يهدف هذا البروتوكول إلى توفير إجراءات مفصلة لجمع وتثبيت وصيانة عينات النباتات المتغايرة ، وتطبيق تقنيات الفحص المجهري المختلفة مثل المسح المجهري الإلكتروني ونقله ، والمجهر الضوئي ، والكونفوكال ، والمجهر الفلوري لدراسة الاستعمار الفطري في الأنسجة النباتية والبذور المنبتة بالفطريات الفطرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنيات الفحص المجهري لتفسير الاستعمار الفطري في أنسجة النباتات المتغايرة والإنبات التكافلي للبذور
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علم النبات الهيكلي هو منظور لا غنى عنه لفهم كامل للبيئة وعلم وظائف الأعضاء والتنمية وتطور النباتات. عند البحث في النباتات المتغايرة (أي النباتات التي تحصل على الكربون من الفطريات) ، يمكن للجوانب الرائعة من تكيفاتها الهيكلية ، وأنماط استعمار الأنسجة بواسطة الفطريات ، والتشريح المورفوغرافي للأعضاء الجوفية أن تنير استراتيجياتها التنموية وعلاقاتها مع hyphae ، مصدر العناصر الغذائية. دور مهم آخر للفطريات التكافلية يرتبط بإنبات بذور السحلية. جميع أنواع Orchidaceae هي mycoheterotrophic أثناء مرحلة الإنبات والشتلات (المتفطرة الأولية) ، حتى تلك التي تقوم بعملية التمثيل الضوئي في مراحل البالغين. بسبب نقص الاحتياطيات الغذائية في بذور السحلية ، فإن التكافل الفطري ضروري لتوفير الركائز وتمكين الإنبات. يمكن أن يجيب تحليل مراحل الإنبات من خلال وجهات النظر الهيكلية أيضا على أسئلة مهمة تتعلق بتفاعل الفطريات مع البذور. يمكن تطبيق تقنيات تصوير مختلفة للكشف عن النباتات الداخلية للفطريات في الأنسجة النباتية ، كما هو مقترح في هذه المقالة. يمكن تلطيخ الأجزاء اليدوية والرقيقة من الأعضاء النباتية ثم ملاحظتها باستخدام المجهر الخفيف. يمكن تطبيق الفلوروكروم المترافق مع أجغلوتينين جنين القمح على الفطريات واحتضانه مع Calcofluor White لتسليط الضوء على جدران الخلايا النباتية في المجهر البؤري. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تفصيل منهجيات المسح المجهري الإلكتروني ونقله لبساتين الفاكهة المتغايرة ، ويتم استكشاف إمكانيات تطبيق هذه البروتوكولات في النباتات ذات الصلة. يتم وصف الإنبات التكافلي لبذور السحلية (أي في وجود الفطريات الفطرية) في البروتوكول بالتفصيل ، إلى جانب إمكانيات إعداد الهياكل التي تم الحصول عليها من مراحل مختلفة من الإنبات للتحليل باستخدام المجهر الضوئي والمشبك والإلكتروني.
المقدمة
البحوث الهيكلية في علم النبات ، والتي تغطي مورفولوجيا النبات والتشريح ، أساسية في فهم الكائن الحي بأكمله1،2 ، وتوفر وجهات نظر لا غنى عنها لدمج والمساهمة في المعرفة المتعلقة بالبيئة وعلم وظائف الأعضاء والتنمية وتطور النباتات3. تشمل الطرق في مورفولوجيا النبات والتشريح حاليا البروتوكولات والمعدات والمعرفة التي تم تطويرها مؤخرا وكذلك منذ أكثر من قرن من الزمان2. إن التنفيذ المستمر والتكيف مع الأساليب الكلاسيكية (مثل المجهر الضوئي) جنبا إلى جنب مع التقنيات الحديثة (مثل المجهر البؤري ، التصوير المقطعي المصغر بالأشعة السينية) لها نفس الأساس الأساسي: المعرفة النظرية التي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. جمع العينات وتثبيتها وصيانتها
ملاحظة: يمكن العثور على نباتات MH بالكامل عادة في الغابة المظلمة تحت الأرض 12,13 ، خاصة في المناطق الرطبة والوفيرة بالقمامة ، في حين يمكن العثور على نباتات MH جزئيا في الغابات الأكثر انفتاحا 12,13. عادة ما تحتوي نباتات MH على أعضاء جوفية متطورة في مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام.
- عند جمع أنواع MH ، استكشف التربة حول قاعدة النبات ، مع الحرص على عدم إتلاف الأعضاء تحت الأرض ، وتجنب سحب النباتات من الأرض لمنع فصل الأعضاء الهوائية عن الأعضاء الجوفية.
