العلاج التوافقي المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1

تحسن العمر المتوقع للأفراد المصابين بفيروس العوز المناعي البشري المزمن (HIV) تحسنا كبيرا مع العلاج التوليفي المضاد للفيروسات القهقرية (cART)^1,2. نجح cART في تقليل تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 وزيادة عدد الخلايا التائية CD4 + إلى وضعها الطبيعي في غالبية المشاركين المصابين بفيروس العوز المناعي البشري -1 المصابين بعدوى مزمنة³ ، مما يؤدي إلى تحسين الصحة العامة وتقليل تطور المرض^{بشكل كبير 4}. ومع ذلك، يتم إنشاء المستودع الكامن لفيروس العوز المناعي البشري-1 حتى عندما يبدأ العلاج المضاد للفيروسات القهقرية أثناء العدوى الحادة ^5,6,7. تستمر الخزانات على مدى سنوات خلال العلاج المضاد للفيروسات القهقرية والانتعاش الفيروسي السريع بعد انقطاع العلاج المضاد للفيروسات القهقرية^{موثق جيدا 8,9}. الأشخاص المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية على العلاج المضاد للفيروسات القهقرية معرضون أيضا لخطر أكبر للإصابة بأمراض مصاحبة مثل أمراض القلب والأوعية الدموية والسرطان والاضطرابات العصبية¹⁰،^11،12. لذلك ، هناك حاجة إلى علاج وظيفي لفيروس نقص المناعة البشرية. تقدم النماذج الحيوانية لعدوى HIV-1 مزايا واضحة في تطوير والتحقق من صحة استراتيجيات علاج فيروس نقص المناعة البشرية الجديدة¹³،^14،15. يمكن للفئران المتوافقة مع البشر ، كنموذج حيواني صغير ، أن توفر إعادة تكوين الخلايا المناعية البشرية متعددة السلالات في الأنسجة المختلفة ، مما يسمح بالدراسة الدقيقة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية¹⁶،¹⁷،^18،19. من بين النماذج المتوافقة مع البشر ، نجح نموذج نخاع العظم والكبد والغدة الصعترية (BLT) في تلخيص عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 المزمنة بالإضافة إلى الاستجابات المناعية البشرية الوظيفية لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1²⁰،21،²²،^23،24. لذلك ، تم استخدام نموذج الماوس BLT المتوافق مع البشر على نطاق واسع للتحقيق في جوانب مختلفة في مجال أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية. فئران BLT المتوافقة مع البشر ليست فقط نماذج راسخة لتلخيص عدوى HIV-1 المستمرة والتسبب في المرض ، ولكنها أيضا أدوات تبعية لتقييم استراتيجيات التدخل القائمة على العلاج الخلوي. أظهر المؤلفون الحاليون وغيرهم أن نموذج الفئران BLT المتوافق مع البشر يلخص عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 المستمرة والتسبب^{في 25}،26،²⁷ ويوفر أدوات لتقييم استراتيجيات التدخل القائمة على العلاج الخلوي ²⁸،²⁹،30،31،^32،33.

