يصف هذا البروتوكول عملية توليد وتوصيف المواد العضوية البولية الفئران التي تؤوي عمليات حذف في الجينات ذات الاهتمام. وتشمل الطرق حصاد الخلايا البولية الثيلية للفئران ، والنقل خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي الذي يقود تعبير Cre مع مروج CMV ، وفي المختبر وكذلك في توصيف الجسم الحي .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
السابقين فيفو النموذج العضوي لحذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في خلايا الفأر البولية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
سرطان المثانة هو مجال غير مدروس ، خاصة في نماذج الفئران المهندسة وراثيا (GEMMs). كانت GEMMs المولودة مع مواقع Cre و loxP الخاصة بالأنسجة هي المعايير الذهبية لاستهداف الجينات المشروطة أو المستحثة. لتوفير نماذج تجريبية أسرع وأكثر كفاءة ، تم تطوير نظام زراعة عضوي خارج الجسم الحي باستخدام الفيروس الغدي Cre والخلايا البولية الطبيعية التي تحمل أليلات loxP متعددة من مثبطات الورم Trp53 و Pten و Rb1. يتم فصل الخلايا البولية الطبيعية إنزيميا عن أربع مثانات من الفئران الثلاثية المفلطحة (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). يتم نقل الخلايا البولية خارج الجسم الحي مع الفيروس الغدي-Cre مدفوعا بمروج CMV (Ad5CMVCre). يتم استزراع عضويات المثانة المحولة ونشرها وتمييزها في المختبر وفي الجسم الحي. يستخدم PCR لتأكيد حذف الجينات في Trp53 و Pten و Rb1. يوضح تلطيخ التألق المناعي (IF) للعضويات تعبيرا إيجابيا عن علامات النسب البولي (CK5 و p63). يتم حقن المواد العضوية تحت الجلد في الفئران المضيفة لتوسيع الورم والممرات التسلسلية. تظهر الكيمياء النسيجية المناعية (IHC) ل xenografts تعبيرا إيجابيا عن CK7 و CK5 و p63 وتعبيرا سلبيا عن CK8 و Uroplakin 3. باختصار ، يعد حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي من الخلايا البولية اللولبية للفئران المصممة بمواقع loxP طريقة فعالة لاختبار الإمكانات السرطانية للتغيرات الجينية المحددة بسرعة.
المقدمة
سرطان المثانة هو رابع أكثر أنواع السرطان شيوعا لدى الرجال ويصيب أكثر من 80000 شخص سنويا في الولايات المتحدة1. كان العلاج الكيميائي القائم على البلاتين هو معيار الرعاية للمرضى الذين يعانون من سرطان المثانة المتقدم لأكثر من ثلاثة عقود. لقد تم إحداث ثورة في مشهد علاج سرطان المثانة من خلال الموافقة الأخيرة لإدارة الغذاء والدواء (FDA) على العلاج المناعي (مثبطات نقاط التفتيش المناعية المضادة ل PD-1 و PD-L1) ، و erdafitinib (مثبط مستقبلات عامل نمو الخلايا الليفية) و enfortumab vedotin (اقتران الأجسام المضادة والأدوية) 2،3،4. ومع ذلك، لا تتوفر مؤشرات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز روزويل بارك الشامل للسرطان ، بوفالو ، نيويورك (1395M ، 180501 السلامة البيولوجية 180502).
ملاحظة: تنفيذ الخطوات من 1 إلى 3 في نفس اليوم.