- حفر بعنا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد المراحل الأساسية لتثبيت الأنسجة النباتية ينتج هياكل خلوية مشابهة قدر الإمكان للحالة الحية ، مع الأخذ في الاعتبار مورفولوجيا المكونات والأنسجة الخلوية وحجمها وتنظيمها المكاني16. لاحظ هذه السمات في العينات بعد التثبيت الكيميائي (الشكل 4). يمثل الشكل 4C-F عينات ثابتة بشكل كاف تحت المجهر الضوئي. يساعد اتباع إجراءات التثبيت الموصوفة واكتساب الإلمام ببنية العينات في تحليل نجاح التثبيت.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتمتع تحليلات الصور في تشريح النبات ومورفولوجيا بإمكانات مهمة لتحقيق الأهداف والمساعدة في فهم العلاقات بين النباتات المتغايرة والنباتات الداخلية الفطرية التي لا غنى عنها ، كما يتضح من دراسات الأعضاء الجوفية 6,40 ، والتحليلات الهيكلية للإنبات التكافلي للبذور39 ، والهياكل الهوائية والتناسلية 41 . علم النبات الهيكلي ، على الرغم من أنه فقد مكانته ومساحته في مجالات أخرى من علوم النبات في العقد الماضي1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون التمويل المقدم من FAEPEX و FAPESP (2015/26479-6). يشكر MPP Capes على منحة درجة الماجستير (العملية 88887.600591/2021-00) و CNPq. JLSM يشكر CNPq على منح الإنتاجية (303664/2020-7). ويشكر المؤلفون أيضا الوصول إلى المعدات والمساعدة التي يقدمها مختبر المجهر الإلكتروني - IB/Unicamp)، والمعهد الوطني للعلوم والتكنولوجيا في مجال الضوئيات المطبقة على بيولوجيا الخلية - Unicamp)، ومختبر بيولوجيا الأوعية الدموية - DBEF/IB/Unicamp)؛ LAMEB (UFSC) وإليانا دي ميديروس أوليفيرا (UFSC) للمساهمات في بروتوكول الحماية من التبريد ؛ LME للمساهمات في بروتوكول TEM.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأسيتون | سيجما ألدريتش | 179124 | (لتركيب بذرة SEM) أجار |
| أجار (AA) | سيجما ألدريتش | A1296 | (لاختبارات إنبات البذور) صبغة |
| الكالكوفلورية البيضاء | سيجما ألدريتش | 18909 | (تكتشف السليلوز) |
| محلول عازلة السترات ، 0.09 م درجة حموضة 4.8 | سيجما ألدريتش | C2488 | (لتلوين التلويد الأزرق O) |
| شريط الكربون الموصل على الوجهين | فيشر Scientific | 50-285-81 | (ل SEM) |
| المجهر متحد البؤر | Zeiss | (أي نموذج) | |
| شبكات النحاس | Sigma-Aldrich | G4776 | (ل TEM) |
| مجفف النقطة الحرجة | Balzers | (أي نموذج) | |
| Cryostat | Leica Biosystems | (أي نموذج) | |
| مجهر تشريح | Leica Biosystems | (= مجهر مجسم ، أي نموذج) | |
| Entellan | Sigma-Aldrich | 107960 | وسيط تركيب سريع للفحص المجهري |
| الكحول الإيثيلي ، نقي (& ge ؛ 99.5٪) | Sigma-Aldrich | 459836 | (= الإيثانول ، لعمليات الجفاف) |
| محلول الفورمالديهايد ، 37٪ | سيجما ألدريتش | 252549 | (لتحضير محلول NBF) محلول |
| فورمالين ، مخزن محايد ، 10٪ | سيجما ألدريتش | HT501128 | المثبتة للأنسجة |
| النسيجية ل TEM | Fisher Scientific | 50-248-71 | (لبلمرة الراتنج في TEM) |
| محلول الجيلاتين ، 2٪ في H2< / sub>O | Sigma-Aldrich | G1393 | (مخفف لتحضير الشرائح - الالتصاق ب OCT) |
| محلول الجلوتارالديهايد ، 25٪ | سيجما-ألدريتش | G6257 | (لكارنوفسكي إعداد الحل s) |
| HistoResin | Leica Biosystems | 14702231731 | مجموعة تضمين الجليكول ميثاكريلات (GMA) |
| اليود | سيجما ألدريتش | 207772 | (لتحضير محلول Lugol) |
| نترات الرصاص (II) | سيجما ألدريتش | 228621 | الرصاص (NO 3< / sub>) 2< / sub > (لتلوين التباين TEM) |
| المجهر الخفيف | أوليمبوس | (أي نموذج) | |
| راتنج أكريليك أبيض LR | Sigma-Aldrich | L9774 | راتنج أكريليك محب للماء لمحلول TEM |
| Lugol | Sigma-Aldrich | 62650 | (للتلوين) |
| بذرة معدنية لحوامل العينة | Rave Scientific | (ل SEM ، نماذج مختلفة) | |
| Microtome | Leica Biosystems | يدوي ميكروتوم دوار أو نموذج آخر | |