تعمل أنظمة cART المكونة من مجموعات من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية التي يتم تناولها يوميا على قمع تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 لدرجة أن الحمل الفيروسي في الأفراد الذين عولجوا بنجاح لا يزال غير قابل للكشف على المدى الطويل³⁴. تشبه نتائج علاج الفئران المصابة بفيروس العوز المناعي البشري المصابة بفيروس العوز المناعي البشري بنظم cART ذات الصلة سريريا تلك التي لوحظت في الأفراد المصابين بفيروس العوز المناعي البشري -1 الذين عولجوا بمضادات الفيروسات القهقرية²²: يتم قمع مستويات فيروس العوز المناعي البشري -1 دون حدود الكشف وانقطاع نتائج cART في انتعاش تكاثر فيروس العوز المناعي البشري من الخزان الكامن³⁵. الحقن تحت الجلد (SC) 27،³⁶،37 أو داخل الصفاق (IP) ³⁷،^38،39 هو الطريق الذي يشيع استخدامه لعلاج cART في الفئران المتوافقة مع البشر. ومع ذلك ، فإن الحقن اليومي المكثف يؤدي إلى إجهاد الحيوانات عن طريق ضبط النفس البدني⁴⁰. كما أنها كثيفة العمالة ويحتمل أن تكون غير آمنة للباحثين بسبب زيادة التعرض لفيروس نقص المناعة البشرية أثناء استخدام الأدوات الحادة. يعتبر الإعطاء عن طريق الفم مثاليا لتقليد امتصاص وتوزيع وإفراز أدوية cART التي يتناولها الأفراد المصابون بفيروس نقص المناعة البشرية -1. عادة ما يتضمن الإعطاء عن طريق الفم إجراءات مخصصة وغالبا ما تكون شاقة لوضع الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية في طعام معقم (ضروري بسبب نقص المناعة لدى الفئران)²⁴،³⁷،41 أو الماء⁴²،^{43،44،45،46} ، والتي قد تكون أو لا تكون متوافقة كيميائيا مع العديد من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية ، أو تؤدي إلى شيء لا تأكله الفئران أو تشربه بسهولة (مما قد يؤثر على مستويات الجرعة والدواء في الجسم). وتتجاوز الطريقة الجديدة لإدارة العلاج المضاد للفيروسات القهقرية المقترحة هنا محاولات التسليم السابقة بسبب توافقها مع أنواع مختلفة من الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية، والسلامة وسهولة التحضير والإدارة، والحد من إجهاد الحيوانات والقلق الناتج عن الحقن اليومي.

تينوفوفير ديسوبروكسيل فومارات (TDF) ، إلفيتيغرافير (ELV) ، ورالتيغرافير (RAL) هي أدوية ضعيفة الذوبان في الماء. ومن المثير للاهتمام ، لوحظ زيادة التوافر البيولوجي ل TDF مع الأطعمة الدهنية ، مما يشير إلى أن التثبيط التنافسي للليباز بواسطة الأطعمة الدهنية قد يوفر حماية معينة ل TDF⁴⁷. لذلك ، تم اختيار أكواب DietGel Boost لتحل محل طعام القوارض العادي كطريقة للتسليم بناء على محتواها المتواضع من الدهون (20.3 جم لكل 100 جم) مقارنة بطعام القوارض العادي (10 جم لكل 100 جم) والنظام الغذائي النموذجي عالي الدهون للفأر (40-60 جم لكل 100 جم)⁴⁸. الوزن الإجمالي لكوب واحد هو 75 غرام ؛ وبالتالي ، سيحتوي كل كوب على كمية الطعام ، وبالتالي الدواء ، بما يكفي لخمسة فئران على مدار 3 أيام.

تم الحصول على أنسجة الجنين البشري مجهولة المصدر تجاريا. تم إجراء البحوث على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس ، ولجنة أبحاث الحيوان (UCLA) (ARC) وفقا لجميع الإرشادات الفيدرالية والولائية والمحلية. على وجه التحديد ، تم إجراء جميع التجارب وفقا للتوصيات والمبادئ التوجيهية لإسكان ورعاية المختبر التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) وجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر (AALAC) الدولية بموجب بروتوكول UCLA ARC رقم 2010-038-02B. تم إجراء جميع العمليات الجراحية تحت الكيتامين (100 مجم / كجم) / زيلازين (5 مجم / كجم) وتخدير الأيزوفلوران (2-3 مجلد) وتم بذل كل الجهود لتقليل آلام الحيوانات وعدم الراحة.

1. الفئران المتوافقة مع البشر المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1

ملاحظة: تم بناء الفئران المتوافقة مع البشر كما هو موضح سابقا في³⁰،^31،49. يتم وصف البروتوكول بإيجاز أدناه.

