب 1.0 مل من البورون ثنائي بيروميثين (BODIPY) 665/676 (محلول مخزون 10 مللي متر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد مخفف من 1 إلى 1000 ضعف في محلول ملحي ويطبق لمدة <1 ساعة) وفي فأر tdTomatomembr (mT) أو EGFPmembr (mG) ، مع 0.5 مل من أحادي البنتان23 (محلول مخزون 0.1 متر في ثنائي ميثيل سلفوكسيد مخفف من 1 إلى 1000 ضعف في محلول ملحي ويوضع لمدة 5 دقائق).

3. إعداد التصوير

  1. ضع الماوس بعناية مع الجانب البطني لأسفل على مرحلة مجهر مقلوب ساخنة (37 درجة مئوية) ، بحيث تمتد رفرف الجلد على زجاج الغطاء المركزي (30 مم) (الشكل 1Biv). حماية المناطق المكشوفة بطبقة رقيقة من الجل.
  2. ثبت رفرف الجلد باستخدام فواصل مصنوعة خصيصا لحماية الغدة من آثار الحركة الناتجة عن التنفس ونبض القلب. لتحقيق ذلك ، ضع مباعدا مسنزا مصنوعا من ثلاثة أعواد قطنية مسجلة (الشكل 1Ci) بين رفرف الجلد وجدار الجسم وقم بربط الساق الخلفية والذيل بالمرحلة خلف الفاصل (الشكل 1Bv).
  3. امنع رفرف الجلد من الانزلاق أثناء التصوير عن طريق لصق غطاء بلاستيكي بإحكام (الشكل 1Cii) في أي من طرفي فتحة المسرح (الشكل 1Bv).
  4. أدخل قسطرة تحت الجلد تحت الجلد الظهري متصلة بأنبوب ومحقنة ومضخة (انظر جدول المواد).
  5. تأكد من أن سديلة الجلد مستقرة مع تدفق الدم الكافي عن طريق الفحص المجهري الفلوري التقليدي (الشكل 1Bvi).
  6. قم بتغطية الماوس بشاش إسفنجي (انظر جدول المواد) للتدفئة أثناء التصوير ،
    ملاحظة: الخطوات 3.1-3.5 هي الأكثر أهمية في ضمان الحصول على مقاطع فيديو عالية الدقة مناسبة للتحليل الكمي. لا جدوى من المضي قدما بعد هذه المرحلة ما لم يتم تأكيد استقرار الأنسجة.

4. الفحص المجهري

  1. بالنسبة للفحص المجهري التقليدي متحد البؤر لماوس EGFPcyto أو ماوس EGFPmembr (mG) المسمى BODIPY665/676 (الشكل 2 والفيديو 1 والفيديو 2) ، استخدم مجهرا مقلوبا مزودا بهدف غمر زيت مسخن مسبقا 60x ، يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
    1. الكشف بشكل منفصل عن EGFP و BODIPY665/676 باستخدام ليزر 488 و 633 ، على التوالي ؛ ل EGFP ، الإثارة 488 نانومتر ، والانبعاثات 560 نانومتر ، مع مرشح تمرير النطاق BA 505-605 ؛ ل BODIPY665/676 ، الإثارة 633 نانومتر والانبعاث 668 نانومتر ، مع مرشح تمرير النطاق BA 655-755.
    2. اجمع الصور عن طريق المسح الضوئي الخطي إما بمعدل 4 أو 8 ميكرو ثانية / بكسل (512 × 512 بكسل ؛ 12 بت لكل بكسل) كل 5 ثوان أو 10 ثوان لمدة 1-2 ساعة وقم بتخزينها كملفات TIFF. حافظ يدويا على المناطق الممسوحة ضوئيا في الإطار عن طريق تصحيح انحراف x/y طوال دورة التصوير. إنشاء صور 3-D من z-scans باستخدام البرامج المرتبطة بالمجهر (انظر جدول المواد).
  2. بالنسبة للفحص المجهري ثنائي الفوتون لماوس EGFPmembr (mG) المسمى بمونودانسيلبنتان (الشكل 3 ، الفيديو 3) ، استخدم مجهرا مقلوبا مزودا بليزر قابل للضبط وهدف 30x مسخن مسبقا 37 درجة مئوية (انظر جدول المواد).
    1. قم بإثارة الغدة عند 910 نانومتر واكتشف أحادي البنتان و EGFP باستخدام كاشفين GaAs ، باستخدام مرشحات تمرير النطاق 410-460 نانومتر و 495-540 نانومتر للانبعاثات الزرقاء والخضراء ، على التوالي.
    2. اجمع الصور عن طريق المسح الخطي بسرعة 2 ميكرو ثانية / بكسل (320 × 320 بكسل ؛ 16 بت لكل بكسل) وقم بتخزينها كملفات OIR. حافظ يدويا على المناطق الممسوحة ضوئيا داخل الإطار عن طريق تصحيح انحراف x/y طوال دورة التصوير. بناء صور 3-D من z-scans باستخدام البرامج المرتبطة المجهر.
  3. بالنسبة للفحص المجهري ثنائي الفوتون لفأر tdTomatomembr (mT) المسمى بمونودانسيلبنتان (الشكل 4 ، الفيديو 4) ، استخدم مجهرا مقلوبا مع ليزر قابل للضبط ، وهدف مسخن مسبقا 37 درجة مئوية 63x (انظر جدول المواد).
    1. قم بإثارة العينات عند 800 نانومتر و 1060 نانومتر في وقت واحد واكتشف أحادي البنتان باستخدام كاشف هجين HyD مضبوط عند الانبعاث 418-471 نانومتر و TdTomato مع كاشف هجين HyD آخر تم ضبطه عند الانبعاث 595-667 نانومتر.
    2. اجمع الصور عن طريق المسح الخطي بأربعة أسطر بمتوسط 200 هرتز (512 × 512 بكسل ؛ 12 بت لكل بكسل) وقم بتخزينها كملفات LIF. حافظ يدويا على المناطق الممسوحة ضوئيا داخل الإطار عن طريق تصحيح انحراف x/y طوال دورة التصوير. بناء صور 3-D من مسح z باستخدام البرامج المرتبطة بالمجهر.

