يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63776

⸱

مارس 23, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Dermatology, The Pennsylvania State University College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

غالبا ما تتطلب دراسة التئام الجروح المرتبطة بالإصابة العضلية الهيكلية تقييم التفاعلات في المختبر بين خلايا شوان (SCs) والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية. يصف هذا البروتوكول عزل هذه الخلايا الأولية وزراعتها وتوصيف خصائصها من القلفة البشرية.

الملخص

يصف هذا البروتوكول طرق العزل ، وظروف الزراعة ، وتوصيف الخلايا الأولية البشرية ذات العائد العالي والجدوى باستخدام التفكك الأنزيمي السريع للبشرة. يتم حصاد الخلايا الكيراتينية الأولية والخلايا الليفية وخلايا شوان من القلفة البشرية حديثي الولادة، والتي تتوفر وفقا لإجراءات الرعاية القياسية. يتم تطهير الجلد الذي تمت إزالته ، ويتم إزالة الدهون والعضلات تحت الجلد باستخدام مشرط. تتكون الطريقة من الفصل الأنزيمي والميكانيكي لطبقات البشرة والجلد ، يليه هضم إنزيمي إضافي للحصول على معلقات أحادية الخلية من كل طبقة من طبقات الجلد هذه. وأخيرا، تزرع الخلايا المفردة في وسائط زراعة الخلايا المناسبة باتباع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية للحفاظ على النمو والبقاء على مدى أسابيع. معا ، يسمح هذا البروتوكول البسيط بعزل وزراعة وتوصيف جميع أنواع الخلايا الثلاثة من قطعة واحدة من الجلد لتقييم نماذج الجلد والأعصاب في المختبر . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الخلايا معا في الثقافات المشتركة لقياس آثارها على بعضها البعض واستجاباتها للصدمة في المختبر في شكل خدوش يتم إجراؤها آليا في الثقافة المرتبطة بالتئام الجروح.

المقدمة

الخلايا الأولية المشتقة من الأنسجة الحية والمستزرعة في ظل ظروف المختبر تشبه إلى حد كبير الحالة الفسيولوجية1 ، مما يجعلها نموذجا مثاليا للتحقيق في العمليات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. يحتوي الجلد على أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية والخلايا الخلوية والخلايا الصباغية وخلايا شوان (SCs) ، والتي يمكن عزلها وزراعتها لإجراء تجارب في المختبر. لم يتم وصف طرق عزل وزراعة الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs ، من قطعة واحدة من الجلد. الهدف من هذا البروتوكول ذو شقين: 1) إنشاء طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل وزراعة SCs الجلدية و 2) لاستخدام طريقة فعالة وقوية لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية و SCs من قلفة بشرية واحدة.

في الوقت الحاضر ، هناك بروتوكولات راسخة لعزل الخلايا الكيراتينية الجلدية2،3،4 والخلايا الليفية5،6. تصف هذه الدراسات عزل الخلايا الكيراتينية أو الخلايا الليفية أو كليهما عن الجلد ، ولكن لا يوجد بروتوكول يتناول كيفية إنشاء ثقافات SCs الأولية من جلد الإنسان. تشير الدراسات الحديثة إلى أن SCs العصبية تعدل العمليات الخلوية الكيراتينية والخلايا الليفية وتنظم الوظائف الفسيولوجية الطبيعية للجلد7. وبالتالي ، فإن SCs ضرورية لتوازن الجلد وتساهم بشكل كبير في تنظيم علم وظائف الأعضاء الذي يؤثر على سلوك أنواع خلايا الجلد المجاورة الموجودة8. لذلك ، فإن البروتوكول الذي يسمح بعزل كل نوع من أنواع الخلايا هذه مثالي للتجارب المختبرية التي تنطوي على اتصال بين الخلايا الخلوية أو التحدث المتبادل بين أنواع الخلايا.

