يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر

4.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63916

⸱

أبريل 6, 2022

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يعد تحويل الحمض النووي البلازميدي بالكهرباء إلى العضلات الهيكلية طريقة قابلة للتطبيق لتعديل التعبير الجيني دون المساس بانقباض العضلات لدى الفئران.

الملخص

يعد تعديل التعبير الجيني العابر في العضلات الهيكلية الفئرانية بواسطة بالكهرباء البلازميدية أداة مفيدة لتقييم الفسيولوجيا الطبيعية والمرضية. إن الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة أو إسقاطها يمكن الباحثين من التعامل مع الأحداث الجزيئية الفردية ، وبالتالي فهم أفضل للآليات التي تؤثر على كتلة العضلات ، واستقلاب العضلات ، والانقباض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إلكتروبورات بلازميدات الحمض النووي التي تشفر علامات الفلورسنت تسمح للباحثين بقياس التغيرات في التوطين تحت الخلوي للبروتينات في العضلات الهيكلية في الجسم الحي. يتضمن التقييم الوظيفي الرئيسي للعضلات الهيكلية قياس انقباض العضلات. في هذا البروتوكول ، نثبت أن دراسات انقباض العضلات الكاملة لا تزال ممكنة بعد حقن الحمض النووي البلازميد ، والكهربية ، وتعديل التعبير الجيني. الهدف من هذا الإجراء التعليمي هو إظهار الطريقة خطوة بخطوة للبلازميد الكهربائي للحمض النووي في العضلات الهيكلية للفأر لتسهيل الامتصاص والتعبير في الألياف العضلية للعضلات الطويلة الأمامية والباسطة الرقمية ، وكذلك لإثبات أن انقباض العضلات الهيكلية لا يتعرض للخطر عن طريق الحقن والكهرب.

المقدمة

يعد كهربية الحمض النووي البلازميدي في العضلات الهيكلية في الجسم الحي أداة مهمة لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات الهيكلية والإشارات الجزيئية عن طريق تعديل التعبير الجيني في مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تم إثبات نقل الجينات التجريبية إلى العضلات الهيكلية في وقت مبكر من عام 1990 من قبل وولف وآخرون ، حيث تم نقل كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي بنجاح دون كهربية ، وتم الحفاظ على تعبير luciferase لمدة شهرين على الأقل10. إن كفاءة النقل المنخفضة نسبيا مع الحقن فقط تمثل مشكلة ، وقد أظهر أيهارا وميازاكي زيادة في نقل الجينات باستخدام الكهربية في عام 1998 عن طريق كهربية بناء pCAGGS-IL-5 في عضلة الظنبوب الأمامية (TA) وقياس تعبير المصل IL-511. منذ ذلك الوقت ، حققت العديد من الدراسات في فعالية تركيزات الحمض النووي المختلفة ، والأحجام ، ومعلمات الكهربية لضمان أقصى قدر من كفاءة نقل الجينات. اختبر مير وآخرون معلمات كهربائية مختلفة ، بما في ذلك الجهد ، وعدد النبض ، ومدة النبض ، والتردد ، بالإضافة إلى تركيز الحمض النووي ، وقرروا أن زيادة الجهد ، وعدد النبضات ، وتركيز الحمض النووي كلها ساهمت في زيادة كفاءة الكهربية12. أحد التحذيرات الرئيسية من الجهد الكهربائي العالي هو أنه في حين أنه يسهل زيادة امتصاص الحمض النووي في الألياف العضلية ، فإنه يسبب أيضا تلفا في العضلات ، مما قد يؤدي إلى إرباك النتائج. أظهر Schertzer et al. أن الكهربية عند 200 فولت تسببت في تلف حوالي 50٪ من الألياف العضلية بعد 3 أيام من المسام الكهربائية ، في حين أن 10٪ فقط من الألياف العضلية تضررت عند 50 فولت13. لقد أخذنا في الاعتبار المتغيرات التي تؤثر على نقل الحمض النووي بكفاءة مقابل تلف العضلات ووجدنا أن الجهد البالغ 125 فولت في المائة من عرض الفرجار يكفي لتحقيق نقل فعال للجينات.

