مقالة منهجية

التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة

DOI:

10.3791/63679

⸱

مارس 31, 2022

 , 
1Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), The Hebrew University of Jerusalem

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وإزالة الأنسجة باستخدام طريقة CLARITY يجعل من الممكن التحقيق في وقت واحد في عدة أنواع من خلايا الدماغ وتفاعلاتها. يتيح نقل النواقل الفيروسية وضع علامات على أنواع الخلايا المتنوعة بألوان فلورية مختلفة داخل نفس الأنسجة. يمكن تحديد الخلايا وراثيا عن طريق النشاط أو الإسقاط. باستخدام بروتوكول CLARITY المعدل ، نما حجم العينة المحتملة للخلايا النجمية والخلايا العصبية بمقدار 2-3 أوامر من الحجم. يسمح استخدام CLARITY بتصوير الخلايا النجمية الكاملة ، والتي هي أكبر من أن تتناسب بالكامل مع شرائح ، وفحص somata بجميع عملياتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة للتحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية وأنواع الخلايا العصبية المختلفة ، أي عدد الخلايا العصبية الهرمية في كل مجال من مجالات الخلايا النجمية أو القرب بين الخلايا النجمية ومجموعات الخلايا العصبية المثبطة المحددة. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيفية تطبيق هذه الأساليب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، زادت معرفة وظيفة الخلايا النجمية وكيفية تفاعلها مع الدوائر العصبية بشكل كبير. يمكن للخلايا النجمية التأثير على اللدونة1,2 ، والمساعدة في استعادة الخلايا العصبية بعد الإصابة3,4 ، وحتى تحفيز التقوية العصبية الجديدة ، حيث أظهرت الدراسات الحديثة أهمية الخلايا النجمية في اكتساب الذاكرة ومكافأتها ، والتي كانت تعتبر سابقا وظائف عصبية بحتة 5,6,7 . ميزة ذات أهمية خاصة في أبحاث الخلايا النجمية هي الترتيب المكاني للخلايا ، والتي تحافظ على منظمات مكانية فريدة من نوعها في الحصين وهياكل الدماغ الأخرى8،9،10. على عكس التشعبات العصبية التي تتشابك بين سوماتا الخلية ، تعيش الخلايا النجمية الحصين في مناطق يمكن تمييزها بصريا مع تداخل طفيف بين عملياتها ، مما يخلق مجالات متميزة8،11،12،13. الأدلة التي تدعم مشاركة الخلايا النجمية في الدوائر العصبية لا تدعم عدم وجود وصف تشريحي مفصل لمثل هذه المجموعات والخلايا العصبية في مجالاتها14.

تم تعميم إجراءات نقل النواقل الفيروسية ، إلى جانب الحيوانات المعدلة وراثيا (TG) ، كمجموعة أدوات للتحقيق في هياكل الدماغ ووظائفه وتفاعلات الخلايا15,16. يسمح استخدام المروجين المختلفين باستهداف خلايا معينة وفقا لخصائصها الجينية أو مستويات التنشيط17,18 أو أهداف الإسقاط. يمكن للفيروسات المختلفة التعبير عن الفلوروفورات الملونة المختلفة في مجموعات سكانية مختلفة. يمكن الجمع بين الفيروس والتعبير الداخلي للفلوروفورات في TG ، أو يمكن استخدام TG دون الحاجة إلى الفيروسات. تستخدم هذه التقنيات على نطاق واسع لوضع العلامات العصبية ، وبدأت بعض المختبرات في استخدامها مع تعديلات متخصصة لاستهداف أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية5،9،19.

