مقالة منهجية

استراتيجية إثراء ذات طرف دوار للتحليل المتزامن ل N-glycopeptides و Phosphopeptides من أنسجة البنكرياس البشرية

DOI:

10.3791/63735

⸱

مايو 4, 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) تغير هياكل البروتين ووظائفه. يمكن لطرق الإثراء المتزامن لأنواع PTM متعددة أن تزيد من التغطية في التحليلات. نقدم بروتوكولا باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المزدوجة الوظيفية Ti(IV) المجمدة متبوعة بقياس الطيف الكتلي للإثراء والتحليل المتزامن للبروتين N-glycosylation والفسفرة في أنسجة البنكرياس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يوفر قياس الطيف الكتلي تغطية عميقة للتعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) ، على الرغم من أن إثراء هذه التعديلات من المصفوفات البيولوجية المعقدة غالبا ما يكون ضروريا بسبب انخفاض قياس stoichiometry مقارنة بالتحليلات غير المعدلة. معظم سير عمل إثراء PTMs على الببتيدات في سير عمل البروتينات من أسفل إلى أعلى ، حيث يتم هضم البروتينات إنزيميا قبل تحليل الببتيدات الناتجة ، يثري نوعا واحدا فقط من التعديل. ومع ذلك ، فإن المكمل الكامل ل PTMs هو الذي يؤدي إلى وظائف بيولوجية ، وقد يؤدي إثراء نوع واحد من PTM إلى مثل هذا الحديث المتبادل ل PTMs. وقد لوحظ PTM crosstalk بين غليكوزيل البروتين والفسفرة ، وهما PTMs الأكثر شيوعا في البروتينات البشرية وأيضا PTMs الأكثر دراسة باستخدام سير عمل قياس الطيف الكتلي. باستخدام استراتيجية التخصيب المتزامنة الموصوفة هنا ، يتم إثراء كل من PTMs من أنسجة البنكرياس البشرية بعد الوفاة ، وهي مصفوفة بيولوجية معقدة. يتم استخدام كروماتوغرافيا التقارب المعدني المزدوج الوظيفية Ti(IV) المجمدة لفصل أشكال مختلفة من الجليكوزيل والفسفرة في وقت واحد في كسور متعددة بطريقة مريحة تعتمد على طرف الدوران ، مما يسمح بإجراء تحليلات نهائية لتفاعلات PTM المتقاطعة المحتملة. يمكن تطبيق سير عمل التخصيب هذا للجليكو والفوسفوببتيدات على أنواع مختلفة من العينات لتحقيق التنميط العميق لأجهزة PTMs المتعددة وتحديد الجزيئات المستهدفة المحتملة للدراسات المستقبلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب تعديلات البروتين بعد الترجمة (PTMs) دورا رئيسيا في تعديل هياكل البروتين وبالتالي وظائفها وعملياتها البيولوجية النهائية. يزداد تنوع البروتيوم البشري بشكل كبير بسبب التباين التوافقي الذي توفره PTMs المختلفة. أصبحت دراسة التنوع البروتيني في الصحة والمرض مجالا للبحث ذا أهمية كبيرة في السنوات الأخيرة 2,3.

أصبحت دراسة النماذج البروتينية وبشكل أكثر تحديدا PTMs ذات العمق الكبير أكثر سهولة من خلال تطوير طرق البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS). باستخدام MS ، يتم تأين التحليلات وتجزئتها وتحديدها بناء على m / z من الشظايا. غالبا ما تكون طرق التخصيب ضرورية بسبب انخفاض الوفرة النسبية ل PTMs مقارنة بأشكال البروتينات غير المعدلة. على الرغم من أن تحليل البروتينات السليمة و PTMs الخاصة بها ، والتي تسمى التحليلات من أعلى إلى أسفل ، أصبحت أكثر روتينية ، إلا أن الهضم الأنزيمي للبروتينات وتحليل الببتيدات المكونة لها في التحليلات من أسفل إلى أعلى لا يزال هو الطريق الأكثر استخداما على نطاق واسع لتحليل PTM. الاثنان الأكثر دراسة على نطاق واسع PTMs ، واثنين من PTMs الأكثر شيوعا في الجسم الحي ، هما glycosylation و phosphorylation4. يلعب هذان الجهازان أدوارا رئيسية في إشارات الخلايا والتعرف عليها ، وبالتالي فهي تعديلات مهمة للتوصيف في أبحاث الأمراض.

غالبا ما توفر الخواص الكيميائية لمختلف PTMs طرقا نحو إثراء هذه PTMs على مستويات البروتين والببتيد قبل التحليل. Glycosylation هو PTM محب للماء بسبب وفرة مجموعات الهيدروكسيل على كل السكريات الأحادية. يمكن استخدام هذه الخاصية لإثراء الجليكوببتيدات في كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء (HILIC) ، والتي يمكن أن تفصل المزيد من الببتيدات المحبة للماء عن الببتيدات غير المعدلة الكارهة للماء5. يضيف الفسفرة مويتي الفوسفات ، الذي يكون مشحونا سالبا إلا عند درجة الحموضة الحمضية. بسبب هذه الشحنة ، يمكن استخدام العديد من الكاتيونات المعدنية ، بما في ذلك التيتانيوم ، لجذب وربط الببتيدات الفوسفورية بينما يتم غسل الأنواع غير المفسفرة. هذا هو مبدأ كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة (IMAC). يمكن العثور على مزيد من المناقشات حول هذه الاستراتيجيات وغيرها من استراتيجيات التخصيب للغليكوزيل والفسفرة في المراجعات الأخيرة 6,7.

