التقنيات الجزيئية والمناعية في نموذج فأر مهندس وراثيا لورم الجهاز الهضمي اللثوي

Summary

الهدف من هذه المخطوطة هو وصف نموذج الماوس Kit^V558Δ/+ وتقنيات التشريح والمعالجة الناجحة لعينات الماوس.

Abstract

الورم اللحمي المعدي المعوي (GIST) هو الساركوما البشرية الأكثر شيوعا وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مستقبلات KIT. عبر أنواع الأورام ، تم تطوير العديد من نماذج الفئران من أجل التحقيق في الجيل التالي من علاجات السرطان. ومع ذلك ، في GIST ، تستخدم معظم الدراسات في الجسم الحي نماذج فأر xenograft التي لها قيود متأصلة. هنا ، نصف نموذجا للفأر المختص بالمناعة والمعدل وراثيا لورم لحمية الجهاز الهضمي يؤوي طفرة Kit^{V558Δ /} +. في هذا النموذج ، يتم دفع KIT المتحور ، وهو الجين الورمي المسؤول عن معظم GISTs ، بواسطة مروجه الداخلي مما يؤدي إلى GIST الذي يحاكي المظهر النسيجي والتسلل المناعي الذي شوهد في GISTs البشرية. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا النموذج بنجاح للتحقيق في كل من العلاجات الجزيئية والمناعية المستهدفة. هنا ، نصف تربية وصيانة مستعمرة الفأر Kit^{V558Δ /} +. بالإضافة إلى ذلك ، تفصل هذه الورقة علاج وشراء GIST ، وتصريف العقدة الليمفاوية المساريقية ، والأعور المجاور في الفئران Kit^{V558Δ / +} ، بالإضافة إلى إعداد العينات للتحليلات الجزيئية والمناعية.

Introduction

GIST هو الساركوما الأكثر شيوعا في البشر مع حدوث حوالي 6000 حالة في الولايات المتحدة الأمريكية¹. يبدو أن GIST ينشأ من خلايا تنظيم ضربات القلب المعدية المعوية المسماة الخلايا الخلالية في Cajal ، وعادة ما يكون مدفوعا بطفرة واحدة في مجموعة التيروزين كيناز أو PDGFRA². الجراحة هي الدعامة الأساسية لعلاج GIST ويمكن أن تكون علاجية ، ولكن يمكن علاج المرضى الذين يعانون من مرض متقدم باستخدام مثبط التيروزين كيناز (TKI) ، إيماتينيب. منذ تقديمه منذ أكثر من 20 عاما ، قام imatinib بتحويل نموذج العلاج في GIST ، مما أدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة في الأمراض المتقدمة من 1 إلى أكثر من 5 سنوا....

Protocol

تم إيواء جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض في جامعة بنسلفانيا وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة وبموافقة جامعة بنسلفانيا IACUC. تم تنفيذ القتل الرحيم وفقا لإجراءات التشغيل القياسية للموارد الحيوانية في مختبر جامعة بنسلفانيا.

1. كيت^{V558Δ / +} تربية الماوس

1. قم بإرجاع الفئران^V558Δ/+ أكثر من 10 مرات على خلفية C57BL/6J باستخدام الفئران C57BL/6J. للقيام بذلك ، قم بتربية الفئران الذكور ^{V558Δ / +} مع الفئران C57BL / 6J الإناث بنسبة 1: 2.
   ملاحظة: النمط الوراثي لمجموعة متماثلة الزيجوت V558 Δ^/V558Δ ....

Results

يسمح نموذج الماوس Kit^V558Δ/+ بالتحقيق في العلاجات في نموذج الماوس المناعي. يبلغ متوسط عمر الفئران ^V558Δ/+ 8 أشهر بسبب انسداد الأمعاء التدريجي (الشكل 4). الأورام من Kit^{V558Δ / +} الفئران تعبر عن العلامات القانونية ل GIST بما في ذلك مجموعة التيروزين كيناز والقناة عبر الغشاء DOG1 (الشكل 5) ، وكذلك عامل النسخ ETV1 (غير معروض). يمكن دراسة الأ.......

Discussion

يعد نموذج الماوس Kit^V558Δ/+ أداة بحث قوية في التحليل الجزيئي والمناعي ل GIST. على الرغم من أن استراتيجية التربية تتطلب صليبا واحدا ، إلا أن استخدام مجموعات الفئران ^{Kit V558Δ / +} في التجارب التي تحلل استجابة الورم يتطلب تربية واسعة النطاق. يجب أن تكون الفئران متطابقة مع العمر والجنس لضمان أوزان الورم المماثلة ، وتموت 10٪ من الفئران قبل 8 أسابيع من العمر عند إنشاء الأورام. استراتيجيات تربية أقل شمولا ممكنة إذا استخدمت تقنيات تصوير متقدمة مثل التصوير المقطعي المحوسب أو التصوير بالرنين.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مرشح 100 ميكرون	EMSCO	1194-2360
1x مخزن مؤقت تحلل كرات الدم الحمراء	Life Technologies	00-4333-57
حقنة 3 مل	Thermo Fisher Scientific / BD Biosciences	14823435
4 & ndash ؛ 15٪ جل بروتين صغير PROTEAN TGX مسبقة الصب ، 10 بئر ، 30 وميكرو ؛ ل	Bio-Rad	4561083
4٪ محلول بارافورمالدهايد	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 ميكرون مرشح	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
مرشح 70 ميكرون	EMSCO	1194-2350
AKT الأجسام المضادة (C67E7)	إشارات الخلية	4691
C57BL / 6J الفئران	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
مثبط البروتياز المصغر الكامل الخالي	من EDTA توماس Scientific	C852A34
الكونتيسة الثانية عداد الخلايا الآلي	Thermo Fisher Scientific
	Thermal Fisher Thermal Fisher Scientific Thermal Fisher Scientific / Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 الجسم المضاد	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK الجسم المضاد (p44 / 42)	إشارات الخلية	9102
FBS	توماس Scientific	C788U23
برنامج FIJI			https://imagej.net/software/fiji
فيشربراند 850 الخالط	الحراري فيشر العلمي	15-340-169
HBSS	مركز
إيماتينيب ميسيلات	سيليك للكيماويات	S1026
KIT الجسم المضاد (D13A2)	إشارات الخلية	3074
KitV558 & دلتا ؛ /+ التنميط الجيني	Transnetyx
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.5 مل)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit ،	مختبرات النواقلات	BMK-2202
غشاء النيتروسليلوز ، Precut ، 0.45 & micro ؛ m	Rio-Rad	1620145
الحليب الجاف الخالي من الدسم	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 بديل	سيجما ألدريتش	74385
الجسم المضاد p-AKT (S473)	الخلية	4060
الجسم المضاد p-ERK (p44 / 42)	إشارات الخلية	9101
الجسم المضاد p-KIT (Y719)	الخلية	3391
PMSF مثبط البروتياز	الحراري فيشر العلمي	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
اختبار البوليسترين المستدير القاع (FACS) أنابيب	Falcon / Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	مركز
فلوريد الصوديوم (NaF)	سيجما ألدريتش	201154
أورثوفاناديت الصوديوم (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	طبق زراعة الأنسجة بجامعة بنسلفانيا
100 مم 2)	ثيرمو فيشر ساینتينفيك / فالكون	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
منصة vivaCT 80	Scanco الطبية