1. تشريح المثانة الفأر
- التحضير للتشريح
- قم بإعداد جميع الأدوات المعقمة بما في ذلك المقص والملقط و DPBS المعقمة في أطباق استزراع 35 مم والإيثانول بنسبة 70٪ والشاش المعقم والمناشف الورقية النظيفة. تنظيف جميع أسطح منطقة التشريح. توليد ذكور الفئران الثلاثية المفلطخة Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f (4 فئران، عمرها 10 أسابيع)، كما....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر سير عمل عمليات حذف الجينات بوساطة الفيروس الغدي-Cre في الخلايا البولية الثيلية للفئران في الشكل 1A. يوضح الفيديو المصاحب كيفية انفصال الخلايا البولية عن قاع المثانة وكيف يتم نقل الخلايا الثلاثية المفلطحة خارج الجسم الحي باستخدام Ad5CMVCre. أظهر الشكل 1A أن الحد الأدنى من الخلايا تحت المخاطية وخلايا العضلات تم فصلها بعد هضم الإنزيم. ولتأكيد كفاءة توصيل الفيروس الغدي-كري، تم نقل الخلايا البولية المنفصلة عن الفئران الثلاثية المفلطخة ببروتين الفلورسنت .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كانت GEMMs هي المعايير الذهبية لنمذجة السرطان التي بدأت من الخلايا الطبيعية ، مما يسمح باختبار عواقب الاضطرابات السرطانية المحتملة (تنشيط الجينات الورمية و / أو فقدان مثبطات الورم) بدقة. هنا ، يتم توفير بروتوكول سريع وفعال لتوليد عضويات سرطان المثانة عن طريق تحرير الجينات خارج الجسم الحي للخلايا البولية الثيلية الطبيعية للفئران التي تحمل أليلات مفلطخة في الجينات ذات الاهتمام. يوضح تلطيخ H&E و IHC أن المواد العضوية TKO تظهر الأنسجة بما يتفق مع الظهارة البولية عالية الجودة ، مع التمايز الحرشفية ونوع فرعي يشبه القا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل البحثي جزئيا من قبل NIH Grants و K08CA252161 (Q.L.) و R01CA234162 و R01 CA207757 (D.W.G.) و P30CA016056 (منحة الدعم الأساسية لمركز NCI للسرطان) ومؤسسة روزويل بارك ألاينس ومؤسسة أصدقاء المسالك البولية. نشكر ماريسا بلاسك وميلا باكهوموفا على التدقيق اللغوي للمخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100 مو ؛ مصفاة خلية معقمة | m Corning | 431752 | |
| 1 مل حقنة | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 بوصة إبرة | EXELINT International | 26406 | |
| الفيروس الغدي (Ad5CMVCre عيار عالي ، 1E11 pfu / ml) | واجهة المستخدم ناقلات الفيروس الأساسية | VVC-U من Iowa-5-HT | |
| C57 BL / 6J | Jackson Lab | 000664 | |
| FBS | مجردة من الفحمتقنيات الخلايا الجذعية من Gibco | A3382101 | |
| الكولاجيناز / الهيالورونيداز | 07912 | ||
| الخلايا الجذعية | المتباينة | 07913 | |
| DPBS ، 1x | Corning | 21-031-CV | |
| بديل L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| وسط نمو الخلايا الظهارية الثديية | Lonza | CC-3150 | |
| مقتطفات المصفوفة من Engelbreth– هولم– ساركوما الفأر السرب (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| ماوس أحادي النسيلة مضاد ل CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| فأر أحادي النسيلة مضاد ل CK7 | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | SC-23876 | IHC 1:50 |
| فأر أحادي النسيلة مضاد ل p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100 ، IF 1:50 |
| فأر أحادي النسيلة مضاد ل Upk3 | فيتزجيرالد | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| فأر أحادي النسيلة مضاد للفيمنتين | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | SC-6260 | IF 1:100 |
| فأر أحادي النسيلة مضاد ل CK8 | دراسات تنموية بنك الورم الهجين | TROMA-I-S | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i حاضنة CO2 | Thermo Fisher | 51033557 | |
| دجاج متعدد النسيلة مضاد ل CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1: 500 |
| Primocin | إنفيفوجين | ant-pm-1 | |
| إنزيم مؤتلف لبديل التربسين (إنزيم TrypLE Express) | Fisher 12605036 | ||
| 1575 | VWR | 35962-091 | |
| جل معالجة العينات (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| الشفرة الجراحية مقاس 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| سورفال ليجند RT | ثيرمو | فيشر 75004377 | |
| سورفال T1 جهاز طرد | مركزي ثيرمو فيشر | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
المراجع
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2021. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
