يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المتفطرة السلية إثراء الحويصلات خارج الخلية من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

2.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63895

⸱

مايو 19, 2022

 ,  , 
1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وهي تقنية سهلة وقابلة للتكرار لإثراء المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية من supernatants الثقافة.

الملخص

ظهر دور الحويصلات خارج الخلية (EVs) في سياق العدوى البكتيرية كوسيلة جديدة لفهم فسيولوجيا الميكروبات. على وجه التحديد ، تلعب المركبات الكهربائية المتفطرة السلية (Mtb) دورا في التفاعل بين المضيف والممرض والاستجابة للإجهاد البيئي. كما أن المركبات الكهربائية Mtb مستضدية للغاية وتظهر إمكانات كمكونات للقاح. الطريقة الأكثر شيوعا لتنقية المركبات الكهربائية Mtb هي الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه العملية لها العديد من القيود ، بما في ذلك الإنتاجية المنخفضة ، والعائد المنخفض ، والاعتماد على المعدات باهظة الثمن ، والتحديات التقنية ، ويمكن أن تؤثر سلبا على التحضير الناتج. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) هي طريقة بديلة ألطف تحارب العديد من قيود الطرد المركزي الفائق. يوضح هذا البروتوكول أن SEC فعالة في إثراء Mtb EV وتنتج مستحضرات Mtb EV عالية الجودة لزيادة الإنتاجية بطريقة سريعة وقابلة للتطوير. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقارنة مع الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة من خلال إجراءات القياس الكمي والتأهيل توضح فوائد SEC. في حين أن تقييم كمية EV (تحليل تتبع الجسيمات النانوية) ، والنمط الظاهري (المجهر الإلكتروني للإرسال) ، والمحتوى (النشاف الغربي) مصمم خصيصا ل Mtb EVs ، يمكن تطبيق سير العمل المقدم على المتفطرات الأخرى.

المقدمة

قد يكون إطلاق الحويصلة خارج الخلية (EV) بواسطة مسببات الأمراض هو المفتاح لفتح تقنيات جديدة للسيطرة على الأمراض المعدية1. المتفطرة السلية (Mtb) هي عامل ممرض ذو عواقب عالية ، حيث تصيب ما يقرب من ثلث سكان العالم وتودي بحياة الملايين من الناس كل عام2. إنتاج EV بواسطة Mtb موثق جيدا ولكنه بعيد المنال في التكوين الحيوي والأدوار المتنوعة (أي المحفزات المناعية ، المثبطة للمناعة ، اكتساب الحديد والمغذيات) لهذه المركبات الكهربائية في سياق العدوى3،4،5. كشفت الجهود المبذولة لفهم تكوين Mtb EVs عن 50-150 نانومتر من الكرات المغلقة بالغشاء الدهني المشتقة من غشاء البلازما الذي يحتوي على الدهون والبروتينات ذات الأهمية المناعية 3,6. كشف التحقيق في دور Mtb EVs في علم وظائف الأعضاء البكتيرية عن أهمية تعديل EV البكتيري استجابة للإجهاد البيئي للبقاء على قيد الحياة5. كانت دراسات التفاعل بين المضيف ومسببات الأمراض أكثر تعقيدا في تفسيرها ، لكن الأدلة تشير إلى أن Mtb EVs يمكن أن تؤثر على الاستجابة المناعية للمضيف وقد تكون بمثابة مكون تطعيم فعال 3,4,7.

اعتمدت معظم الدراسات التي أجريت على المركبات الكهربائية Mtb حتى الآن على الطرد المركزي المتدرج للكثافة لتخصيب الحويصلة8. وكان ذلك فعالا بالنسبة للدراسات الصغيرة النطاق؛ ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لديها العديد من التحديات التقنية واللوجستية. تجمع مهام سير العمل البديلة بين الطرد المركزي متعدد الخطوات ، لإزالة الخلايا الكاملة والحطام الكبير ، مع خطوة الطرد المركزي الفائق النهائية لتكوير المركبات الكهربائية. يمكن أن تختلف هذه المنهجية في الكفاءة ، وغالبا ما تؤدي إلى انخفاض الغلة والتنقية المشتركة للجزيئات الحيوية غير الحويصلة القابلة للذوبان مع التأثير أيضا على سلامة الحويصلة9. بالإضافة إلى ذلك ، تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ومكثفة يدويا ومحدودة للغاية في الإنتاجية بسبب قيود المعدات.

