يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إن الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وإزالة الأنسجة باستخدام طريقة CLARITY يجعل من الممكن التحقيق في وقت واحد في عدة أنواع من خلايا الدماغ وتفاعلاتها. يتيح نقل النواقل الفيروسية وضع علامات على أنواع الخلايا المتنوعة بألوان فلورية مختلفة داخل نفس الأنسجة. يمكن تحديد الخلايا وراثيا عن طريق النشاط أو الإسقاط. باستخدام بروتوكول CLARITY المعدل ، نما حجم العينة المحتملة للخلايا النجمية والخلايا العصبية بمقدار 2-3 أوامر من الحجم. يسمح استخدام CLARITY بتصوير الخلايا النجمية الكاملة ، والتي هي أكبر من أن تتناسب بالكامل مع شرائح ، وفحص somata بجميع عملياتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة للتحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية وأنواع الخلايا العصبية المختلفة ، أي عدد الخلايا العصبية الهرمية في كل مجال من مجالات الخلايا النجمية أو القرب بين الخلايا النجمية ومجموعات الخلايا العصبية المثبطة المحددة. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيفية تطبيق هذه الأساليب.
المقدمة
في السنوات الأخيرة ، زادت معرفة وظيفة الخلايا النجمية وكيفية تفاعلها مع الدوائر العصبية بشكل كبير. يمكن للخلايا النجمية التأثير على اللدونة1,2 ، والمساعدة في استعادة الخلايا العصبية بعد الإصابة3,4 ، وحتى تحفيز التقوية العصبية الجديدة ، حيث أظهرت الدراسات الحديثة أهمية الخلايا النجمية في اكتساب الذاكرة ومكافأتها ، والتي كانت تعتبر سابقا وظائف عصبية بحتة 5,6,7 . ميزة ذات أهمية خاصة في أبحاث الخلايا النجمية هي الترتيب المكاني للخلايا ، والتي تحافظ على م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في الجامعة العبرية وتلبية المبادئ التوجيهية للدليل الوطني للصحة لرعاية واستخدام المختبر.
1. نقل النواقل الفيروسية
ملاحظة: يستخدم نقل النواقل الفيروسية للتعبير عن الفلوروفورات في الدماغ.
- استخدم أطلسا (على سبيل المثال، أطلس ألين الدماغي) لتحديد موقع التنسيق ذي الصلة للمنطقة المستهدفة.
ملاحظة: يمكن العثور على أطالس 3D عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - باستخدام الجراحة التجسيمية ، حقن النواقل الفيروسية في بنية الدماغ ذات الصلة. انظر9 ل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يؤدي التطهير الناجح لشرائح أنسجة المخ السميكة إلى مجموعة جديدة من الأسئلة التي يمكن طرحها فيما يتعلق بخصائص مجموعات الخلايا الكبيرة بدلا من خصائص الخلايا المفردة أو المجموعات المجاورة من الخلايا. لتحقيق نتائج ناجحة ، يجب على المرء الالتزام الصارم ببروتوكول CLARITY ، حيث توجد مجموعة واسعة من المعلمات التي يجب مراعاتها لتقليل التباين بين العينات (على سبيل المثال ، النسبة المئوية للوضوح ، ومعلومات التألق ، ومعلمات التورم).
يصف الشكل 1 عملية المقاصة بأكملها من التحقق .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم طرق تطهير الأنسجة أداة ثورية في أبحاث الدماغ ، مما يدعو إلى أسئلة لم يكن من الممكن طرحها من قبل. من استهداف خصائص مجموعة صغيرة من الخلايا أو خلية واحدة أو حتى مشبك واحد ، يتيح CLARITY الآن استهداف إجمالي عدد الخلايا أو ميزات الاتصال بعيدة المدى باستخدام الفلوروفورات ذات الصلة.
نتيجة التعبير عن الفلوروفور والجمع بين إجراء الوضوح ليست ثنائية. قد تتداخل العديد من العوامل مع الإجراء مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل. أولا ، يجب التحقق من تعبير الفلوروفور مقدما. نظرا لأن إجراء CLARITY يسبب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 803589)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة ISF رقم 1815/18)، والمنح الكندية الإسرائيلية (CIHR-ISF، المنحة رقم 2591/18). نشكر نيشاما نوفيك على تعليقه على المخطوطة بأكملها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP :: TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | فيروسي يستخدم للكشف عن الخلايا النجمية | |
| AAV5-CaMKII :: eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | فيروسي يستخدم للكشف عن الخلايا العصبية | |
| AAV5-CaMKII :: H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | الناقل الفيروسي المستخدم للكشف عن النوى العصبية | |
| AAV5-CaMKII :: TdTomato | ELSC مرفق ناقلات النواقل الأساسية (EVCF) | ناقل فيروسي يستخدم للكشف عن الخلايا العصبية | |
| أكريلاميد (40٪) | Bio-rad | # 161-0140 | |
| Bisacrylamide (2٪) | Bio-rad | # 161-0142 | |
| حمض البوريك | سيجما | #B7901 | الوزن الجزيئي - 61.83 جم / مول |
| مجهر متحد البؤر ، مسح ، هدف FV1000 | Olympus | 4x (UPlanSApo ، 0.16 NA) | |
| برنامج | ImarisBitplane ، المملكة المتحدة | برنامج يسمح بتحليل ثلاثي الأبعاد للصور | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4٪ | EMS | # 15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| برنامج | برنامج يسمح بتحليل ثلاثي الأبعاد للصور باستخدام الواقع الافتراضي | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | # 002009239100 | الوزن الجزيئي - 121.14 جم / مول |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| اثنين من المجهر الفوتون | Neurolabware | Ti: ليزر الياقوت (Chameleon Discovery TPC ، متماسك) ، أنابيب مضاعف الصور GaAsP (Hamamatsu ، H10770-40) ، مرشح ممر النطاق (Semrock) ، الغمر في الماء 16x الهدف (نيكون ، 0.8 NA) ؛ | |
| VA-044 البادئ | واكو | # 011-19365 |
المراجع
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