غالبا ما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة نسبيا من مواد الببتيد الأولية (0.5 ملغ أو أكثر) لبروتوكولات التخصيب بسبب انخفاض قياس stoichiometry من PTMs على الببتيدات. في السيناريوهات التي قد لا يكون من السهل فيها الحصول على هذه الكمية من العينة، مثل خزعة الورم الأساسية أو تحليلات السائل الدماغي الشوكي، من المفيد استخدام سير العمل السهل الذي ينتج عنه أقصى قدر من المعلومات الجزيئية الحيوية. وقد أبرزت الاستراتيجيات الحديثة التي طورها مختبرنا وغيره التحليل المتزامن والمتوازي للغليكوزيل والفسفرة باستخدام نفس سير عمل إثراء PTM8،9،10،11،12. على الرغم من أن الخصائص الكيميائية لهذين ال PTMs قد تختلف ، إلا أنه يمكن تحليل هذه PTMs في خطوات متعددة بسبب تقنيات الفصل المبتكرة والمواد المستخدمة. على سبيل المثال، تتراكب كروماتوغرافيا التفاعل الكهروستاتيكي المحب للماء (ERLIC) على أساس التفاعلات المحبة للماء بين التحليلات والطور المتنقل مع تفاعلات الشحنة الشحنة بين التحليلات ومادة الطور الثابت13،14،15،16. في درجة الحموضة الحمضية ، يمكن أن يؤدي جذب الببتيدات المفسفرة إلى المرحلة الثابتة إلى تحسين الاحتفاظ بها وفصلها عن الببتيدات غير المعدلة. يمكن استخدام المواد التي تتكون من Ti (IV) المجمدة على المجهرية المحبة للماء للتخليق القائم على HILIC و IMAC لفصل الببتيدات الفوسفاتية والغليكوببتيدات المحايدة والحمضية و mannose-6-phosphorylated17,18. تعرف هذه الاستراتيجية باسم Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الاستراتيجيات لإثراء PTMs متعددة في سير عمل واحد إلى جعل تحليلات تفاعلات PTM المحتملة أكثر سهولة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إجمالي كمية العينة ومتطلبات الوقت أقل من طرق التخصيب التقليدية عند تنفيذها بالتوازي (أي HILIC و IMAC على حصص عينة منفصلة).

لإثبات استراتيجية Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة للتحليل المتزامن للغليكوزيل البروتيني والفسفرة ، قمنا بتطبيقها لتحليل أنسجة البنكرياس البشرية بعد الوفاة. ينتج البنكرياس كلا من الإنزيمات الهضمية والهرمونات التنظيمية، بما في ذلك الأنسولين والجلوكاجون. تضعف وظيفة البنكرياس في مرض البنكرياس. في مرض السكري ، يتأثر تنظيم نسبة السكر في الدم ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. في التهاب البنكرياس ، ينتج الالتهاب عن الهضم التلقائي للعضو3. قد تؤدي التغييرات في ملامح PTM ، بما في ذلك الغليكوزيل والفسفرة ، كما هو الحال في كثير من الأحيان ، إلى أمراض أخرى.

هنا ، نصف بروتوكولا لطريقة التخصيب المتزامن القائمة على طرف الدوران ، استنادا إلى استراتيجية Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة ، ل N-glycopeptides و phosphopeptides المشتقة من البروتينات المستخرجة من أنسجة البنكرياس. ويشمل البروتوكول استخراج البروتين وهضمه، والتخصيب، وجمع بيانات التصلب المتعدد، ومعالجة البيانات، كما يتضح من الشكل 1. تتوفر البيانات التمثيلية من هذه الدراسة عبر اتحاد ProteomeXchange مع المعرف PXD033065.

figure-introduction-1
الشكل 1: سير العمل للتحليل المتزامن ل N-glycopeptides و phosphopeptides من أنسجة البنكرياس البشرية. يتم أولا سحق الأنسجة بالتبريد إلى مسحوق ناعم قبل استخراج البروتين باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظفة (SDS). ثم تخضع البروتينات للهضم الإنزيمي. يتم اقتباس الببتيدات الناتجة قبل التخصيب باستخدام Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف. يتم جمع البيانات الخام باستخدام كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي النانوي - قياس الطيف الكتلي (nRPLC-MS) ويتم تحليلها باستخدام برنامج البحث في قواعد البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يهدف هذا البروتوكول إلى جعل تحليلات PTM أكثر سهولة وتمكين تحليل أكثر انتشارا ل PTMs متعددة في نفس سير العمل. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على المصفوفات البيولوجية المعقدة الأخرى ، بما في ذلك الخلايا والسوائل الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتم الحصول على الموافقة على استخدام أنسجة البنكرياس لأغراض البحث من أقرب أقرباء المتوفى، وتم الحصول على إذن من مجلس المراجعة المؤسسية للعلوم الصحية بجامعة ويسكونسن ماديسون. الرقابة على IRB ليست مطلوبة لأنها لا تشمل البشر على النحو المعترف به في 45 CFR 46.102 (و).