يصف البروتوكول الحالي تقنية بديلة للطرد المركزي الفائق التدرج الكثافة: كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). وقد تم إثبات هذه الطريقة للمتفطرات البيئية ، وفي العمل الحالي ، تم استقرائها إلى Mtb10. يمكن للعمود المتاح تجاريا وجامع الكسور التلقائي تحسين الاتساق في التحضير الحويصلي وتقليل الحاجة إلى معدات محددة ومكلفة. من الممكن أيضا إكمال هذا البروتوكول في جزء صغير من الوقت مقارنة بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، مما يزيد من الإنتاجية. هذه التقنية أقل تحديا من الناحية الفنية ، مما يجعل من السهل إتقانها ، ويمكن أن تزيد من قابلية التكرار بين / داخل المختبر. أخيرا ، تتمتع SEC بكفاءة فصل عالية وهي لطيفة ، مما يحافظ على سلامة الحويصلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت اللجنة المؤسسية للسلامة الأحيائية بجامعة ولاية كولورادو على هذه الدراسة (19-046B). تم تنفيذ زراعة المتفطرة السلية وحصاد المواد الفائقة للزراعة الغنية بالمركبات الكهربائية من قبل موظفين مدربين في مختبر عالي الاحتواء. تم نقل المواد من منطقة الاحتواء العالي بعد تنفيذ طريقة تعطيل صالحة وتأكيدها والموافقة عليها من قبل سياسات السلامة الأحيائية المؤسسية. أثناء تكرار البروتوكول ، إذا لم تكن طريقة التعطيل أو الترشيح المعقم التي تم التحقق منها ممكنة ، فيجب تنفيذ الإجراءات التالية في مختبر عالي الاحتواء.

1. إعداد النفط الخام Mtb EV التركيز

ملاحظة: للاطلاع على الإجراءات التفصيلية بشأن زراعة Mtb وإعداد بروتين ترشيح الثقافة (CFP) ، انظر المراجع11،12. يوصى بأن تكون وسائط الزراعة البكتيرية خالية من مكملات النمو التي تحتوي على مكونات تحتوي على EV أو بروتينية ، مثل Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) ، والمنظفات مثل Tween. يوصى أيضا بفحص جودة المستنبتة البكتيرية و CFP المحصود لضمان موت الخلايا المحدود وتحلل13,14.

  1. قم بإعداد مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي 100 كيلو دالتون (MWCO) (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة سعة الحجم الكاملة للمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (1x PBS). جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 2800 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: في حالة استخدام مرشح بدون حجم توقف ميت، يجب توخي الحذر لضمان عدم انخفاض حجم العينة إلى ما دون مستوى الفلتر، مما يؤدي إلى تجفيف المرشح بالكامل أثناء الطرد المركزي.
  2. تخلص من التدفق وأي PBS متبقي قبل ملء غرفة العينة ب Mtb CFP إلى سعتها القصوى. جهاز طرد مركزي عند 2800 × g عند 4 درجات مئوية حتى ينخفض الحجم إلى الحد الأدنى لحجم جهاز الترشيح الفائق. كرر ذلك حسب الضرورة ، مع إضافة المزيد من CFP إلى الوحدة حتى يتم تقليل العينة بأكملها بشكل كاف.
    ملاحظة: احتفظ بجزء من المواد المتدفقة (100F) التي تبلغ سعتها 100 كيلوداد (100F) للتأهيل في المراحل النهائية إذا رغبت في ذلك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. أضف 1x PBS إلى وحدة التصفية التي تحتوي على التركيز حتى إجمالي سعة الجهاز. تقليل مستوى الصوت كما هو موضح في 1.2. كرر هذه الخطوة خمس مرات لضمان الغسيل الكامل وتبديل المخزن المؤقت.
  4. استرجع وحدة CFP المركزة بسرعة 100 كيلوداد (100R) وفقا لمواصفات جهاز الترشيح الفائق (انظر جدول المواد). بمجرد استرداد 100R ، اغسل المرشح بأقل حجم 1x PBS ثلاث مرات على الأقل ، وقم بتجميع الغسيل مع 100R لتحقيق أقصى قدر من الاسترداد.
  5. قم بقياس كمية مادة 100R باستخدام فحص ثنائي التشينكونينيك (BCA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). لإجراء الفحص ، استخدم العديد من التخفيفات للعينات 1: 2 و 1: 5 و 1: 10 في PBS. اختبار العينة في ثلاثة أضعاف.
    ملاحظة: احتفظ بجزء من مادة 100R للتأهيل النهائي إذا رغبت في ذلك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لإثراء المركبات الكهربائية Mtb من CFP