يصف هذا البروتوكول إنشاء مزارع خلايا فردية للخلايا الأولية من قطعة واحدة من الجلد. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص عندما تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة. وعلاوة على ذلك، فإن عزل جميع أنواع الخلايا الثلاثة عن متبرع واحد يسمح بإجراء مقارنات قوية بين أنواع الخلايا أو تجارب الزراعة المشتركة مع التخفيف من تأثير علم الوراثة أثناء التجربة المطلوبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة اقتناء واستخدام أنسجة القلفة البشرية غير المحددة لأغراض البحث وتلقى تحديد "البحث غير البشري" من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب (IRB # 17574).

ملاحظة: باتباع البروتوكول أدناه، يتم الحصول على 2.4 × 10 6 خلايا كيراتينية، 4.4 × 10 6 خلايا ليفية، و1.1 × 106 SCs من قلفة واحدة. بشكل عام ، يمكن استخدام هذه الخلايا الأولية لمدة 3 مقاطع ، اعتمادا على الظروف التجريبية.

1. عزل الخلايا الأولية وظروف الزراعة

  1. إجراء فصل البشرة والأدمة
    1. الحصول على القلفة الوليدية وفقا لإجراءات الرعاية القياسية من قبل الطبيب بموجب البروتوكولات التنظيمية المعتمدة للمستشفى. يحدد الطبيب توقيت الختان بعد الولادة وكمية الجلد التي تمت إزالتها.
    2. ضع القلفة المستثناة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 8-10 مل من الوسط القاعدي للنسر المعدل (DMEM) من دولبيكو البارد ونقل القلفة على الفور إلى مختبر زراعة الخلايا لعزل الخلايا. شطف الجلد مرتين مع 20-25 مل من 1x دولبيكو العازلة بالفوسفات المالحة (DPBS) التي تحتوي على 1x مضاد حيوي / مضاد للفطريات.
      ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من صلاحية الخلايا، يجب وضع القلفة المستثناة عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة، ويجب حصاد الخلايا في غضون 24 ساعة.
    3. بعد الشطف في DPBS / المضادات الحيوية ، نقع القلفة في 25-30 مل من وسط DMEM القاعدي البارد المثلج لمدة 10-15 دقيقة في طبق زراعة الأنسجة 10 سم. قم بتنفيذ جميع خطوات المعالجة في غطاء محرك السيارة باستخدام تقنية معقمة.
    4. باستخدام مشرط ، قم بتقطيع القلفة بعناية مفتوحة وفضح الأدمة والأنسجة الدهنية تحت الجلد.
    5. قم بإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد باستخدام الملقط وشفرة المشرط والمقص حسب الحاجة. تخلص من الأنسجة الدهنية. قطع القلفة النظيفة إلى ثلاث إلى خمس قطع أصغر.
    6. انقل قطع الجلد إلى أنبوب مخروطي معقم يحتوي على 16-20 مل من وسط dispase-I/DMEM (4 ملغم/مل في الوسط القاعدي DMEM).
    7. اخلطي قطع الجلد في الأنبوب المخروطي عن طريق الانعكاس ، بشكل متقطع ، خلال أول 30 دقيقة من الحضانة مع dispase-I. ثم ضع الأنبوب المخروطي عند 4 درجات مئوية لمدة 16-18 ساعة ، مع مراعاة غمر قطع الجلد في dispase-I / media.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول Dispase-I قبل الإضافة مباشرة باستخدام وسط قاعدي DMEM بارد ، ويتم تصفيته باستخدام مصفاة 0.22 ميكرومتر ، ويتم الاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية.
    8. بعد الهضم بين عشية وضحاها مع dispase-I ، قم بإزالة قطع الجلد ووضعها على طبق جاف ومعقم وثقافي. قم بفتح كل قطعة من الجلد بحيث تلامس طبقة البشرة الخارجية طبق الثقافة.