1. تنقية الخلايا السلفية المكونة للدم CD34 + من كبد الجنين البشري عن طريق الميكروبيدات المضادة ل CD34 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
2. تخدير الفئران الذكور والإناث البالغة من العمر 6-8 أسابيع NOD / SCID / IL2Rγ− / - (NSG) وتشعيع شبه مميت (2.7 غراي) قبل الجراحة.
3. زرع الغدة الصعترية ، المشتقة من نفس المتبرع مثل كبد الجنين ، تحت كبسولة الكلى جنبا إلى جنب مع الكبد.
4. بعد الزرع ، حقن الفئران ب 0.5 مليون إلى مليون خلية CD34 + ، عن طريق الوريد.
5. بعد 8-10 أسابيع ، اجمع 100 ميكرولتر من دم الفأر عن طريق النزف^{المداري الخلفي 50} في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على 5 ميكرولتر من EDTA وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 3 دقائق.
6. قم بتخزين البلازما عند -80 درجة مئوية لمراقبة الحمل الفيروسي بعد إصابة الفأر بفيروس نقص المناعة البشرية -1. أضف 2 مل من محلول NH4C بنسبة 83٪ واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحليل خلايا الدم الحمراء.
7. أضف 10 مل من RPMI مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لوقف التحلل. تدور في 300 × غرام لمدة 5 دقائق.
8. نضح طاف . صبغ الخلايا بلوحة الأجسام المضادة (انظر جدول المواد) وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتحقق من تطعيم الخلايا المناعية البشرية.
9. تصيب الفئران التي تظهر أكثر من 50٪ من خلايا CD45 + المنتشرة عن طريق حقن الوريد خلف الحجاج^51,52 مع ما لا يقل عن 200 نانوغرام من p24 من سلالة HIV-1 (أي NFNSXSL9 30,53,54) باستخدام حقنة الأنسولين. جمع الدم كل أسبوعين لتحليل قياس التدفق الخلوي وقياس الحمل الفيروسي.

2. إعداد عقاقير العلاج المضاد للفيروسات القهقرية

1. وزن الأدوية الفردية. على سبيل المثال ، لصنع 10 أكواب طعام باستخدام cART ، استخدم كاشطات الخلايا المعقمة لوزن 250 مجم من FTC (Emtricitabine) ، و 375 مجم من TDF ، و 500 مجم من RAL أو ELV في أنابيب طرد مركزي معقمة فردية سعة 15 مل في خزانة السلامة البيولوجية.
2. أضف 1 مل من DMSO إلى أنبوب FTC 250 مجم (التركيز النهائي 250 مجم / مل) ، أضف 1.5 مل من DMSO إلى أنبوب TDF 375 مجم (التركيز النهائي 250 مجم / مل) ، وأضف 1 مل من DMSO إلى أنبوب RAL أو ELV 500 مجم (التركيز النهائي 500 مجم / مل). حرك أو ماصة خليط الدواء حتى يذوب تماما ويتم الحصول على محلول واضح.
3. استخدم مرشح غشاء PVDF محب للماء بحجم 0.22 ميكرومتر لتعقيم المحاليل باستخدام حقنة معقمة. يمكن تخزين المحاليل الدوائية الفردية في -20 درجة مئوية لمدة 12 أسبوعا.
4. عندما تكون جاهزا للاستخدام، قم بإذابة حصة واحدة من كل محلول دوائي عند 37 درجة مئوية حتى يصبح المحلول صافيا. تخلط جيدا باستخدام ماصة.
5. الجمع بين الأدوية وتخلط جيدا لتكوين مزيج رئيسي: 1 مل من FTC في DMSO ، 1.5 مل من TDF في DMSO ، و 1 مل من ELV أو RAL في DMSO.
   ملاحظة: هذا المبلغ سوف يصنع 10 أكواب طعام.
6. أضف 350 ميكرولتر من محلول cART Master mix في كوب واحد لصنع كوب DietGel Boost cART واحد.
7. أضف 0.75 مل من تريميثوبريم-سلفاميثوكسازول (0.48 ملغ/مل تركيز نهائي) إلى الكوب.
8. يقلب جيدا باستخدام أطراف ماصة معقمة سعة 1 مل.
9. قم بتوزيع كوب الطعام الذي يحتوي على cART من الكوب الأصلي باستخدام ملعقة صغيرة على طبق بتري 60 مم حسب الحاجة. قم بوزن الطعام على ميزان لحساب كمية كوب الطعام الذي يحتوي على cART لكل قفص وفقا لعدد الفئران.