تمكن تقنية CLARITY ، التي تم وصفها لأول مرة في عام2013 20,21 ، من دراسة شرائح الدماغ السميكة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا مع ترك الهياكل المجهرية سليمة. من خلال الجمع بين الطريقتين - نقل النواقل الفيروسية وتطهير الأنسجة - يتوفر الآن خيار فحص التفاعلات المكانية بين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا. تم إجراء معظم دراسات التفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية على شرائح رقيقة من الدماغ ، مما أدى إلى صور للخلايا النجمية غير المكتملة بسبب مجالاتها الكبيرة ، مما أدى إلى تقييد عدد الخلايا التي تم تحليلها بشكل جذري. يسمح استخدام تقنية CLARITY بتوصيف دقة الخلية الواحدة لمجموعات الخلايا بكميات كبيرة في وقت واحد. لا يوفر تصوير مجموعات الخلايا الموسومة بالفلورسنت في أدمغة واضحة دقة متشابكة ولكنه يسمح بتوصيف شامل للتفاعلات المكانية بين الخلايا النجمية ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا العصبية.

لهذا السبب، قمنا بتسخير هذه التقنيات الحديثة للتحقيق في خصائص الخلايا النجمية في جميع أنحاء CA1 الظهرية، وتصوير جميع الصفيحات (Stratum Radiatum، الطبقة الهرمية، و Stratum Oriens). قمنا بقياس عشرات الآلاف من الخلايا النجمية (مع اختراق فيروسي بنسبة >96٪ 5) ، وبالتالي تحليل معلومات جميع سكان الخلايا النجمية حول CA1. مع الاختراق الفعال للعلامات العصبية ، يمكننا تسجيل التفاعلات بين جميع سكان الخلايا النجمية CA1 والأنواع الأربعة من الخلايا العصبية - بارفالبومين (PV) ، السوماتوستاتين (SST) ، الخلايا العصبية المثبطة VIP ، والخلايا الهرمية المثيرة9.

تم إجراء العديد من التجارب باستخدام مزيج من التألق من TG وناقلات فيروسية مختلفة الألوان (جميع الخلايا المثبطة) ، في حين استخدمت تجارب أخرى (مثيرة) ناقلين فيروسيين يعبران عن فلوروفورات مختلفة تحت مروجين مختلفين9. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا ، بما في ذلك وضع علامات على الخلايا المرغوبة في الدماغ ، مما يجعل الدماغ شفافا باستخدام إجراء CLARITY المعدل ، بالإضافة إلى تصوير وتحليل هياكل الدماغ الكاملة ، باستخدام العديد من الإجراءات والبرمجيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في الجامعة العبرية وتلبية المبادئ التوجيهية للدليل الوطني للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

1. نقل النواقل الفيروسية

ملاحظة: يستخدم نقل النواقل الفيروسية للتعبير عن الفلوروفورات في الدماغ.

  1. استخدم أطلسا (على سبيل المثال، أطلس ألين الدماغي) لتحديد موقع التنسيق ذي الصلة للمنطقة المستهدفة.
    ملاحظة: يمكن العثور على أطالس 3D عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer).
  2. باستخدام الجراحة التجسيمية ، حقن النواقل الفيروسية في بنية الدماغ ذات الصلة. انظر9 للحصول على بروتوكول مفصل.
  3. انتظر لمدة 3-6 أسابيع للتعبير عن الفلوروفور.
    ملاحظة: فترة زمنية قصيرة كافية إذا كانت هناك حاجة فقط إلى وضع علامة على أجسام الخلايا. ستكون هناك حاجة إلى فترة طويلة من الزمن إذا كانت الإسقاطات المحورية ذات صلة بالسؤال ، حيث يستغرق الأمر وقتا أطول حتى تعبر الفلوروفورات في محاور عصبية ، والتي يمكن أن يكون طولها عدة ملليمترات.
  4. التحقق من خصوصية واختراق التعبير الفلوروفوري (سواء من التعبير الفيروسي أو TG) مسبقا (الشكل 1A). قبل الشروع في إجراء CLARITY ، قم بتعيين دماغ واحد على الأقل للشرائح الرقيقة وتأكد من أن تعبير الفلوروفور قوي ومحدد لميزة الخلية المستهدفة.