    9. باستخدام مجموعتين من الملقط ، افصل البشرة بعناية عن الأدمة. ابدأ على حافة الأنسجة وقشر البشرة بعيدا عن الأدمة.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب فصل طبقة البشرة عن الأدمة ، فإن عملية الهضم dispase-I لم تكن كافية. خيارات استكشاف الأخطاء وإصلاحها: 1) إرجاع قطع الجلد إلى محلول dispase-I / DMEM واحتضانها لمدة 2-3 ساعات إضافية عند 4 درجات مئوية ؛ 2) ضع قطع الجلد في dispase-I / DMEM الطازجة واحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 2-3 ساعات أكثر.
    10. استخدم البشرة والأدمة المنفصلتين لعزل الخلايا الكيراتينية (البشرة) والخلايا الليفية وخلايا شوان (الأدمة).
      ملاحظة: اتبع الخطوات أدناه لمعرفة حالات عزل وزراعة أنواع معينة من الخلايا.
  2. عزل الخلايا الكيراتينية عن البشرة
    1. أضف 5 مل من محلول ملحي عازل HEPES (HBS) إلى طبق ثقافة 10 سم وأضف شظايا البشرة المنفصلة. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
    2. بعد حضانة HBS ، اجمع محلول HBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لتحييد التربسين (TNB) (جدول المواد) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واتركه جانبا.
    3. أضف 3 مل من محلول التربسين إلى شظايا البشرة. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    4. حرك شظايا البشرة بلطف باستخدام الملقط حتى يصبح محلول التربسين عكرا.
    5. أضف محلول التربسين/الخلايا الكيراتينية إلى أنبوب HBS وTNB المحتوي في الخطوة 1.2.2.
    6. بالنسبة لأي شظايا بشرة متبقية لم تذوب في عملية هضم التربسين الأولية ، أضف 3 مل من 0.25٪ من التربسين / حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وكرر الخطوتين 1.2.4 و 1.2.5.
    7. أضف 2 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى محلول التربسين / EDTA الذي يحتوي على أنابيب محلول HBS و TNB.
    8. جهاز طرد مركزي لأنبوب التجميع الذي يحتوي على HBS / TNB / trypsin والخلايا الكيراتينية عند 870 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    9. شفط السوبرناتانت وإعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من وسط النمو الكامل للخلايا الكيراتينية (جدول المواد).
    10. قم بتصفية تعليق الخلية بفلتر معقم 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل لإزالة الحطام.
    11. تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام جهاز متخصص لأخذ عينات الخلايا وتلوينها (جدول المواد) لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    12. لوحات زراعة البذور حسب الحاجة للتجارب. كثافة البذر الموصى بها هي ~ 45000 خلية / سم2.
    13. ضع لوحات الاستزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة يومين للسماح للخلايا الكيراتينية بالالتصاق بالطبق.
    14. بعد 2 أيام ، استنشاق أي خلايا غير ملتزمة. قم بتحديث وسائط زراعة الخلايا كل يومين حتى تصل الخلايا الكيراتينية إلى الالتقاء المطلوب لتجارب المرور أو المصب (50٪ -80٪ التقاء).
  3. عزل خلايا شوان (SCs) والخلايا الليفية من الأدمة
    1. قوارير T25 المغطاة مسبقا ببولي إل-ليسين (PLL، 0.01 ميكروغرام/ميكرولتر) باستخدام 5 مل من 1x DPBS. ضع القوارير المطلية مسبقا على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. اغسل مصفوفة طلاء PLL مرتين باستخدام 1x DPBS (5 مل).
      ملاحظة: يمكن تحضير قوارير T25 في وقت مبكر.
    2. شطف القطع المعزولة من الأدمة مع 5 مل من الوسط القاعدي DMEM.
    3. افرم الأدمة إلى قطع صغيرة بمقص أو مشرط.
    4. هضم الأدمة المفرومة مع 5 مل من الكولاجيناز (2 ملغ / مل في الوسط القاعدي DMEM) عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. قم بتفتيت الأدمة المفروم بلطف باستخدام طرف ماصة كل 30 دقيقة حتى تنفصل الأدمة تماما.