تحذير: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول ، والتي تشمل الأحماض (الفورميك ، الخليك ، ثلاثي فلورو أسيتيك) ، والقواعد (هيدروكسيد الأمونيوم) ، والمبردات (النيتروجين السائل). اقرأ أوراق بيانات السلامة الخاصة بالكواشف المستخدمة للتعرف على المخاطر المرتبطة بها والاحتياطات اللازمة. التركيزات التي يشار إليها باستخدام النسب المئوية هي الحجم / الحجم الكلي (v / v) ويتم تخفيفها بالماء.

1. سحق الأنسجة بالتبريد ، والتحلل ، واستخراج البروتين

  1. املأ ديوار بالنيتروجين السائل. قم بتبريد أجزاء مطحن الأنسجة التي ستلامس أنسجة البنكرياس مسبقا ، وهي الغرفة والطاحن وملعقة الاسترداد في حاوية البوليسترين.
  2. انقل قطع الأنسجة المجمدة إلى حامل العينة المبرد مسبقا وأضف ملعقة من النيتروجين السائل إلى الأنسجة.
  3. ضع الساحق في الغرفة واضربه باستخدام مطرقة خمس إلى عشر مرات لسحق العينة. قم بإزالة الطاحن من الغرفة وكشط مسحوق الأنسجة الملتصقة والقطع.
  4. أضف ملعقة من النيتروجين السائل إلى الغرفة إذا بدأت الأنسجة في الذوبان. كرر عملية السحق حتى تصبح العينة مسحوقا ناعما بدون قطع كبيرة من الأنسجة. قسم العينات إلى ما يقرب من 100 ملغ أليكوتس في أنابيب مبردة مسبقا.
  5. قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل يحتوي على 4٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، و 150 mM NaCl ، و 25 mM Tris (الرقم الهيدروجيني = 7.4). قم بإذابة قرص واحد لكل من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز في 500 ميكرولتر من الماء للحصول على مخزون 20x من كل منهما. أضف الحجم المطلوب من مخزون 20x لكل مثبط إلى المخزن المؤقت للتحلل للحصول على تركيز نهائي 1x.
  6. أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل لكل 100 ملغ من الأنسجة إلى الأنبوب واحتضنه عند 95 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة 10 دقائق مع الاهتزاز عند 800 دورة في الدقيقة. قم بإزالة العينات من كتلة التسخين واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  7. قم بضبط العينات بطاقة 60 واط (20 كيلو هرتز) لمدة 45 ثانية باستخدام نبضات 15 ثانية مع سكون 30 ثانية بينهما. حبيبات العينات عند 3000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. أضف supernatant إلى مذيب هطول الأمطار 5x ، و 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى 1.5 مل من مذيب هطول الأمطار ، الذي يحتوي على 50٪ من الأسيتون ، و 49.9٪ من الإيثانول ، و 0.1٪ من حمض الخليك. تبرد طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
  9. قم بتكوير العينات مرة أخرى عند 3000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل الكريات عن طريق التفتيت باستخدام ملعقة والخلط مع نفس الكمية من مذيب هطول الأمطار. بيليه مرة أخرى ، وتكرار خطوة الغسيل 2x.
  10. حبيبات العينة عند 16000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جفف حبيبات العينة بالهواء في غطاء دخان لمدة 15 دقيقة وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.

2. هضم البروتين وتحلية المياه

  1. أعد تعليق بيليه البروتين في 300 ميكرولتر من مخزن الهضم الطازج الذي يحتوي على 50 ملليمتر من بيكربونات ثلاثي إيثيلامونيوم (TEAB) و 8 م يوريا.
  2. تقدير تركيز البروتين في المحلول باستخدام فحص البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. إلى البروتين الموجود في المحلول ، أضف ثنائي ثيوثريتول (DTT) إلى تركيز نهائي قدره 5 ملليمتر ، واخلطه ، وقلله في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ثم ، أضف يودواسيتاميد (IAA) إلى تركيز نهائي قدره 15 مللي متر ، واخلطه ، وألكيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم بإخماد الألكلة عن طريق تكرار إضافة DTT في نفس الحجم كما كان من قبل واخلطها.
  4. أضف LysC / trypsin عند 1:100 إنزيم: نسبة البروتين واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. ثم ، أضف 50 mM TEAB لتخفيف اليوريا 8 M المستخدمة < 1 M. أضف التربسين عند 1:100 نسبة الإنزيم: البروتين واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. إخماد عملية الهضم بإضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى 0.3٪ v / v. لكل 1 ملغ من بروتين البدء ، قم بتكييف خرطوشة تحلية المياه (1 سم مكعب ، 10 ملغ) مع 1 مل من الأسيتونيتريل (ACN) و 3x مع 1 مل من 0.1٪ TFA.
  6. قم بتحميل الخليط المهضوم على خرطوشة إزالة الملح. اغسل الخليط 3x باستخدام 1 مل من 0.1٪ TFA. إذا كان الاستخلاص بطيئا ، فقم بتطبيق ضغط إيجابي ولكن تجنب معدل التدفق > قطرة واحدة في الثانية.
  7. الببتيدات الحلوة باستخدام 1 مل من 60٪ ACN و 0.1٪ محلول حمض الفورميك (FA). جفف الببتيدات المطفأة عند حوالي 35 درجة مئوية باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي حتى يتبخر المذيب تماما.
  8. إعادة تعليق الببتيدات في 300 ميكرولتر من الماء وتقدير تركيزات الببتيد باستخدام فحص الببتيد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قسم الببتيدات إلى 500 ميكروغرام من الأليكوت وجففها تماما.