2. الوضوح

ملاحظة: هذه الطريقة تجعل الدماغ شفافا في غضون 2-6 أسابيع.

  1. إجراء التروية عبر الجمجمة على الحيوانات باستخدام المياه المالحة الباردة العازلة بالفوسفات (PBS) تليها 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS. قم بإزالة الدماغ واحتفظ به في PFA بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في أنبوب 50 مل أو حاوية مماثلة.
    ملاحظة: قبل إجراء التروية عبر الجمجمة ، يجب تخدير الحيوان بعمق. في الأمثلة المقدمة في هذا البروتوكول ، تم تخدير جميع الحيوانات باستخدام الكيتامين والزيلازين (90٪ و 10٪ على التوالي).
  2. استبدل PFA بمحلول هيدروجيل (HS؛ انظر الجدول 1) لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا تسمح للمواد بأن تصبح أكثر دفئا من درجة حرارة التبريد (4-8 درجة مئوية) في هذه المرحلة ، أو أن الهيدروجيل سوف يتبلمر. يحتوي النظام المنسق المستخدم في هذا البروتوكول على 2٪ من الأكريلاميد ، على عكس البروتوكولات السابقة التي تشير إلى 4٪ 22 أو 1٪ 17. يتم تفصيل فائدة 2٪ في قسم المناقشة. عند تحضير النظام المنسق ، اعمل على سطح بارد مثلج. تخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. تفريغ الغاز
    ملاحظة: الغرض من هذه المرحلة هو إزالة جميع الأكسجين الحر من الأنسجة لأن O2 يتداخل مع عملية البلمرة. يمكن استخدام أي غاز غير O 2 (على سبيل المثال ، N 2 ، CO2) ؛ يوصى باستخدام N2.
    1. انقل N2 من الخزان عبر أنبوب مرن 5 مم (داخلي) ، متصل بإبرة 19 G في نهايتها (الشكل 1B).
    2. اصنع ثقبين صغيرين (بعرض الإبرة) في غطاء الأنبوب: أحدهما لإدخال الغاز والآخر للسماح للهواء بمغادرة الأنبوب (الشكل 1C).
    3. قم بتوصيل الأنبوب من غاز N2 بالأنبوب واستبدل الغازات لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. قم بإزالة الأنبوب وقم بإغلاق الثقوب على الفور باستخدام طين النمذجة على كل أنبوب (الشكل 1D).
  4. انقل الأنابيب المختومة المنزوعة الغاز إلى حمام 37 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة لبلمرة HS ، والتي ستصبح هلام. احرص على عدم هز الأنابيب (الشكل 1E).
  5. استخرج الدماغ من الأنبوب وقم بإزالة الجل المبلمر بلطف من حوله باستخدام مناديل المختبر. تأكد من عدم بقاء أي هلام متبقي ملتصقا بسطح الأنسجة، لأنه قد يتفاعل مع المحلول في الخطوات التالية، مما يثبط عملية إزالة الأنسجة (الشكل 1F).
    ملاحظة: نظرا لأن الجل يحتوي على PFA ، يجب أن يتم الاستخراج تحت غطاء الدخان.
  6. قم بتقطيع الدماغ إلى شرائح إذا كان السؤال المطروح لا يتطلب سوى جزء منه. قسمها إلى نصفين أو إلى شرائح سميكة جدا تحتوي على جميع مجالات الاهتمام (الشكل 1G).