5. القتل الرحيم

  1. القتل الرحيم للفئران في نهاية التصوير عن طريق استنشاق CO2 باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.

6. إنشاء مقاطع فيديو في الوقت الفعلي

  1. قم بتحويل التسلسلات الزمنية إلى ملفات TIFF ، ثم إلى مقاطع فيديو باستخدام البرامج المناسبة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: التحليل الكمي لمقاطع فيديو محددة خارج نطاق هذه الورقة وسيتطلب طرقا محددة لحل مشاكل محددة. على سبيل المثال ، انظر Ebrahim et al.24 لدور مجمعات الشعيات في الإخراج الخلوي للعاب من الغدة اللعابية ، Meyer et al.25 لديناميات إفراز الصفراء من الكبد ، و Masedunskas et al.9 لتحليل إفراز LD من الخلايا الظهارية الثديية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يفرز الحليب من الخلايا الظهارية السنخية المستقطبة ، والتي تتمايز أثناء الحمل عن براعم شجرة قنوية واسعة26 (الشكل 2 أ). يتم استيعاب السلائف لتخليق الحليب عبر الأغشية القاعدية / الجانبية ويتم إفراز المنتجات المكتملة عبر السطح القمي في "مساحة الحليب" المركزية. الجانب القاعدي لكل حويصلات هوائية مغطى بمجموعة نجمية من الخلايا الظهارية العضلية (الشكل 2 أ) ، والتي يتم حمايتها على الجانب المصلي بواسطة غشاء قاعدي (غير موضح في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعتمد استخدام مجهر واحد أو متعدد الفوتون على الأسئلة المطروحة ، وطبيعة وموقع الأنسجة المراد تصويرها ، والدقة المطلوبة. تعتمد المجاهر متعددة الفوتونات على توليد فوتونين أو أكثر من الفوتونات منخفضة الطاقة في الأشعة تحت الحمراء القريبة ، والتي يمكن أن تخترق الأنسجة إلى عمق أكبر مع سمية ضوئية أقل من مجاهر الفوتون الواحد29,30. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إثارة الفلوروفور فقط عند النقطة البؤرية ، مما يقلل من تشتت الضوء من الأنسجة المحيطة. ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أي من المؤلفين أي مصالح متضاربة للإعلان عنها.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون شيري راوش وسامري جبر (المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة) لإدارة ورعايتها وجيمس ماثر للمساعدة في إنتاج مجموعة من الفواصل البلاستيكية. تم دعم هذا البحث [جزئيا] من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
488 ليزرMelles-Griot-CW  ليزر 50 ميجاوات
60x هدف غمر زيت PLAPON (NA 1.42)Olympus1-U2B933عدسة مجهر متحد البؤر
633 ليزرMelles-Griot-CWHe-Ne ليزر 12 ميجاوات
63x الهدف (NA 1.40, HC PL APO CS2)عدسة 11506350 Leicaمجهر ثنائي الفوتون
BA 410-460 نانومتركروما-مرشح تمرير النطاق
BA 495-540 نانومترمرشح تمرير Chroma-Band-pass
BA 505-605 نانومترمرشح تمريرChroma-Band-pass
BA 655-755 نانومترتمرير Chroma-Band-pass
بورون-ثنائي البيروميثان (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932مستشعر بيروكسيد الدهون
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651
قسطرةTerumoSV27ELمجموعات التسريب المجنح 
الكي Braintree Scientific, IncGEM 5917نظام الكي
CMV-Cre الماوس  جاكسون مختبر006054خط الماوس
CoverslipBioptechs-30mmقطر غطاء للمجهر المقلوب
Curity 4x4 بوصة شاش إسفنجي لجميع الأغراضCovidien9024الإسفنج
EGFPcyto< / sub> ماوسجاكسونمختبر 003291خط الماوس
فيجي / ImageJ أداةمجانية
ملقط دقيقBraintree Scientific، IncFC003 8ملقط أنسجة
Fluoview 1000 مجهرأوليمبوسFV1000مجهر متحد البؤر
برنامج FluoViewمجهر أوليمبوسمتحد البؤر ومجهر ثنائي الفوتون
ماكينة حلاقة كهربائية محمولةباليد Braintree Scientific، IncCLP-8786-451Aمقص لاسلكي
وسادة حراريةBraintree Scientific، IncDPIPوسادة حرارية للحيوانات
كاشفات HyDLeica-Leica4Tune كاشف طيفي
ImarisBitplane / Oxford Instruments-أداةبرمجية تجارية
Ingisht X3 ليزر قابل للضبطSpectra PhysicsInsight X3للضبط نبض ليزر
IsofluraneVetOne13985-046-40الكيتامين المخدر
 VetOne13985-702-10التخدير
LAS X Softwareأداة برمجية المجهر
ماي-تاي ليزر قابل للضبطأطياف الفيزياءماي تايليزر
MetaMorphالأجهزة الجزيئية-أداة البرمجيات التجارية
Monodansylpentane AUTODOTAbceptaSm1000aصبغة قطرات الدهون