3. إعطاء أدوية العلاج المضاد للفيروسات القهقرية للفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1

1. قم بإزالة تشاو العادي من القفص واستبدله بكوب طعام يحتوي على cART.
   ملاحظة: في المتوسط ، سوف يأكل الفأر ما يصل إلى 5 غرام من الطعام يوميا. يمكن إعطاء كوب طعام واحد تقريبا لخمسة فئران لمدة 2 أيام.
2. قم بتحديث طعام cART ثلاث مرات في الأسبوع.
3. وزن الأكواب المستخدمة لمراقبة المدخول. وزن الفئران أسبوعيا لتأكيد الاستهلاك.

4. مراقبة الحمل الفيروسي عن طريق PCR في الوقت الحقيقي

1. تقييم الخلايا المناعية البشرية (مستويات الخلايا التائية CD4 و CD8) وتكرار HIV-1 في الفئران BLT كل أسبوعين عن طريق النزيف خلف المدار. حصاد البلازما باتباع التعليمات الواردة في الخطوات 1.5-1.8.
2. مراقبة الأحمال الفيروسية في البلازما للفئران المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 قبل وأثناء إعطاء العلاج المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم لمدة 8 أسابيع. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي في البلازما من البلازما باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي وتحديده عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام البادئات والمجسات (انظر جدول المواد) كما هو موضح سابقا²⁷،^30،31. استخدم بروتوكول ركوب الدراجات التالي: 48 درجة مئوية (15 دقيقة) ، 95 درجة مئوية (10 دقائق) ، ثم ركوب الدراجات 95 درجة مئوية (15 ثانية) ، 60 درجة مئوية (1 دقيقة) لمدة 45 دورة.

5. تقييم نسب CD4 / CD8 عن طريق قياس التدفق الخلوي

1. تحضير معلقات أحادية الخلية من الدم المحيطي للنزيف كل أسبوعين باتباع الخطوات 1.5-1.8.
2. صبغ الخلايا بعلامات سطحية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. استخدم الأجسام المضادة التالية لعلامة السطح 27،30،⁴³،49 في قياس التدفق الخلوي: CD45 (استنساخ HI30) ، CD8 (استنساخ SK1) ، CD3 (استنساخ OKT3) ، CD4 (استنساخ RPA-T4)²⁷،³⁰،^42،49.

بافتراض أن الفأر الذي يبلغ متوسط وزنه 25 جراما يستهلك 4 جم من الطعام يوميا ، فإن جرعة الدواء اليومية من خلال المدخول الفموي تتوافق مع 2.88 مجم / كجم TFV و 83 مجم / كجم FTC و 768 مجم / كجم من RAL. لاختبار ما إذا كان النظام الغذائي الأمثل ساما ويؤثر على الصحة العامة مقارنة بالحقن اليومي ل cART ، تمت مراقبة وزن الفئران أسبوعيا قبل وأثناء cART من خلال الحقن الفموي أو تحت الجلد. لم تكن هناك فروق كبيرة في الوزن قبل إعطاء cART في كل مجموعة (الشكل 1). ومع ذلك ، انخفض وزن الفأر باستمرار أثناء الحقن اليومي cART SC. في المقابل، أعاد FTC/TDF/ELV أو FTC/TDF/RAL في DietGel أوزان الفئران إلى مستويات بدء العلاج المضاد للفيروسات القهقرية بعد 5 أسابيع من إعطاء العلاج المضاد للفيروسات القهقرية عن طريق الفم. بالإضافة إلى ذلك ، لم تلاحظ أي تغييرات كبيرة في الوزن بين مجموعات Raltegravir أو Elvitegravir.