  7. ضع الشرائح في محلول المقاصة الأول (CS1، انظر الجدول 2) في حاوية جديدة ورجها بسرعة 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  8. اتبع الخطوات الموضحة أدناه لنقل الدماغ من CS1 إلى حل المقاصة الثاني (CS2، انظر الجدول 2).
    1. قم بإعداد أنبوب مثقب للدماغ مقدما (الشكل 1H).
    2. سخني CS2 إلى 40-45 درجة مئوية في كوب كبير بما يكفي لاحتواء الأنبوب. افعل ذلك على صفيحة مع مقلب. تأكد من أن درجة الحرارة لا تصل إلى 55 درجة مئوية لمنع تبييض البروتينات المعبر عنها.
    3. ضع الكأس المملوء ب CS2 والأنبوب المثقب على جهاز تحريك (كوب سعة 2 لتر في الشكل 1I). اضبط معدل تحريك معتدل يتسبب في تدفق السائل دون تشويه الأنسجة.
      ملاحظة: في غضون 2-6 أسابيع ، ستصبح الأنسجة شفافة (تبدأ العملية في المحيط وتتحرك إلى الداخل نحو هياكل الدماغ المركزية). القرار بشأن متى تكون الأنسجة "واضحة بما فيه الكفاية" متروك للحكم الشخصي. يجب أن يكون الدماغ شفافا بما فيه الكفاية للتصوير تحت المجهر دون تدخل (الشكل 1J غير واضح بما فيه الكفاية; الشكل 1K واضح بما فيه الكفاية). تجاوز النقطة التي تكون فيها الأنسجة واضحة بما فيه الكفاية قد يسبب فقدان صلابة الأنسجة.
  9. نقل من CS2 إلى PBST (0.5٪ Triton X-100 في PBS ، انظر الجدول 2) في حاوية جديدة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف (70 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: في PBST ، ستصبح الأنسجة بيضاء (الشكل 1L). سيعود الوضوح (ويتحسن) عند تضمينه في حل مطابقة معامل الانكسار (RIMS، راجع الخطوة 2.14).
  10. يستعاض عن PBST ب PBST جديد. يحفظ تحت نفس الظروف (37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف) لمدة 24 ساعة أخرى.
  11. استبدل PBST مرة أخرى ب PBST جديد واحتفظ به في RT لمدة 24 ساعة.
  12. نقل إلى PBS في RT لمدة 24 ساعة.
  13. استبدل PBS واتركه في RT لمدة 24 ساعة إضافية.
  14. قم بإزالة الدماغ من PBS وانقله إلى RIMS عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: في البداية، قد تحيط التموجات في RIMS بالدماغ. وقد صمم هذا البروتوكول وتحقق من صحته باستخدام حافتين تجاريتين محددتين (انظر الجدول 3). ومع ذلك ، يجب ألا يختلف البروتوكول عند استخدام RIMS أخرى (تجارية أو ذاتية الصنع).
  15. احتفظ بالأنسجة في RT لمدة 24 ساعة أخرى أو حتى يصل المحلول إلى التوازن الكامل ، أي عندما يصبح النسيج شفافا ، ولم يعد المحلول يحتوي على أي تموجات مرئية (الشكل 1M).
  16. إذا كان النسيج شفافا ، فانتقل إلى إعداد الغرفة. إذا أصبح النسيج في هذه المرحلة أبيض بدلا من شفاف (بسبب تجمعات جزيئات SDS المتبقية) ، فقم بتنظيف العينة مرة أخرى عن طريق تكرار الخطوتين 2.9 و 2.10 ، ونقل الأنسجة إلى CS2 (الخطوة 2.8) لبضعة أيام ، تليها جميع الخطوات حتى الخطوة 2.15.