MPE-RS مجهرأوليمبوسIX70مجهر ثنائي الفوتون
mT / mG ماوسمختبر جاكسون007676خط الماوس
سخان موضوعيBioptechs150819سخان موضوعي لكل من المجاهر متحد البؤر وثنائي الفوتون
غرفة التنفس المشبعة بالأكسجينباترسون 78933385 العلمي، SAS3 و EVAC4نظام التخدير والإخلاء بالغاز   ؛
HS234526B بارافيلمهيثرو العلميكاشف PMT شبه شفاف ومرن ومصنوع من اللدائن
الحرارية Olympus-Descanned    كاشفات كاشف
PMTLSM-Technologyكاشفات غير ممسوحةضوئيا مصممة خصيصا
لجهازهارفارد703602 ، حاقن النانوميت 704402ووحدة تحكم
الملحيةالبيولوجية114-055-721EAمحلول ملحي عادي
مقص حادحاد Braintree Scientific ، IncSCT-S 508مقص
جراحيحقنةCovidien22-257-1501 مل حقنة توبركولين
TCS SP8 مجهر طيفيالغوص LeicaSP8مجهر ثنائي الفوتون
ملاقط  Braintree Scientific، IncFC032ملقط الأنسجة
Xylazine VetOne13985-704-10مخدر
مرشح جل برمجية مفتوحة المصدر برنامج قابل Leica-Two-Photon مضخة الجودة

المراجع

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Advances in Intravital Microscopy. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
  15. Monks, J., Neville, M. C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).
  16. Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).
  17. Green, K. A., Lund, L. R. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland. Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).
  18. Lund, L. R., et al. Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways. Development. 122 (1), 181-193 (1996).
  19. Abe, T., Fujimori, T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).
  20. Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).
  21. Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Fostering litters. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips# (2022).
  23. Yang, H. -J., Hsu, C. -L., Yang, J. -Y., Yang, W. -Y. Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging. PloS One. 7 (3), 32693(2012).
  24. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  25. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).
  26. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  27. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  28. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Enhanced diffusion in active intracellular transport. Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).
  29. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  30. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time. Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).
  31. So, P. T. C. Two-photon fluorescence light microscopy. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).
  32. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  33. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  34. Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig. Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).
  35. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  36. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 189 (4200), 347-358 (1975).
  37. Heald, C. W., Saacke, R. G. Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro. Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).
  38. Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).
  39. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  40. Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat. Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).
  41. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المجهر الحيويالتصوير دون الخلويإفراز القطيرات الدهنيةالمجهر البؤريمجهر الفوتونينالخلايا الظهارية الإفرازيةفئران EGFPالإفراز المفترزيالتصوير بفاصل زمني
الفحص المجهري تحت الخلوي داخل الجسم للغدة الثديية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.