3. ERLIC N-غليكوببتيد التخصيب

ملاحظة: قد تختلف سرعات أجهزة الطرد المركزي وأوقاتها بدقة بناء على العينات ويجب تحسينها. بشكل عام ، 300 × g لمدة 2 دقيقة مناسب لتكييف وغسل المواد و 100 × g لمدة 5 دقائق للتخلي.

  1. يزن حوالي 3 ملغ من الصوف القطني ويعبئه في طرف ماصة فارغ 200 ميكرولتر (طرف الدوران ؛ انظر جدول المواد).
  2. انقل مواد إثراء قوية لتبادل الأنيون إلى أنبوب وأضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لكل مادة 10 ملغ. لتخصيب 500 ميكروغرام من الببتيدات ، استخدم 15 ملغ من المادة. قم بتنشيط المادة عن طريق الاهتزاز لمدة 15 دقيقة.
  3. باستخدام محول أنبوب ، ضع طرف الدوران فوق أنبوب 2 مل وأضف ما يكفي من الطين إلى الطرف للحصول على 15 ملغ من المادة. قم بإزالة السائل عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
  4. قم بتكييف المادة عن طريق الطرد المركزي 3x مع 200 ميكرولتر من ACN. كرر التكييف الثلاثي باستخدام أسيتات الأمونيوم 100 mM (NH4Ac) ، و 1٪ TFA ، و 80٪ ACN / 0.1٪ TFA (مخزن مؤقت للتحميل).
  5. أعد تعليق عينات الببتيد 500 ميكروغرام في حوالي 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل والتدفق عبر طرف الدوران. أعد تحميل التدفق من خلال 2x لضمان الربط الكامل.
  6. اغسل المادة عن طريق الطرد المركزي 5x باستخدام 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 0.1٪ TFA ، ثم 2x باستخدام 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 0.1٪ FA.
  7. قم بالتخلص من الببتيدات عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 50٪ ACN / 0.1٪ FA (E1) ؛ 0.1٪ FA (E2) ؛ 0.1٪ TFA (E3) ؛ 300 mM KH2PO4 ، 10٪ ACN (E4).
  8. اغسل المادة عن طريق الطرد المركزي 2x مع 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 5٪ NH4OH. قم بتمييع الببتيدات المتبقية مع 200 ميكرولتر من 10٪ NH4OH (E5).
  9. جفف جميع الفتحات تماما باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي عند حوالي 35 درجة مئوية.
  10. قم بإجراء تحلية المحلول الأساسي (E5) باستخدام طرف تحلية المياه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  11. جفف الاستخلاص من طرف التحلية باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي عند حوالي 35 درجة مئوية حتى اكتماله.

4. Ti(IV)-IMAC إثراء الفوسفوببتيد

ملاحظة: قد تختلف سرعات أجهزة الطرد المركزي وأوقاتها بدقة بناء على العينات ويجب تحسينها. بشكل عام ، 300 × g لمدة 2 دقيقة مناسب لتكييف وغسل المواد و 100 × g لمدة 5 دقائق للتخلي.

  1. يزن حوالي 3 ملغ من الصوف القطني ويعبئه في طرف ماصة فارغ 200 ميكرولتر (طرف مغزل).
  2. نقل مواد إثراء الفوسفوببتيد Ti-IMAC إلى أنبوب وإضافة 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لكل 10 ملغ من المواد. لتخصيب 500 ميكروغرام من الببتيدات ، استخدم 10 ملغ من المواد.
  3. باستخدام محول أنبوبي ، ضع طرف الدوران فوق أنبوب 2 مل وأضف ما يكفي من الطين إلى الطرف للحصول على مادة 10 ملغ. قم بإزالة السائل عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
  4. قم بتكييف المادة ب 200 ميكرولتر من 40٪ ACN / 3٪ TFA باستخدام نفس إعدادات أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه. أعد تعليق عينات الببتيد في 200 ميكرولتر من 40٪ ACN / 3٪ TFA وتتدفق عبر طرف الدوران. أعد تحميل التدفق مرتين لضمان ربط أكثر اكتمالا.
  5. اغسل المادة عن طريق الطرد المركزي باستخدام محلول ACN بنسبة 200 ميكرولتر من 50٪ ACN و 6٪ TFA و 200 mM NaCl ، يليه غسل 2x في 200 ميكرولتر من 30٪ ACN و 0.1٪ من محلول TFA.
  6. الببتيدات الحلوة مع 200 ميكرولتر من 10 ٪ NH4OH. تجفيف الاستخلاص تماما تحت فراغ. قم بإجراء تحلية المياه باستخدام طرف تحلية المياه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. جفف الاستخلاص من طرف التحلية تحت الفراغ حتى اكتماله.