3. إعداد الغرفة

ملاحظة: تتطلب كل عينة شريحة بها غرفة تصوير يتم وضع العينة فيها.

  1. ضع العينة في منتصف الشريحة.
  2. باستخدام مسدس الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، تقريبا مثل الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة (حوالي 5 مم) في أحد الزوايا (الشكل 2A ، B).
  3. ضع 1-2 قطرات من RIMS على العينة للحفاظ على السطح العلوي رطبا ومنع تشكل الفقاعات بين الغطاء والأنسجة.
  4. مباشرة بعد تطبيق قطرات RIMS ، أضف الطبقة الأخيرة من الغراء الساخن إلى الجدران (بحيث تصل إلى ارتفاع الدماغ / الشريحة) وتقدم على الفور (بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا) إلى الخطوة 3.5.
  5. أغلق الجزء العلوي بغطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان على الجزء العلوي من طبقة الغراء الساخن التي لا تزال دافئة (الشكل 2C).
  6. املأ الغرفة بالحافات من خلال الفجوة المتبقية في جدران الغراء الساخن (الشكل 2D ، E).
  7. أغلق الفجوة بالغراء الساخن. لا تترك أي هواء في الداخل (الشكل 2F).
  8. إذا امتدت جدران الغراء الساخن خارج حدود الشريحة ، فقم بقطع الحواف الممتدة (الشكل 2G).
  9. إذا كان الهدف المستخدم للتصوير مغمورا ، فأضف 2-3 مم أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء بحيث يستمر محلول الغمر لفترة أطول (الشكل 2H).

4. التصوير (متحد البؤرة أو ثنائي الفوتون)

  1. تحقق مما إذا كانت المرحلة يمكن أن تحمل الغرفة ، حيث يمكن أن يصل سمك الغرفة إلى عدة ملليمترات.
    ملاحظة: على سبيل المثال، تم تجهيز المجهر البؤري (انظر جدول المواد) المستخدم في هذا البروتوكول بعدة مراحل (على سبيل المثال، دائري، مستطيل). أيا كانت المرحلة التي يتم اختيارها لعقد الغرفة لا أهمية لها طالما أن معلماتها تناسب أحجام الغرفة.
  2. اعمل بهدف بمسافة عمل كافية، أي مسافة عمل دنيا ≥3 مم، حيث قد تكون منطقة الدماغ ذات الأهمية بضعة ملليمترات في العمق، وقد لا يكون الغطاء مستقيما تماما كما تم وضعه يدويا.
    ملاحظة: كعرض توضيحي، تم الحصول على النتائج المعروضة في الشكل 1 والفيديو 1 والفيديو 2 تحت مجهر ثنائي الفوتون باستخدام هدف غمر مائي 16x مع مسافة عمل 3 مم وتكبير 2.4 للحصول على مجال رؤية 652 × 483 ميكرومتر ومكدس z مع فترات زمنية 0.937 ميكرومتر بين الطائرات.
  3. قم بإجراء تصوير متعدد المناطق ، والذي قد يستغرق بضع ساعات أو حتى أيام. تأكد من وجود مساحة تخزين مجانية وافرة في الكمبيوتر حيث يمكن أن يصل حجم كل صورة إلى عشرات جيجابت.
    ملاحظة: قد يؤدي التصوير الواضح إلى عمق مقاطع صور أكثر بكثير. لذلك ، يجب أن تكون الكثافات المستخدمة لالتقاط التعبير منخفضة نسبيا لمنع الإفراط في التعبير أثناء جمع الصورة.
  4. بالنسبة لأهداف الغمر ، تحقق من السائل بشكل روتيني أثناء التصوير واستكمله بسائل إضافي إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: أثناء تصوير البيانات المعروضة في الفيديو 3 ، تمت إضافة الماء إلى سطح الغرفة كل 6-8 ساعات لمكافحة التبخر.
  5. بعد الحصول على الصورة، قم بعرضها وتحليلها باستخدام العديد من حزم البرامج المختلفة.
    ملاحظة: تتضمن البرامج الموصى بها Imaris و SyGlass لكل من التصور والتحليل. تم وصف خط الأنابيب الدقيق لإعادة بناء الخلايا النجمية المثلى باستخدام برنامج Imaris سابقا9. باختصار ، كانت ميزات Imaris المستخدمة في هذه الدراسة عبارة عن خيوط لإعادة بناء هياكل الخلايا بالكامل والبقع لاستخراج الموقع في مساحة جميع somata.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي التطهير الناجح لشرائح أنسجة المخ السميكة إلى مجموعة جديدة من الأسئلة التي يمكن طرحها فيما يتعلق بخصائص مجموعات الخلايا الكبيرة بدلا من خصائص الخلايا المفردة أو المجموعات المجاورة من الخلايا. لتحقيق نتائج ناجحة ، يجب على المرء الالتزام الصارم ببروتوكول CLARITY ، حيث توجد مجموعة واسعة من المعلمات التي يجب مراعاتها لتقليل التباين بين العينات (على سبيل المثال ، النسبة المئوية للوضوح ، ومعلومات التألق ، ومعلمات التورم).