    5. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر. من الضروري تطبيق القوة الميكانيكية باستخدام حقنة 1 مل لتصفية التعليق بالكامل.
    6. قم بتخفيف تعليق الخلية المصفى باستخدام 5 مل من وسط DMEM الكامل (وسط DMEM القاعدي + 5٪ FBS + 1x من المضادات الحيوية) لوقف النشاط الأنزيمي للكولاجيناز.
    7. الطرد المركزي تعليق الخلية في 870 × غرام لمدة 5 دقائق في RT لتكوير الخلايا.
    8. من هذه الكريات الخلوية ، سيتم الحصول على كل من الخلايا الليفية و SCs. أعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من DMEM وسط كامل لتقسيم الخلايا (1 مل تعليق / أنبوب خلوي) وأجهزة الطرد المركزي عند 870 × g لمدة 5 دقائق في RT.
    9. بالنسبة لثقافة SCs، اتبع الخطوات 1.3.10-1.3.17 وبالنسبة لثقافة الخلايا الليفية، اتبع الخطوات 1.3.18-1.3.22.
    10. من الخطوة 1.3.8 ، استنشق السوبرناتانت. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط DMEM الكامل الطازج.
    11. تحديد عدد الخلايا وقابليتها للحياة.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام جهاز متخصص لأخذ عينات الخلايا وتلوينها (جدول المواد) لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    12. زرع قوارير T25 المغلفة مسبقا مع 5 مل من الخلايا المعاد تعليقها بكثافة 4.0 × 103 خلايا / مل. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 بين عشية وضحاها (~ 12-16 ساعة حضانة).
    13. بعد 16 ساعة ، تأكد من التصاق الخلية عن طريق الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x.
    14. قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة واغسل القارورة 3x ب 5 مل من 1x DPBS.
    15. أضف 5 مل من 10 ميكرومتر سيتوزين أرابينوسيد (عامل مضاد للانقسامات ، يقتل الخلايا الليفية) في وسط DMEM كامل. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
    16. استنشاق أرابينوسيد السيتوزين الذي يحتوي على وسط من القارورة. شطف قارورة 3x مع 5 مل من 1x DPBS.
    17. أعد ملء قارورة الاستزراع ب 5 مل من SCs وسط الاستزراع الكامل (جدول المواد) واحتضنها عند 37 درجة مئوية بوجود 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة. قم بتحديث وسط الثقافة الكامل في SC كل يومين حتى تصل SCs إلى 80٪ من الالتقاء.
    18. استنشاق السوبرناتانت من الطبقة الجلدية المنفصلة (الخطوة 1.3.8) وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 5 مل من الوسط الكامل للخلايا الليفية (وسط الخلايا القاعدية الليفية + 5٪ FBS + 1x مضاد حيوي).
    19. تحديد عدد الخلايا وصلاحية الخلية.
      ملاحظة: هنا ، تم استخدام جهاز متخصص لأخذ عينات الخلايا وتلوينها (جدول المواد) لتحديد عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    20. قم بلوحة الخلايا الليفية بكثافة خلية تبلغ 4.0 × 103 خلايا / مل في قوارير ثقافة T25 (غير مغلفة مسبقا) باستخدام 5 مل من الوسط الكامل للخلايا الليفية. احتضان عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 بين عشية وضحاها (~ 12-16 ساعة حضانة).
    21. بعد 16-24 ساعة ، تأكد من التصاق الخلية عن طريق الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x. استنشق الخلايا غير الملتصقة من القارورة واغسل القارورة مرتين ب 5 مل من 1x DPBS.
    22. أضف 5 مل من الخلايا الليفية الطازجة متوسطة كاملة واحتضنها عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة. قم بتحديث وسط الثقافة كل يومين حتى تصل الخلايا الليفية إلى الالتقاء المطلوب للمرور أو المقايسات النهائية (50٪ -80٪ التقاء).