5. التخصيب المزدوج الوظائف Ti (IV) في وقت واحد

ملاحظة: قد تختلف سرعات أجهزة الطرد المركزي وأوقاتها بدقة بناء على العينات ويجب تحسينها. بشكل عام ، 300 × g لمدة 2 دقيقة مناسب لتكييف وغسل المواد و 100 × g لمدة 5 دقائق للتخلي.

  1. يزن حوالي 3 ملغ من الصوف القطني ويعبئه في طرف دوار فارغ.
  2. نقل ما يقرب من 1 غرام من مادة Ti(IV)-IMAC إلى أنبوب. أضف 0.1٪ TFA إلى تركيز معروف من المواد ، على سبيل المثال ، 20 ملغ / 200 ميكرولتر (يمكن تخزين المواد في هذا التعليق عند 4 درجات مئوية).
  3. للتخصيب من الببتيدات 500 ميكروغرام ، أضف ما يكفي من الطين إلى طرف دوار لنقل 20 ملغ من المواد. اغسل طرف الدوران عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر بنسبة 0.1٪ TFA.
  4. أعد تعليق العينات في 200 ميكرولتر من مذيب التحميل / الغسيل (80٪ ACN و 3٪ TFA) والتدفق عبر طرف الدوران. أعد تحميل التدفق من خلال 2x.
  5. اغسل طرف الدوران 6x عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر من مذيب التحميل / الغسيل. اغسل طرف الدوران بمحلول FA بنسبة 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 0.1٪ FA.
  6. قم بتخلص الببتيدات ب 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 60٪ ACN / 0.1٪ FA (E1) و 40٪ ACN / 0.1٪ FA (E2). تحليل كل عملية إزالة على حدة.
  7. قم بالتخلص من الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 20٪ ACN / 0.1٪ FA و 0.1٪ FA. اجمع بين الخروجين وتحليلهما كعينة واحدة (E3).
  8. تخلص من الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 40 ٪ ACN / 3 ٪ TFA ؛ 50٪ ACN / 6٪ TFA ، 200 mM كلوريد الصوديوم ؛ و 30٪ ACN / 0.1٪ TFA. الجمع بين هذه الاستهلالات وتحليلها كواحد (E4) بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
  9. قم بتكييف المادة إلى درجة الحموضة الأساسية باستخدام 200 ميكرولتر من 90٪ ACN / 2.5٪ NH4OH لمدة 3x. تخلص من هذه الغسيلات.
  10. قم بتمييع الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 60٪ ACN / 10٪ NH 4 OH (E5) و 40٪ ACN / 10٪ NH4OH (E6). قم بتحليل هذه التخفيضات بشكل منفصل بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
  11. قم بتمييع الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 20٪ ACN / 10٪ NH4OH. 10٪ ACN / 10٪ NH4OH; و 10٪ NH4OH. اجمع بين هذه التخدير وقم بتحليلها كواحدة (E7) بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
  12. تجفيف جميع الاستخلاصات تماما تحت فراغ.

6. كروماتوغرافيا السائل ذات التدفق النانوي المعكوس - قياس الطيف الكتلي (nRPLC-MS)

ملاحظة: طرق الحصول على بيانات MS وتحليلها متنوعة، وبالتالي يتم وصف خط أنابيب LC-MS مقترح واحد فقط (والمعلمات المرتبطة به) هنا في الخطوات التالية. يمكن تحليل العينات التي تم إنشاؤها باستخدام خطوات إعداد العينات وإثرائها المحددة سابقا باستخدام إعدادات مفيدة أخرى ، بما في ذلك استخدام أعمدة كروماتوغرافية متاحة تجاريا ، مع توفير جودة بيانات كافية.