| أجار دقيق الشوفان (OMA) | Millipore | O3506 | (لاختبارات إنبات البذور) |
| مركب OCT ، Tissue-Tek | Sakura Finetek USA | 4583 | التضمين للأنسجة المجمدة رابع |
| أكسيد الأوزميوم | Sigma-Aldrich | 201030 | OsO4< / sub> (لتثبيت TEM) Parafilm |
| M | Sigma-Aldrich | P7793 | ختم فيلم |
| اللدائن الحراريةParaformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | (لكارنوفسكي" تحضير الحل) |
| محلول بولي إل ليسين ، 0.1 ٪ في H2< / sub > O | Sigma-Aldrich | P8920 | (لإعداد الشرائح - الالتزام ب OCT) |
| شرائح بولي الإعدادية | Sigma-Aldrich | P0425 | زجاجية مطلية بالبولي |
| إيثيلين صواني كأس | البولي إيثيلين Polysciences | 17177A-3 | (6 × 8 × 5 مم ، لتضمين العينات في راتنج GMA) |
| البولي إيثيلين صواني الأكواب | Polysciences | 17177C-3 | (13x19x5 مم ، لتضمين العينات في راتنج GMA) |
| يوديد البوتاسيوم | سيجما ألدريتش | 221945 | (لتحضير محلول Lugol) |
| سكر العنب البطاطس أجار (PDA) | Millipore | 70139 | (لاختبارات إنبات البذور) المجهر |
| الإلكتروني الماسح | Jeol | (أي نموذج) | |
| Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] | Sigma-Aldrich | A3648 | (لإعداد الشرائح - الالتزام ب OCT) شرائح |
| Silane-Prep | Sigma-Aldrich | S4651 | الشرائح الزجاجية المطلية ببرتقالي سيلان |
| هلام السيليكا ، حبيبات | Supelco | 10087 | (لعمليات التجفيف) |
| كاكوديلات الصوديوم ثلاثي هيدرات | سيجما-ألدريتش | C0250 | (للجلوتارالديهايد - كاكوديلات الصوديوم) |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S5881 | هيدروكسيد الصوديوم (لكارنوفسكي تحضير المحلول وتلوين تباين TEM) |
| محلول هيبوكلوريت الصوديوم | سيجما ألدريتش | 425044 | كلوريد الصوديوم (لتطهير سطح البذور) |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ، اللامائي | سيجما ألدريتش | 71640 | Na 2< / sub>HPO4< / sub> (لمحلول NBF وإعداد PB) |
| هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | سيجما-ألدريتش | S9638 | NaH2PO4· H2< / sub>O (ل NBF و PB) |
| مغطي الاخرق | Balzers | (أي نموذج) | |
| السكروز | سيجما ألدريتش | S0389 | C12< / sub>H22< / sub>O11< / sub> (للحماية من التبريد واختبار الإنبات) |
| السودان الثالث | سيجما ألدريتش | S4131 | (للتلوين) |
| السودان الرابع | سيجما ألدريتش | 198102 | (للتلطيخ) |
| Sudan Black B | Sigma-Aldrich | 199664 | (للتلوين) |
| حقنة | (3 مل ، أي علامة تجارية ، لتلوين التباين TEM) | ||
| وحدة فلتر الحقنة ، Millex-GV 0.22 & micro ؛ م | ميليبور | SLGV033R | PVDF ، 33 مم ، معقم جاما (لتلوين التباين TEM) |
| Tek Bond Super Glue 793 | Tek Bond Saint-Gobain | 78072720018 | لاصق سيانوا أكريليت سائل ، لزوجة متوسطة |
| تولويدين بلو O | Sigma-Aldrich | T3260 | (للتلطيخ) مجهر |
| إلكتروني ناقل الحركة | Jeol | (أي نموذج) | |
| Triphenyltetrazolium كلوريد | سيجما ألدريتش | T8877 | (لاختبار تيترازوليوم في إنبات البذور) ثلاثي |
| سترات الصوديوم ثنائي هيدرات | سيجما-ألدريتش | S1804 | Na 3< / sub> (C6< / sub>H5< / sub>O7< / sub>) & middot ؛ 2H 2 < / sub >O (لتلوين تباين TEM) |
| Ultramicrotome | Leica Biosystems | (أي نموذج) | |
| أسيتات اليورانيل | فيشر Scientific | 18-607-645 | UO 2< / sub> (CH3< / sub>COO) 2< / sub> (لتلوين تباين TEM) مضخة |
| فراغ | (أي نموذج) | ||
| جنين القمح Agglutinin ، Alexa Fluor 488 Conrupgate | TermoFisher Scientific | W11261 | الليكتين المترافق بالصبغة الفلورية (يكتشف بقايا حمض السياليك و N-acetylglucosaminyl) |
المراجع
- Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Sprin....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