2. التحقق من الخلايا الكيراتينية للبشرة ، SCs الجلدية وعلامة بروتين الخلايا الليفية عن طريق التألق المناعي

  1. اليوم 1- طبقة زجاجية لغرفة الشرائح وفصل الخلايا
    1. شرائح زجاجية من 4 غرف قبل التغليف بالكولاجين-I للخلايا الكيراتينية ، أو PLL ل SCs أو 1x DPBS فقط للخلايا الليفية (0.5 مل لكل بئر). تأكد من طلاء السطح بأكمله. احتضن شرائح الغرفة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الخلايا.
    2. بعد أن تصل الخلايا المستزرعة إلى التقاء 50٪ -80٪ ، اغسل القوارير ب 1x DPBS 3x (1 مل لكل بئر).
    3. افصل الخلايا الملتصقة بمحلول 5 مل من محلول التريبسين-EDTA (TE) بنسبة 0.25٪ عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 لمدة دقيقتين ، حتى تبدأ الخلايا في أن تصبح مستديرة. تصور انفصال الخلايا باستخدام الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x.
    4. بعد الحضانة ، انقل محلول TE الذي يحتوي على خلايا إلى أنبوب مخروطي مع مصل بقري جنيني 5 مل (FBS).
    5. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لتحييد التربسين (TNB) إلى قارورة الزرع ثم انقل المحتويات إلى أنبوب جهاز الطرد المركزي المذكور أعلاه (الخلايا التي تحتوي على TE و FBS). تصور انفصال الخلايا باستخدام الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x.
      ملاحظة: يمكن استخدام TNB أو FBS أو كليهما لتحييد نشاط التربسين.
    6. جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خلايا / TE / TNB عند 870 × g لمدة 5 دقائق. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب آخر وأعد تعليق حبيبة الخلية في وسط الثقافة الكامل المقابل. قياس صلاحية الخلية كما هو مذكور في الخطوة 1.2.11.
    7. شطف شرائح زجاج الغرفة المطلية مسبقا (الخطوة 2.1.1) مع 1x DPBS (1 مل لكل بئر) 3x.
    8. شبه جافة الشرائح داخل غطاء محرك السيارة والخلايا الكيراتينية البذور ، SCs ، أو الخلايا الليفية بكثافة مناسبة (30000 خلية / 0.5 مل / غرفة) في وسط مناسب كامل لزراعة الخلايا.
    9. احتضان شرائح الغرفة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق.
  2. اليوم 2- منع انزلاق زجاج الغرفة باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA) وحضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. استنشاق وسائط الخلية من شرائح الغرفة واغسل 3x مع 1 مل من 1x DPBS.
    2. إصلاح الخلايا الملتصقة مع 4٪ بارافورمالدهيد في 1x DPBS (1 مل لكل بئر) وحضانة لمدة 15 دقيقة في RT داخل غطاء زراعة الأنسجة.
    3. استنشاق 4٪ بارافورمالدهيد من شرائح الغرفة وغسل شرائح الغرفة 3x مع 1x DPBS (1 مل لكل بئر).
    4. تخلل أغشية الخلايا بنسبة 1٪ TritonX-100 في 1x DPBS (1 مل لكل بئر) وتحضن لمدة 15 دقيقة في RT.
    5. استنشق محلول الحجب من شرائح الغرفة ، واغسل 3x ب 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية ثم استطلع 1x DPBS من البئر.
    6. قم بحظر شرائح الغرفة بنسبة 5٪ BSA (0.5 مل لكل بئر) واحتضنها لمدة 45 دقيقة في RT.
    7. استنشق محلول الحجب من شرائح الغرفة ، واغسل 3x ب 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية لكل منها ثم استنشق 1x DPBS من البئر.
    8. تمييع الأجسام المضادة الأولية مع 5٪ BSA (0.2 مل لكل بئر) (تخفيفات الأجسام المضادة الأولية: خلايا الكيراتين: الجسم المضاد سيتوكيراتين الفأر 14 (1:100) و ، سيتوكيراتين 10 الأجسام المضادة (1:100) ؛ خلايا شوان: الجسم المضاد S100 الفأر (1:200) ، ومستقبلات عامل نمو الأعصاب الأرانب (p75-NTR) الأجسام المضادة (1:500) ؛ الخلايا الليفية: الجسم المضاد للأرنب vimentin (1:200) ، والفأر ألفا العضلات الملساء الأكتين (α-SMA) الجسم المضاد (1:200)).
    9. أضف الأجسام المضادة الأولية إلى الخلايا المقابلة على شريحة زجاج الغرفة واحتضنها لمدة 15-16 ساعة (بين عشية وضحاها) عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    10. استنشاق الأجسام المضادة الأولية من شرائح الغرفة ، واغسلها 3 مرات باستخدام 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية لكل منها ثم استنشق 1x DPBS من البئر.