  1. اسحب وعبئ شعيرة شعرية بطول 15 سم (قطر داخلي 75 ميكرومتر) باستخدام مادة C18 كما هو موضح في19. إعداد المرحلة المتنقلة A (0.1٪ FA في الماء) والمرحلة المتنقلة B (0.1٪ FA في ACN).
  2. إعادة تشكيل عينات الببتيد المخصب في 15 ميكرولتر من المرحلة المتنقلة 3٪ B. تحميل 2 ميكرولتر من العينة (~ 13٪ حجم العينة) مباشرة على العمود. تحليل كل عينة في نسخة فنية مكررة.
  3. الببتيدات الملوية باستخدام تدرج من 3٪ إلى 30٪ المرحلة المتنقلة B على مدى 90 دقيقة بمعدل تدفق 0.3 ميكرولتر / دقيقة. اغسل العمود باستخدام 75٪ B لمدة 8 دقائق متبوعا بنسبة 95٪ B لمدة 8 دقائق ، وأنهى الطريقة بتوازن عند 3٪ B لمدة 12 دقيقة.
  4. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الأيونات الموجبة باستخدام الحصول المعتمد على البيانات لأعلى 20 قمة مع المعلمات التالية: جهد الرش 2 كيلو فولت ؛ الكشف عن MS 1 في LC / MS من 400-2000 م / z بدقة 120000 ، هدف التحكم التلقائي في الكسب 2E5 (AGC) ، 100 مللي ثانية الحد الأقصى لوقت الحقن ، عدسة RF 30٪ ، عزل رباعي مع نافذة1.6 م / z ، لحالات الشحن 2-8 وغير محددة ، واستبعاد ديناميكي 30 ثانية ؛ اكتشاف MS 2 في LC / MS باستخدام تجزئة HCD المتدرجة بنسبة 22٪ و 30٪ و 38٪ ، والكتلة الأولى الثابتة 120 م / z بدقة 30000 ، وهدف 5E4 AGC ، ومتطلبات الحد الأدنى للكثافة 2.5E4.

7. تحليل بيانات التصلب المتعدد

ملاحظة: يتم عرض خط أنابيب واحد لتحليل البيانات باستخدام برنامجين مختلفين لتحليل نفس مجموعة البيانات هنا. يمكن البحث عن الفسفرة والغليكوزيل في نفس الوقت باستخدام برنامج واحد بدلا من برنامجين منفصلين كما هو موضح هنا ، على الرغم من أن وقت البحث عن البرامج يتناسب بشكل عام مع مساحة البحث ، أي عدد PTMs التي تم النظر فيها. لهذا السبب ، يتم استخدام برنامجين مختلفين بالتوازي مع البحث عن glycopeptides و phosphopeptides.

  1. معالجة ملفات البيانات الخام باستخدام البرنامج المناسب (انظر جدول المواد).
    1. ابحث في الأطياف مقابل قاعدة بيانات UniProt البشرية (أو الأنواع المناسبة الخاصة). تعيين كارباميدوميثيل من Cys كتعديل ثابت. اضبط الحد الأقصى لعدد الانقسامات الأنزيمية المفقودة على أنه اثنان.
  2. في ملفات البيانات الخام ، باستخدام برنامج تجاري (انظر جدول المواد) ، ابحث عن glycopeptides ليتم تحليلها20. استخدم تسامحا مع كتلة السلائف بمقدار 10 أجزاء في المليون وتسامحا مع كتلة شظايا 0.01 Da مع الحد الأدنى لطول الببتيد من أربعة بقايا.
    1. تم توسيع البحث باستخدام قاعدة بيانات N-glycan المضمنة في البرنامج باستخدام جليكان mannose-6-phosphate (M6P) النموذجي ، بما في ذلك HexNAc (2) Hex (4-9) Phospho (1-2) و HexNAc (3-4) Hex (4-9) Phospho (1-2) و HexNAc (2) Hex (3-4) Phospho (1) و HexNAc (3) Hex (3-4) Phospho (1).
    2. تعيين N-glycosylation كتعديل شائع. قم بتعيين الحد الأقصى للتعديلات الإجمالية لكل مطابقة طيفية للببتيد (PSM) كواحد شائع واثنين نادرين.
    3. قم بتعيين التعديلات المتغيرة التالية: أكسدة Met (نادرة) ، وإزالة الاستئصال في Asn و Gln (نادرة) ، والفسفرة في Ser و Thr و Tyr (شائعة). قم بتعيين عوامل تصفية التعريف التالية: قطع النتيجة > 150 ، |log prob| > 1 ، ودرجة دلتا وزارة الدفاع > 10.
    4. تصدير نتائج البحث وتحليلها في علامتي التبويب مجموعة البروتينات والببتيدات.
    5. فحص الهويات التي تحتوي على جليكان M6P يدويا لوجود أيون الأوكسونيوم PhosphoHex (243 m/z) في أطياف MS/MS وإزالة الهويات الإيجابية الخاطئة، التي لا تحتوي على هذا الأيون التشخيصي.
  3. في ملفات البيانات الخام ، باستخدام برنامج مفتوح المصدر (انظر جدول المواد) ، ابحث عن الببتيدات الفوسفاتية المراد تحليلها21. استخدم تسامحا مع ببتيد البحث الأول بمقدار 20 صفحة في الدقيقة وتسامحا مع ببتيد البحث الرئيسي بسرعة 4.5 جزء في المليون.
    1. اضبط الحد الأقصى لعدد التعديلات لكل ببتيد على 5. اضبط PSM ومعدل اكتشاف البروتين الخاطئ (FDR) على 1٪ والحد الأدنى لطول الببتيد إلى 7 بقايا.
    2. قم بتعيين تعديلات متغيرة مثل الأكسدة في Met ، و N-terminal protein acetylation ، والفسفرة في Ser و THR و Tyr. تحليل نتائج البحث باستخدام ملفات التعديلSpecificPeptides.
  4. تحديد عدد تحديدات PTMs على مستويات البروتين والببتيد وموقع التعديل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إيداع بيانات قياس الطيف الكتلي التمثيلية ، بما في ذلك الملفات الخام ونتائج البحث ، في اتحاد ProteomeXchange عبر مستودع شريك PRIDE مع معرف مجموعة البيانات PXD03306522.