ملاحظة: الإجراء التالي محدد لاستخدام 3 ملغ من 100R Mtb CFP مع عمود SEC وجامع الكسور التلقائي (AFC، انظر جدول المواد). يمكن تكييفه مع تركيزات البدء الأخرى وأنواع الأعمدة باتباع مواصفات الشركة المصنعة. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى المستخدمون بقراءة وفهم دليل مستخدم جامع الكسور التلقائي.

  1. اسمح لعمود SEC بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتشغيل AFC باستخدام مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من وحدة البرج واضبط إعدادات خلية التحميل، إذا لزم الأمر، عن طريق الضغط على SETUP على شاشة اللمس في القائمة الرئيسية. يجب معايرة خلية التحميل فقط عند الاستخدام الأول، وبعد كل تحديث للبرنامج، وفي حالة ملاحظة عدم تناسق في وحدات تخزين تجميع الكسور.
  3. من شاشة الإعداد ، قم بمحاذاة الدوار عن طريق تحديد CAROUSEL > CALIBRATE. أدخل الدوار مع 13 فتحة صغيرة متجهة لأعلى في برج AFC ، واضبط الدوار بحيث تكون فوهة السائل فوق موضع التدفق مباشرة عن طريق الضغط على الزرين - و / أو + .
  4. قم بإزالة الأحرف الكبيرة من عمود SEC المتوازن. حرك عمود SEC في حامل العمود المناسب وقم بتثبيته بعناية على برج الاتحاد الآسيوي لكرة القدم. تأكد من أن علامة تعريف التردد اللاسلكي (RFID) الموجودة على العمود تواجه AFC ، وتحقق من أن الاتصال بين العمود والصمام آمن. ضع أنبوب مخرج النفايات في حاوية تجميع.
  5. من شاشة الإعداد ، حدد جدول التجميع واضبط العدد على 13 والحجم على 0.5 مل بالضغط على الزرين - و/أو + . اترك إعداد "وحدة التخزين المؤقت" كإعداد افتراضي ل 2.7 مل ، ثم أغلق نافذة "جدول التجميع" بالضغط على X.
  6. حدد START COLLECTION من الشاشة الرئيسية وقم بتأكيد معلمات المجموعة عن طريق تحديد نعم. تحميل 13 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل مع فتح الأغطية والإشارة نحو مركز الدوار.
  7. تقدم AFC عن طريق تحديد OK ، ثم قم بتركيب خزان العمود والتقدم مرة أخرى عن طريق الضغط على OK. حدد خيار مسح العمود بالضغط على YES، وإضافة وحدة تخزين عمود واحدة بحجم 0.2 ميكرومتر PBS تمت تصفيتها لإزالة أي مخزن مؤقت للتخزين. بمجرد اكتمال التدفق ، تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم عن طريق الضغط على موافق.
  8. ضع الغطاء الدوار فوق الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واضغط على موافق. قم بإعداد حجم عمود واحد من 0.2 ميكرومتر PBS المصفاة. استخدم ماصة لإزالة أي مخزن مؤقت زائد من العمود.
  9. أحضر 3 ملغ من عينة 100R كما هو محدد كميا في الخطوة 1.5 إلى 500 ميكرولتر مع 1x PBS. أضف عينة 3 ملغ إلى أعلى العمود. تقدم الاتحاد الآسيوي لكرة القدم واسمح للعينة بالركض في الفريت. بمجرد إدخال العينة بالكامل إلى العمود ، أضف PBS المعد في الخطوة 2.6 إلى الخزان.
  10. راقب سير عمل الاتحاد الآسيوي لكرة القدم أثناء قيامه أولا بجمع حجم الفراغ ثم الكسور المحددة. بعد اكتمال التشغيل وعودة الدوار إلى وضع النفايات ، قم بإزالة الغطاء ، وقم بإزالة أنابيب الكسر من الدوار. قم بتخزين الكسور عند 4 درجات مئوية قبل القياس الكمي (الخطوة 3) والتأهيل (الخطوة 4).
  11. إذا كان سيتم إعادة استخدام العمود ، فحدد خيار تنظيف العمود بالضغط على YES; وإلا، اضغط على NO. اتبع التعليمات الواردة في الاتحاد الآسيوي لكرة القدم.
    ملاحظة: بمجرد غسل العمود وتشغيل المخزن المؤقت للتخزين، يمكن إزالته وتغطيته وتخزينه عند 4 درجات مئوية.