يصف الشكل 1 عملية المقاصة بأكملها من التحقق ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم طرق تطهير الأنسجة أداة ثورية في أبحاث الدماغ ، مما يدعو إلى أسئلة لم يكن من الممكن طرحها من قبل. من استهداف خصائص مجموعة صغيرة من الخلايا أو خلية واحدة أو حتى مشبك واحد ، يتيح CLARITY الآن استهداف إجمالي عدد الخلايا أو ميزات الاتصال بعيدة المدى باستخدام الفلوروفورات ذات الصلة.

نتيجة التعبير عن الفلوروفور والجمع بين إجراء الوضوح ليست ثنائية. قد تتداخل العديد من العوامل مع الإجراء مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل. أولا ، يجب التحقق من تعبير الفلوروفور مقدما. نظرا لأن إجراء CLARITY يسبب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 803589)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة ISF رقم 1815/18)، والمنح الكندية الإسرائيلية (CIHR-ISF، المنحة رقم 2591/18). نشكر نيشاما نوفيك على تعليقه على المخطوطة بأكملها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AAV1-GFAP :: TdTomatoELSC Vector Core Facility (EVCF)فيروسي يستخدم للكشف عن الخلايا النجمية
AAV5-CaMKII :: eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF)فيروسي يستخدم للكشف عن الخلايا العصبية
AAV5-CaMKII :: H2B-eGFPELSC Vector Core Facility (EVCF)الناقل الفيروسي المستخدم للكشف عن النوى العصبية
AAV5-CaMKII :: TdTomatoELSC مرفق ناقلات النواقل الأساسية (EVCF)ناقل فيروسي يستخدم للكشف عن الخلايا العصبية
أكريلاميد (40٪)Bio-rad# 161-0140
Bisacrylamide (2٪)Bio-rad# 161-0142
حمض البوريكسيجما#B7901الوزن الجزيئي - 61.83 جم / مول
مجهر متحد البؤر ، مسح ، هدف FV1000Olympus4x (UPlanSApo ، 0.16 NA)
برنامجImarisBitplane ، المملكة المتحدةبرنامج يسمح بتحليل ثلاثي الأبعاد للصور
NaOHSigma#S5881
PBS
PFA 4٪EMS# 15710
RapiClearSunJin lab#RC147002
RapiClear CSSunJin lab#RCCS002
SDSSigma#L3771
برنامجبرنامج يسمح بتحليل ثلاثي الأبعاد للصور باستخدام الواقع الافتراضي
Tris base 1 MBio-rad# 002009239100الوزن الجزيئي - 121.14 جم / مول
Triton X-100ChemCruz#sc-29112A
اثنين من المجهر الفوتونNeurolabwareTi: ليزر الياقوت (Chameleon Discovery TPC ، متماسك) ، أنابيب مضاعف الصور GaAsP (Hamamatsu ، H10770-40) ، مرشح ممر النطاق (Semrock) ، الغمر في الماء 16x الهدف (نيكون ، 0.8 NA)   ؛
VA-044 البادئواكو# 011-19365
ناقل ناقل SyGlass

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
  2. Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
  3. Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573(2021).
  4. Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
  5. Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
  6. Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
  7. Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
  8. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  9. Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
  10. Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915(2016).
  11. Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
  12. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
  13. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  14. Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  15. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
  16. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159(2005).
  17. Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
  18. DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
  19. Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  20. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  21. Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
  22. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CLARITY

مقالات ذات صلة