    11. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للأرانب IgG الأجسام المضادة الثانوية - Alexa Fluor 488 (1:500) والماعز المضاد للفأر IgG الأجسام المضادة الثانوية - Alexa Fluor 594 (1:500)) مع 0.5٪ BSA. أضف الجسم المضاد الثانوي المناسب إلى كل بئر (0.2 مل لكل بئر). احتضن لمدة 45 دقيقة في RT.
    12. استنشق الجسم المضاد الثانوي من شرائح الغرفة ، واغسل 3x مع 1x DPBS (1 مل لكل بئر) لمدة 30 ثانية لكل منهما ثم استطلع 1x DBPS من البئر.
    13. قم بإزالة الحشية الموجودة على شريحة الغرفة المكونة من 4 آبار باستخدام مزيل الحشية. حاول ألا تترك أي مادة لاصقة على الشريحة لأن هذا يتداخل مع تطبيق الغطاء الزجاجي. أضف قطرة من وسط التركيب مع 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). بدلا من ذلك ، قم بتلطيخ الآبار باستخدام DAPI واستخدام وسيط تركيب غير محتو على الملصقات.
    14. ضع الغطاء بعناية على الشريحة الزجاجية عن طريق تجنب فقاعات الهواء وأغلق نهاية الغطاء بالغراء. راقب أنماط تلطيخ التألق المناعي عن طريق الفحص المجهري (جدول المواد) عند تكبير 10x و / أو 20x.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام القلفة الطبيعية لحديثي الولادة لعزل الخلايا الكيراتينية الأولية للبشرة و SCs الجلدية والخلايا الليفية. تم استزراع الخلايا الأولية المعزولة في وسائط زراعة الخلايا ذات الصلة التي تحتوي على عوامل النمو. بعد بذر SCs والخلايا الليفية في قوارير الثقافة ، التزمت معظم الخلايا بقاع القارورة في غضون 2 ساعة. في حالة الخلايا الكيراتينية ، التزمت معظم الخلايا الكيراتينية بمقدار 24 ساعة. وصلت الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة للبشرة إلى 85٪ من الالتقاء بحلول اليوم 7 وأظهرت مورفولوجيا خلية مميزة (شكل حصاة) (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل ثلاث مجموعات خلايا متميزة من قطعة واحدة من القلفة ، وهي الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية وخلايا شوان. هناك عدد قليل من بروتوكولات العزل المتاحة لعزل الخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية2،3،5،6 ، ولكن لا شيء يصف عزل SC. بصرف النظر عن الخلايا الهيكلية الرئيسية في الجلد والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية ، فإن الجلد أيضا معصب للغاية من خلال الهياكل الحسية و الف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين الآخرين أنه ليس لديهم مصالح مالية منافسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر الدكتورة فادية كمال والدكتور رياض البربري على السماح لنا باستخدام الأدوات المخبرية والدعم الفني. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (K08 AR060164-01A) ووزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0725) إلى J. C. E. بالإضافة إلى الدعم المؤسسي من مركز هيرشي الطبي بجامعة ولاية بنسلفانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ مرشحات معقمة M (وحدة تصفية حقنة Millex-GP ، بولي إيثر سلفون)MilliporeSigmaSLGPR33RS
70 & micro ؛ مصافي الخلاياM CELLTREAT229483
100 & micro; مصافي الخلايا MCELLTREAT229485
1 مل محاقن يمكن التخلصBD Luer-LokBD-309659
5 مل محاقن يمكن التخلص منها (حقنة معقمة ، تستخدم مرة واحدة)BD Luer-LokBD309646
10 مل محاقن يمكن التخلص منهاBD Luer-LokBD305462
1٪ TritonX-100SigmaX100-1Lمحضرة وقت الاستخدام
4٪ محلول بارافورمالدهايدThermoFisher ScientificJ19943. K2جاهز للاستخدام والتخزين عند 4 درجات ؛ C
5٪ BSASigmaA7906-100Gمحضر في وقت الاستخدام
70٪ إيثانولفارمكو111000200
مضاد حيويScienCell Research503
Chemometec Vial1-CassetteFisher ScientificNC1420193
CollagenaseGibco17018-029
CoverslipFisherbrand12544D 22 * 50-1.5
Dispase ISigma-AldrichD46693