3. القياس الكمي للمركبات الكهربائية Mtb

  1. قم بقياس تركيز البروتين لكل جزء باستخدام BCA و micro BCA12.
    1. بالنسبة لكسور 0.5 مل التي تم جمعها من 3 ملغ من 100R Mtb CFP ، استخدم BCA الصغير مع تخفيف 1: 3 للكسور المرقمة 1-7 من كل عينة في ثلاثة أضعاف.
    2. بالنسبة لكسور 0.5 مل المرقمة من 5 إلى 13 ، استخدم BCA بدون تخفيف لكل عينة في ثلاثة أضعاف.
      ملاحظة: سيساعد تداخل المقايسات للكسور 5-7 على ضمان أن يكون لجميع الكسور ناتج قابل للقراءة.
  2. قياس تركيز الجسيمات لكل كسر باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA).
    1. تمييع العينات في 1 مل من 1x PBS باستخدام نسب البدء المقترحة التالية ؛ بالنسبة للكسور 1-3 ، استخدم 1:100 ، ثم بالنسبة للكسور المتبقية ، استخدم تخفيفا بنسبة 1:10.
    2. دوامة المحاليل المخففة ثم سحب العينة إلى حقنة 1 مل يمكن التخلص منها. اضبط المحقنة في مضخة حقنة أوتوماتيكية إن وجدت.
    3. اضبط مضخة المحقنة على 30 ميكرولتر / دقيقة واستخدم إعدادات التقاط الفيديو مع كسب الشاشة من 10-12 ومستوى الكاميرا من 10-12. اضبط التركيز البؤري لكل عينة.
    4. اجمع ما لا يقل عن ثلاثة مقاطع فيديو بمعدل 30 ثانية لكل منها باستخدام تدفق ثابت.
    5. قم بإجراء التحليل مع تعيين عتبة اكتشاف البرنامج إلى خمسة.
      ملاحظة: قد لا يكون من الممكن الحصول على بيانات NTA لأحدث الكسور (>7) دون التضحية بحجم عينة كبير.

