Method Article

تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة

DOI:

10.3791/63690

⸱

May 5th, 2022

 , 
1Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد قياس التنفس عالي الدقة إلى جانب مستشعرات التألق استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يصف هذا البروتوكول تقنية لتقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي المتغلغل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصاحب خلل الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية العديد من الأمراض المرتبطة بالاعتلال العصبي المحيطي ، والذي يمكن أن يحدث لأسباب متعددة ، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسكري والالتهابات والاضطرابات الموروثة والأورام. يمكن أن يكون تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية للفأر أمرا صعبا بسبب صغر حجم العينة ، وعدد محدود من الميتوكوندريا الموجودة في الأنسجة ، ووجود غمد المايلين. تقلل التقنية الموصوفة في هذا العمل من هذه التحديات باستخدام بروتوكول نفاذية فريد من نوعه مقتبس من بروتوكول يستخدم لألياف العضلات ، لتقييم وظيفة الميتوكوندريا العصبية الوركية بدلا من عزل الميتوكوندريا عن الأنسجة. من خلال قياس إنتاج الأنواع التفاعلية الفلورية باستخدام Amplex Red / Peroxidase ومقارنة ركائز ومثبطات الميتوكوندريا المختلفة في الأعصاب النفاذة للسابونين ، كان من الممكن اكتشاف حالات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، ونشاط مجمعات الميتوكوندريا في وقت واحد. لذلك ، فإن الطريقة المعروضة هنا تقدم مزايا مقارنة بتقييم وظيفة الميتوكوندريا بواسطة تقنيات أخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا ضرورية للحفاظ على صلاحية الخلية وأداء العديد من وظائف الخلية مثل استقلاب الطاقة (الجلوكوز والأحماض الأمينية والدهون ومسارات استقلاب النيوكليوتيدات). باعتبارها الموقع الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، فإن الميتوكوندريا مركزية في العديد من عمليات إشارات الخلايا مثل موت الخلايا المبرمج وتشارك في تخليق مجموعات الحديد والكبريت (Fe-S) ، واستيراد بروتين الميتوكوندريا ونضجه ، والحفاظ على الجينوم والريبوسومات1،2،3. يتم التحكم في شبكة ديناميكيات غشاء الميتوكوندريا عن طريق عمليات الاندماج والانشطار ، ولديهم أيضا آلات لمراقبة الجودة و mitophagy

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات المعنية باستخدام الحيوانات في البحوث، CCS/UFRJ (CEUA-101/19)، والمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام التجارب. يتم عزل العصب الوركي من الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر أربعة أشهر ، ويتم قتلها الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تم تحسين خطوات البروتوكول لتجنب تدهور الميتوكوندريا. لذلك ، في هذا البروتوكول ، تم إجراء معايرة أجهزة استشعار الأكسجين القطبي قبل تشريح الأنسجة العصبية الوركية للفأر ونفاذها.

1. إعداد الكواشف

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للحفاظ على الأنسجة (TP Buffer).
    1. قم بإعداد الكواشف التالية في م....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمثيل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا بواسطة العصب الوركي المتخلل في الشكل 2. يمثل التتبع الأحمر تدفق O2 لكل وحدة كتلة في pmol / s.mg. بعد تسجيل استهلاك الأكسجين القاعدي مع الركائز الداخلية (التنفس الروتيني) ، يتم حقن السكسينات (SUCC) لتسجيل التنفس المعقد الثاني (نازعة هيدروجيناز السكسينات) ، مما يؤدي إلى زيادة في معدل استهلاك الأكسجين. في التسلسل ، يتم إضافة تركيز مشبع من ADP ، وتنشيط سينثاز ATP ودفع الفسفرة التأكسدية. هذا يؤدي إلى حالة فسفورية من التنفس الميتوكوندريا. التنفس في.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من الأمراض أو الحالات المصاحبة للاعتلالات العصبية لديها خلل وظيفي في الميتوكوندريا كعامل خطر. يعد تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية أمرا ضروريا لتوضيح كيفية عمل الميتوكوندريا في هذه الحالات التنكسية العصبية. تقييم وظيفة الميتوكوندريا شاق بسبب صعوبة طريقة العزل وندرة المواد. وبالتالي ، فإن تطوير تقنيات نفاذية الأنسجة التي لا تتطلب عزل الميتوكوندريا أمر ضروري.

لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة المتخلل ، يعد اختيار مادة كيميائية يمكنها اختراق غشاء بلازما الخلية دون التدخل في.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد مول هذه الدراسة كل من المعهد السريبيليهيرا، ومؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية في ريو دي جانيرو، والمجلس الوطني للتنمية المدنية والتكنولوجية (CNPq)، وتنسيقية الأعمال الصديقة للفيزياء في نيفيل العليا - البرازيل. نحن ممتنون للدكتور أنطونيو غالينا فيلهو والدكتورة مونيكا مونتيرو لوميلي والدكتور كلاوديو ماسودا على الدعم مع مرافق المختبر ، والدكتورة مارثا سورنسون على التعليقات اللطيفة والقيمة في تحسين المقالة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الأدينوزين 5 'ثلاثي فوسفات هيدرات ملح الصوديومسيجما ألدريتشA26209
الأدينوزين 5 & برايم ؛ ثنائي الفوسفات ملح الصوديومسيجما ألدريتشA2754
كاشف أحمر أمبلكسThermo Fisher العلميA12222يتم تحضير Amplex Red في DMSO بما يتوافق مع ورقة بيانات المنتج
Antimycin A (من Streptomyces sp.)Sigma-AldrichA8674
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7030جزء الصدمة الحرارية ، خالي من البروتياز ، خالي من الأحماض الدهنية ، خالي من الجلوبيولين بشكل أساسي ، درجة الحموضة 7 ، & ge ؛ 98٪
كربونات الكالسيومسيجما ألدريتشC6763
كاربونيل سيانيد 4- (ثلاثي فلوروميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP)سيجما ألدريتشC2920
السيتوكروم جسيجما ألدريتشC7752(من قلب الخيول ؛ بروتين صغير هيم)
إصدار DataLab 5.1.1.91OROBOROS INSTRUMENTS ، النمساحقوق الطبع والنشر (ج) 2002 - 13 بواسطة الدكتور إريك جنيجر
شاكر دقيق رقمي مداري 120 فولتثيرمو فيشر 88882005
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43819
EGTA ملح الصوديومSigma-AldrichE8145
حقنة هاميلتونSigma-AldrichHAM8007510 ميكرولتر و 25 ميكرولتر و 50 ميكرولتر
HEPESSigma-AldrichH3375
الهيدروجين محلول بيروكسيد 30٪ W / WMerckH1009
ImidazoleSigma-AldrichI2399
L- (ناقص;)- حمض الماليكسيجما ألدريتشM7397
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشM2393
MES ملح الصوديومسيجما ألدريتشM3885
ملقط تشريح دقيق ، ملقط تشريح دقيقمنحني سيجما ألدريتشF4142
، مستقيمسيجما ألدريتشF4017
O2K - مجموعة مرشح Amplex أحمرOROBOROS INSTRUMENTS ، النمسا44321-01Fasching M ، Sumbalova Z ، Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: إنتاج HRR و H2O2 في ميتوكوندريا دماغ الفأر. شبكة Mitochondr Physiol 17.17.
O2K - Fluorescence LED2 - مكون الوحدة Fluorscence-Sensor GreenOROBOROS INSTRUMENTS ، النمسا44210-01
OligomycinSigma-AldrichO4876(من Streptomyces diastatochromogenes ؛ خليط من oligomycins A و B و C
OROBOROS Oxygraph-2kOROBOROS INSTRUMENTS ، النمساhttp://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl)سيجما ألدريتشP4509
بيروكسيداز من الفجل الحارسيجما ألدريتشP8375
أطباق بتري ، البوليسترينMERCKP5606
فوسفوكرياتين ثنائي الصوديوم ملح هيدراتسيجما ألدريتشP7936
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما ألدريتشPHR1330
هيدروكسيدالبوتاسيومسيجما ألدريتش221473
روتينونسيجما ألدريتشR8875
سابونينسيجما ألدريتشSAE0073
بيروفات الصوديومسيجما ألدريتشP5280
سكسينات الصوديوم ثنائي القاعدة سداسي هيدراتسيجما ألدريتشS2378
السكروزسيجما ألدريتشS9378
التورينسيجما ألدريتشT0625
علمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reac....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionSciatic NerveHigh Resolution RespirometryOxygen ConsumptionReactive Oxygen SpeciesSaponin PermeabilizationElectron Transport SystemMitochondrial Complex ActivityATP SynthesisPeripheral Neuropathy

Related Articles