لاختبار ما إذا كان إعطاء cART عن طريق الفم يثبط الحمل الفيروسي بنفس فعالية الحقن اليومي ، تم تقييم الأحمال الفيروسية في البلازما كل أسبوعين باستخدام RT-PCR. يوضح الشكل 2 أن نظام الغذاء FTC / TDF / ELV ART 100٪ قمع بكفاءة تكاثر الفيروس إلى مستويات لا يمكن اكتشافها في غضون 4 أسابيع ؛ يمكن لنظام الغذاء FTC / TDF / RAL ART قمع 80٪ من الفئران إلى مستويات لا يمكن اكتشافها في غضون 4 أسابيع ، في حين أن 70٪ فقط من الفئران التي تتلقى حقن SC وصلت إلى مستويات لا يمكن اكتشافها بعد 4 أسابيع من العلاج. أظهرت النتائج أن الإعطاء عن طريق الفم يمنع تكاثر الفيروس بشكل أسرع وأكثر كفاءة من حقن SC. علاوة على ذلك ، منع النظام الغذائي cART المزيد من الانخفاض في نسب CD4 / CD8 في الدم المحيطي في وقت أبكر من الحقن اليومي SC (الشكل 3). أشارت هذه النتائج إلى أن نظام cART الفموي المقترح يمكن أن يثبط بنجاح viremia البلازما دون مستوى الكشف ، واستعادة مستويات الخلايا التائية CD4 بسرعة ، وتحسين الصحة العامة للحيوانات في الفئران المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1.

الشكل 1: يتغير وزن جسم الفأر قبل وأثناء العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية بعد الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في مجموعات مختلفة. أصيبت الفئران المتوافقة مع البشر بفيروس نقص المناعة البشريةNFNSXSL9 بعد إعادة تكوين المناعة. بعد 4 أسابيع من الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، عولجت الفئران إما لمدة 7.5 أسابيع أخرى بنظام FTC / TDF / RAL من خلال الحقن تحت الجلد (SC) ، أو عن طريق إعطاء إما FTC / TDF / RAL عن طريق الفم أو FTC / TDF / ELV. تم قياس أوزان جسم الفأر بدءا من 1 أسبوع قبل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. أجريت جميع المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني، متوسط مجموعة الإبلاغ (± S.E.). تظهر نجوم النجمة الخضراء اختلافات إحصائية بين مجموعة الحقن FTC / TDF / ELV الغذائية عن طريق الفم ومجموعة حقن FTC / TDF / RAL SC. * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.001. ن = 6-7 في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: يظهر إعطاء cART عن طريق الفم للطعام قمعا أسرع للفيروس. كما هو موضح في الشكل 1 ، لم يتم علاج الفئران أو علاجها بنظام FTC / TDF / RAL من خلال الحقن تحت الجلد ، ومن خلال الإدارة الفموية لأكواب الطعام الوهمية ، FTC / TDF / RAL ، أو FTC / TDF / ELV للأنظمة الغذائية لمدة 7.5 أسابيع أخرى. (أ) الحمل الفيروسي للبلازما بمرور الوقت بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في مجموعات مختلفة. (ب) ملخص الحمل الفيروسي بمرور الوقت بعد الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في مجموعات مختلفة ، المتوسط الهندسي للمجموعة المبلغ عنها بفاصل ثقة 95٪ (CI). تشير الأسهم السوداء إلى وقت بدء cART للمجموعات المعالجة ب cART. (ج) تحليل البقاء على قيد الحياة للوقت بعد العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية للحمل الفيروسي غير القابل للكشف لكل مجموعة. ن = 6-7 في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تظهر الإعطائات الفموية للأغذية ART استعادة أسرع لنسبة CD4 / CD8. نسبة CD4 / CD8 في الدم المحيطي بمرور الوقت بعد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 لكل مجموعة. تم إجراء جميع المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار مان ويتني ، متوسط مجموعة الإبلاغ (± S.E.). تظهر نجوم النجمة الحمراء اختلافات إحصائية بين مجموعة الحقن FTC / TDF / RAL الغذائية ومجموعة حقن FTC / TDF / RAL SC. *ف < 0.05. ن = 6-7 في كل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

SK هو مؤسس شركة CDR3 Inc. يعلن المؤلفون الباقون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.