في هذا العمل ، تم تحليل نسخ الحقن المكررة لكل عملية إثراء. وتم في التحليل النهائي تجميع الهويات التي تم إجراؤها من كلا النسختين التقنيتين. ونظرا للطبيعة شبه العشوائية للاقتناء المعتمد على البيانات في اختيار سلائف الببتيد لتجزئة التصلب المتعدد والتصلب المتعدد، يتوقع حدوث تداخل في تحديد الهوية يت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتعد استراتيجية Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة مفيدة للتحليل المتزامن للجليكوببتيدات N-glycopeptides والفوسفوببتيدات من نفس العينة في سير عمل إعداد عينة واحدة. كما ثبت أن الأساليب القائمة على ERLIC تؤدي التخصيب المتزامن ل PTMs. تم استخدام كلتا الاستراتيجيتين سابقا لتغطية عميقة في تحليلات PTM14,18. عند تكييف طريقة Ti المزدوجة لتقليل وقت حضانة العينات باستخدام أطراف الدوران ، نأمل أن يكون هذا البروتوكول قد أصبح أقل كثافة في استخدام الموارد ، وبالتالي يمكن الوصول إليه ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال تمويل منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01DK071801 و RF1AG052324 و P01CA250972 و R21AG065728) ومؤسسة أبحاث سكري الأحداث (1-PNF-2016-250-S-B و SRA-2016-168-S-B). كما تم الحصول على البيانات المقدمة هنا جزئيا من خلال دعم من جائزة NIH / NCATS UL1TR002373 من خلال معهد جامعة ويسكونسن للبحوث السريرية والانتقالية. تم شراء أدوات Orbitrap من خلال دعم منحة أدوات مشتركة من المعاهد الوطنية للصحة (NIH-NCRR S10RR029531) ومكتب نائب رئيس الجامعة للبحث والتعليم العالي في جامعة ويسكونسن ماديسون. ونود أيضا أن نشيد بالدعم السخي الذي قدمته منظمة التبرع بالأعضاء والأنسجة بجامعة ويسكونسن التي قدمت البنكرياس البشري للبحوث ومساعدة دان تريميل والدكتورة سارة دي ساكيت والبروفيسور جون أودوريكو لتوفير العينات لمختبرنا. يود فريق البحث لدينا تقديم شكر خاص للعائلات التي تبرعت بالأنسجة لهذه الدراسة. L.L. تعترف بمنحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD025084 ، وهي منحة تجريبية لسرطان البنكرياس من مركز سرطان كاربون بجامعة ويسكونسن (233-AAI9632) ، بالإضافة إلى أستاذية Vilas للإنجاز المتميز وأستاذية كرسي تشارلز ملبورن جونسون المتميز بتمويل مقدم من مؤسسة أبحاث خريجي ويسكونسن وكلية الصيدلة بجامعة ويسكونسن ماديسون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليك ، الجليدي (ACS معتمد)فيشر ساينتفيكA38S-500
الأسيتون (معتمد من ACS) فيشرScientificA18-1
أسيتونيتريل ، أوبتيما LC / MS درجةفيشر ScientificA955-4
أسيتات الأمونيوم (ACS بلوري / معتمد)فيشر ساينتفيكA637-500
هيدروكسيد الأمونيوم (معتمد من ACS Plus)برنامج Fisher ScientificA669-212
Byonicمقاييس البروتينn / aبرنامج تجاري يستخدم لتحليل الجلوكوبروتيوميك (https://proteinmetrics.com/byos/) مادة
C18 BEHالمياه186002353المواد التي تمت إزالتها من العمود وتستخدم لتعبئة الشعيرات الدموية النانوية (تم سحبها لدمج الطرف المستخدم مباشرة بما يتماشى مع مدخل الأداة)
CAE-Ti-IMAC ، 100٪J & amp K Scientific2749380-1Gالمواد المستخدمة في Ti (IV) -IMAC مزدوجة الوظيفة ؛ يمكن استخدامها أيضا لتخصيب IMAC التقليدي / الفوسفوببتيد التقليدي
مجموعة كسارة الخلاياكسارة Cellcrushern / aتستخدم لطحن عينات الأنسجة إلى مسحوق قبل الاستخراج
Eppendorf 5424R أجهزة الطرد المركزيالدقيقة فيشر Scientific05-401-205للطرد
المركزي الذي يتم التحكم في درجة حرارتهأقراص كوكتيل مثبطات البروتياز cOmpleteSigma11697498001
DTT ، درجة جزيئية (DL-Dithiothreitol)PromegaV3151عامل اختزال البروتين
الإيثانول ، 200 دليل (100٪) ، USPFisher22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex MixerFisher Scientific02-215-414
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الاحتباس من Fisherbrand (1.5 مل)فيشر ساينتفيك02-681-320
فيشربراند أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الاحتباس (2 مل) فيشرساينتفيك02-681-321
فيشربراند موديل 120 سونيك ديسميمبراتورفيشرFB120110للعينة لتحليل العينة باستخدام حمض الفورميك بالموجات فوق
، 99.0 +٪ ، أوبتيما LC / MS الصففيشر العلميA117-50
الشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة (75 و مو ؛ م القطر الداخلي ، 360 مو ؛ م القطر الخارجي)Polymicro Technologies LLC100 م TSP075375للأعمدة المسحوبة والمعبأة الداخلية مع باعث مدمج
حمض الهيدروفلوريك (48 بالوزن ٪ في H2< / sub>O)Sigma-Aldrich339261-100MLيستخدم لفتح باعث العمود الشعري المسحوب
Iodoacetamide ، BioUltraSigmaI1149-5Gكاشف تقليل البروتين
برنامج MaxQuantn / aغيربرنامج مجاني يستخدم لتحليل الفوسفوبروتينيوم (https://www.maxquant.org/) شاكر