4. تأهيل المركبات الكهربائية Mtb

  1. تصور ملف تعريف البروتين العام لكل جزء باستخدام جل البروتين الملون بالفضة.
    ملاحظة: يمكن العثور على الإجراءات التفصيلية ل SDS-PAGE وبقعة الفضة في المرجع15.
    1. أضف المخزن المؤقت لعينة SDS إلى 10 ميكرولتر من كل كسر و 5 ميكروغرام من CFP و 100R و 100F. تغلي لمدة 5 دقائق عند 100 درجة مئوية ، ثم يتم تحميلها على 4٪ -12٪ Bis-Tris Gel مع سلم الوزن الجزيئي للرحلان الكهربائي لهلام البولي أكريلاميد (PAGE) (انظر جدول المواد).
    2. قم بتشغيل الجل باستخدام 1x 2-[N-morpholino] حمض الإيثان سلفونيك (MES) تشغيل المخزن المؤقت (انظر جدول المواد) وتيار 200 فولت لمدة 35 دقيقة.
    3. أزل الجل من الكاسيت واستمر في تلطيخ الفضة15.
  2. تقييم وجود أو عدم وجود علامات EV في كل جزء بواسطة اللطخة الغربية.
    ملاحظة: يمكن العثور على الإجراءات التفصيلية للنشاف الغربي في المرجع15.
    1. قم بتشغيل هلام SDS-PAGE كما هو موضح في الخطوات 4.1.1-4.1.2.
    2. قم بإزالة الجل من الكاسيت ونقل البروتينات التي تم حلها إلى غشاء نيتروسليلوز 0.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد) عن طريق تطبيق تيار 50 فولت لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    3. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية لتقييم البروتينات ذات الاهتمام. يوصى باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد LpqH و lipoarabinomannan (LAM) و GroES (انظر جدول المواد).
    4. كسور التجمع بناء على وجود أو عدم وجود علامات حسب الاقتضاء للتطبيق النهائي.
  3. تأكد من وجود حويصلات سليمة عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM).
    1. إصلاح 15 ميكرولتر من عينة الحويصلة عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من 4٪ من بارافورمالديهايد الصف EM وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. قم بإعداد شبكة TEM من النحاس المطلي بالكربون من 200 شبكة.
      ملاحظة: يوصى بتنظيف البلازما باستخدام 95٪ أرجون و 5٪ أكسجين و 30٪ من طاقة البلازما لمدة 1 دقيقة.
    3. أسقط 10 ميكرولتر من العينة الثابتة على الشبكة واسمح للعينة بالالتصاق لمدة 10 دقائق ، ثم امسح السائل الزائد بورق الترشيح.
    4. قم بتعويم الشبكة على قطرة من الماء فائق النقاء لمدة 30 ثانية ، ثم امسح السائل الزائد.
    5. تعويم الشبكة على قطرة أسيتات اليورانيل من الدرجة d٪ EM لمدة 2 دقيقة ، ثم مسح السائل الزائد.
    6. اترك الشبكة لتجف في الهواء تماما.
    7. صورة باستخدام TEM (انظر جدول المواد) عند 100 كيلو فولت أو ما شابه ذلك.
      ملاحظة: ينبغي استخدام طرق أخرى لتحديد كمية وتوصيف المركبات الكهربائية استنادا إلى التطبيقات النهائية. يجب الرجوع إلى الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية18 للحصول على إرشادات لضمان دقة وقابلية تكرار جميع دراسات EV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تركيز بروتين ترشيح الثقافة (CFP) من المتفطرة السلية (Mtb) ، وتحديد كميته ، ثم تم تطبيق 3 ملغ من المواد على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). تم تعداد تركيزات البروتين والجسيمات بواسطة BCA و NTA ، على التوالي. وترد في الجدول 1 النطاقات المتوقعة لاستعادة البروتين والجسيمات بالإضافة إلى القيم الدقيقة التي تم الحصول عليها لهذه النتائج. قد تشير القيم الأعلى بكثير من هذه النطاقات إلى مشكلات التلوث أو سلامة العمود. تشير القيم الأقل بكثير إلى مشاكل في خطوات الترشيح الفائق ، وبالتالي يجب مقارنة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المتفطرة السلية الحويصلات خارج الخلية هي خزانات مستضدية للغاية ، والتي تقدمها كوسيلة جذابة لتطوير أدوات التشخيص واللقاحات المستقبلية4،19،20. تاريخيا ، تم استخدام الطرد المركزي الفائق التدرج للكثافة لفصل Mtb EVs عن المواد الأخرى القابلة للذوبان والمفرزة8. في حين أن هذه العملية فعالة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا ، وتمثل تحديا تقنيا ، وقد تؤثر على سلامة مستحضرات EV الناتجة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشيد بالدعم المقدم من الجائزة التجريبية لكلية الطب البيطري والعلوم الطبية الحيوية وبرنامج البحوث المشتركة لمجلس أبحاث الكلية إلى NKG والتمويل المقدم من ATCC (الجائزة رقم 2016-0550-0002) إلى KMD. نود أيضا أن نشيد بآن سيمبسون على الدعم الفني و BEI Resources و NIAID و NIH على الكواشف التالية: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) ، IT-54 (المنتجة في المختبر) ، NR-13792 ، Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c) ، Clone IT-3 (SA-12) (المنتجة في المختبر) ، NR-49223 ، و Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM ، Clone CS-35 (المنتجة في المختبر) ، NR-13811.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