DMEM المتوسط القاعديScienCell Research9221
ملحي Dulbecco المخزن بالفوسفات خال من Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> (DPBS) Corning& nbsp ؛ 21-031-CV)
Nunc 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلينThermoFisher Scientific339651
Nunc 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادةالبولي بروبيلين ThermoFisher Scientific339653
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةFisherbrand02-681-5
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ThermoFisher Scientific10082147
الليفية المتوسطة الكاملةScienCell Research2331
الماعز المضادة للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 594InvitrogenA11032التخفيف (1: 500)
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 488InvitrogenA11008التخفيف (1: 500) محلول
ملحي مخزن هانكس (HBSS عازلة)LonzaCC-5022
القلفةغير المحددة أنسجة القلفة البشرية لأغراض البحث (مجلس المراجعة المؤسسية - IRB # 17574).
وسط الخلايا الكيراتينية KGM-GOLD (KGM gold والمكملات الغذائية)Lonza00192151 and 00192152
الفأر الجسم المضاد للأكتين العضلات الملساء ألفاThermoFisher Scientific14-9760-82التخفيف (1: 200)
الفأر السيتوكيراتين 14 الجسم المضادAbcamab7800التخفيف (1:100)
المضاد للفأر S100ThermoFisher ScientificMA5-12969التخفيف (1:200)
متعدد الغرف (4 شرائح زجاجية جيدة)Tab-Tek154526
NucleoCounter -Via 1-CassetteChemometec941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)ScienCell Research32503
ProLong Gold المضاد للبهتان مع DAPIInvitrogenP36935
الأرنب K10 الأجسام المضادةسيجما-ألدريتشSAB4501656التخفيف (1:100)
أرنب p75-NTR الجسم المضادMilliporeAB1554التخفيف (1: 500)
أرنب vimentinProteinTech10366-1-APالتخفيف (1: 200)
زراعة خلايا Schwann وسطScienCell Research1701
ملاقط دقيقة DUMONT مباشرة مع أطراف دقيقة إضافية Dumostar ، 5ROTHLH75.1تعقيم ب 70٪ كحول قبل الاستخدام
مقص قزحية العين ، حاد / حاد. الطول 4 &ndash ؛ 3/8 بوصة (111 مم)كودمان54-6500تعقيم ب 70٪ كحول قبل الاستخدام
شفرة جراحية معقمة - حادة (شفرات Duro Edge Economy أحادية الحافة شفرات شفرة حلاقة94-0120تعقيم ب 70٪ كحول قبل الاستخدام
قارورة ثقافة T25Corning353109
عازلة تحييد التربسين (TNS)LonzaCC-5002
Trypsin / EDTALonzaCC-5012
مجهر مقلوبZEISSAxio Observer 7- Axiocam 506 أحادي & ndash ؛ مجهر Apotome.2للتألق المناعي لشريحة الغرفة التي تحتوي على خلايا ملطخة
مجهر مقلوبZEISSPrimovertلرؤية / مراقبة ارتباط الخلية أو انفصالها
منها محلول الخلايا البشرية الجسم

المراجع

  1. Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
  2. Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
  3. Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
  4. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  5. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033(2010).
  6. Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629(2020).
  7. Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
  8. Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
  9. Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
  10. Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487(2015).
  11. Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
  12. Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
  13. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  14. Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442(2020).
  15. Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
  16. Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل وزراعة وتوصيف خلايا شوان الأولية والخلايا الكيراتينية والخلايا الليفية من القلفة البشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.