متعدد الحرارة مع تدفئة وتبريدمعيار علميH5000-HCكتلة
تسخين واحة HLB 1 سم مكعب خرطوشة فولت تيار متردد ، 10 مجم مادة ماصة لكل خرطوشة ، 30 وميكرو ؛ م ، 100 / عبوةWaters186000383تحلية خرطوشة أكبر حجما للهضم التريبتيك (سعة تحميل تصل إلى 1 مجم لكل منها)
أطراف ماصة OMIX C18 ، 100 وميكرو ؛ طرف L ، 10 - 100 مو ؛ حجم الشطف L ، 1 × 96 طرفAgilentA57003100طرف ماصة معبأ أصغر حجما لتحلية المياه من أجل عمليات التخصيب
P-2000 Micropipette PullerSutter Instrument Co.P-2000 / Fلسحب الأعمدة الشعرية النانوية لأقراص
مثبطات الفوسفاتيز LC-MS PhosSTOP مجموعةSigma4906845001
Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
بيرس كمية فحص الببتيد اللونيةالحرارية فيشر العلمية23275
PolySAX LP (12 & mu ؛ م ، حجم المسام 300 Å ؛)مادة PolyLCBMSX1203لكروماتوغرافيا تبادل الأنيون القوية المستخدمة في تخصيب الجليكوببتيد التقليدي
/ ERLIC فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (بلوري / معتمد ACS) خليةمن فيشر ScientificP285-500
مع لوح تحريك مغناطيسي متكاملNext AdvancePC77-MAGلتعبئة الأعمدة الشعرية النانوية بمرحلة ثابتة تصل إلى حد
2500 رطل لكل بوصة مربعةبرنامج Proteome DiscovererThermo Fisher Scientificn / aبرنامج تجاري لتحليل البروتينات (مع عقد برامج البحث عن قواعد البيانات المتكاملة) وتصور البيانات (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
مكثف الفراغ SpeedVac SC110 موديل SC110-120n / Aلتجفيف العينات (تحت الحرارة)
محلول SDS ، محلول كبريتات دوديسيل الصوديوم بنسبة 10٪ ، البيولوجيا الجزيئية / الرحلان الكهربائيفيشر BP2436200
العلمي درجة التربسينPromegaV5111
كلوريد الصوديوم المعدل (بلوري / معتمد ACS)فيشر ScientificS271-500
توب تيب ، فارغ ، 10-200 & الميكرو ؛ L ، عبوة من 96Glygen CorporationTT2EMT.96طرف ماصة فارغ مع ثقب بحجم ميكرون مستخدم يمكن استخدامه لتعبئة المواد الكروماتوغرافية للتخصيب ، مرفقة مع محولات الأنبوب
عازلة بيكربونات ثلاثي إيثيل الأمونيوم (TEAB ، 1 م ، درجة الحموضة 8.5 (متطايرة))Sigma90360-100ML
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، درجة الكاشف ، 99٪فيشر Scientific60-017-61
قاعدة تريس (بلورات بيضاء أو مسحوق بلوري / بيولوجيا جزيئية)فيشر سيانتيفكBP152-500
تريبسين / ليس-سي ميكس ، درجة المواصفات الشاملPromegaV5071
اليوريا (معتمد من ACS) ماءفيشر ScientificU15-500
، Optima LC / MS GradeFisher ScientificW64
الصوتية متاح فحص البروتين حقن الضغط مكثف فراغ الطرد المركزي Savant التسلسل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
  2. Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
  3. Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387(2021).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90(2011).
  5. Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029(2020).
  7. Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
  8. Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
  9. Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
  10. Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
  11. Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
  12. Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
  13. Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
  14. Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
  15. Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
  16. Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
  17. Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
  18. Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
  19. Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380(2021).
  20. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
  21. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  22. Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
  23. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).
  24. Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
  25. Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
  26. Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
  27. Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438(2017).
  28. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  29. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010(2021).
  30. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  31. Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).
  32. Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

N

مقالات ذات صلة