20x MES SDS تشغيل العازلةThermoFisher ScientificNP0002
96 لوحة البئرCorning15705-066
مجمع الكسور الأوتوماتيكيIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark سلم البروتين الملونمسبقا Invitrogen10748010
جهاز طرد مركزيBeckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 مرشح طرد مركزي ، 100 كيلو دالتون قطعMillipore SigmaUFC710008جهاز الترشيح الفائق المستخدم في الخطوة 1.1
نظام النشاف الكهربائيThermoFisher Scientific09-528-135
EM درجة علوم المجهر الإلكتروني Paraformaldehyde15714-S
Formvar / Carbon 200 شبكة شبكات النحاسعلوم المجهر الإلكترونيFCF200H-Cu-TA
الماعز المضادة للفأر IgG H& L (الفوسفاتيز القلوي) ، جزيء كامل ، 1 ملAbCamab6790الجسم المضاد الثانوي
JEM-1400 مجهر إلكتروني ناقلالحركة JOEL
Micro BCA Protein AssayKit ThermoFisher Scientific23235
قارئ MicroplateBIOTEKEpoch
أحادي النسيلة المضاد المتفطرة السلية< / em> GroES (الجين Rv3814c)BEI ResourcesNR-49223الجسم المضاد
الأولي أحادي النسيلة المضاد المتفطرة السلية< / em> LpqH (الجين Rv3763)BEI ResourcesNR-13792الجسم المضاد
الأولي أحادي القولون المضاد المتفطرة السلية< / EM> LAM ، استنساخ CS-35BEI ResourcesNR-13811الجسم المضاد الأولي
NanoClean 1070Fischione Instrumentsلتنظيف البلازما لشبكة TEM
Nanosight مجهزة بمضخة حقنة وكمبيوتر مع برنامج NanoSight NTAMalvern PanalyticalNS300
غشاء النيتروسليلوز ، لفة ، 0.2 & mBioRad1620112
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Protein GelsThermoFisher ScientificNP0323BOX
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 1X بدون كالسيوم ومغنيسيومCorning21-040-CV
بيرس BCA فحص البروتينكيت ThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
qEV الأصلي 35 نانومتر 5 / عبورةIZON ScienceSP5-USDSEC عمود
SDS عينة عازلةBosterAR1112وصفة داخلية مستخدمة في هذا الإجراء ، ومع ذلك فإن هذا المنتج مكافئ
لغرفة جل SDS-PAGEThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCI / NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449البروتوكول الداخلي المستخدم في هذا الإجراء ، ومع ذلك فإن هذه المجموعة مكافئة
لعلوم المجهرالإلكتروني لأسيتات اليورانيل22400

المراجع

  1. Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
  2. World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
  3. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  4. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921(2014).
  5. Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
  6. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  7. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).
  10. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  11. Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
  12. Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
  13. Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
  14. Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).
  15. Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022).
  16. Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
  17. Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
  20. Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
  21. Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Mycobacterium Tuberculosis
المتفطرة السلية إثراء الحويصلات خارج الخلية من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.