يعد تحليل منطقة المقطع العرضي لألياف العضلات وانقباض العضلات بالكامل بعد الكهربية من الجوانب المهمة لطريقة قياس التغيرات في حجم العضلات ووظيفتها بسبب تعديل الجينات. لقد أثبتنا نحن وآخرون سابقا أن كهربية ناقلات المكافحة وحدها لا تسبب انخفاضا في منطقة الألياف العضلية. كان بناء بروتين الفلورسنت الأخضر (EGFP) مؤشرا فلوريا مفيدا لنقل الحمض النووي في هذه الدراسات13,14. قام عدد من الدراسات بالتحقيق في انقباض TA في الموقع بعد الكهربية ووجدوا نتائج متفاوتة. أظهرت إحدى الدراسات أن الكهربية 75 فولت / سم تسببت في انخفاض بنسبة 30٪ في قوة الكزاز بعد 3 أيام من الكهربية ، وبحلول 7 أيام بعد الكهربية ، عادت قوة الكزاز إلى مستوى التحكم ، في حين أن 50 فولت / سم من الكهربية لم تؤثر على القوة13,15. أظهرت دراسة أخرى أن هناك فقدانا بنسبة 30٪ لقوة الكزاز 3 ساعات بعد 180 فولت / سم من الكهرباء ، والتي تعافت إلى مستويات القوة الزائفة بعد 7 أيام16.

في الإجراء التفصيلي التالي ، نوضح الحقن والكهربية لبلازميد pcDNA3-EGFP في عضلات TA والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) للفئران. كما نثبت أن هذه الطريقة لا تؤثر على انقباض العضلات بالكامل لدى EDL. والهدف من ذلك هو إظهار كفاءة امتصاص البلازميد في الألياف العضلية دون التسبب في فقدان الوظيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب باستخدام الحيوانات في كلية ولاية بنسلفانيا للطب، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ولاية بنسلفانيا، وأجريت وفقا للمعايير الأخلاقية المنصوص عليها في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة. تم استخدام إناث C57BL / 6 الفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا لهذا الإجراء. تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية للعقم قبل التجريب.

1. TA و EDL حقن / إعداد الكهرباء

ملاحظة: هذه الخطوات متطابقة لإعداد الحقن / الكهربية TA و EDL.

  1. تنقية هياكل بلازميد التعبير إلى تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر مخفف في PBS معقمة قبل التجربة. بالنسبة لهذا الإجراء ، تم استخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية متاحة تجاريا لتنقية ناقل pcDNA3-EGFP (GFP) أو pcDNA3 الفارغ (السيطرة).
  2. حساب تركيز البلازميد لضمان حجم الحقن الكافي (TA 50 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميكرولتر من PBS المعقمة; EDL 10 ميكروغرام من الحمض النووي في 10 ميكرولتر من PBS المعقمة) وعينات aliquot.
  3. قم ببرمجة إعدادات electroporator باستخدام عجلة التحديد وخفض العجلة لاختيار المعلمات على النحو التالي: الوضع - LV ، الجهد - 12.5 فولت / مم (ليتم تعديله في وقت الحقن) ، طول النبض - 20 مللي ثانية ، عدد النبضات - 5 ، الفاصل الزمني - 200 مللي ثانية ، القطبية - أحادية القطب.
  4. تخدير الفئران باستخدام غاز الايزوفلوران. ضع الفئران في صندوق تحريض يحتوي على 5٪ من الأيزوفلوران. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير عن طريق عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم باستخدام الملقط وتقليل الأيزوفلوران إلى جرعة صيانة 2٪. انقل الفئران إلى مخروط الأنف المناسب الذي يستريح على صفيحة ماء متداولة عند 37 درجة مئوية لبقية الإجراء.
  5. إزالة الشعر من كلا الطرفين الخلفيين باستخدام ماكينات قص الشعر الصغيرة. فرك الأطراف السفلية بالتناوب 70٪ الإيثانول / البيتادين لتعقيم منطقة الحقن.

2. TA حقن / الكهربائي

  1. مع وجود الماوس في وضع ضعيف ، حدد موقع وتر TA المرئي من خلال الجلد على الجانب الجانبي من أسفل الساق. باستخدام حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر مع إبرة 30 جم قابلة للفصل ، أدخل الإبرة 1-2 مم متفوقة على الوصلة العضلية بزاوية 5 درجات ضحلة حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي للعضلات.
    ملاحظة: الحقن في منتصف العضلات هو الهدف.
  2. قم بخفض المكبس ببطء أثناء سحب الإبرة ببطء على طول مسار الحقن لتوفير 50 ميكرولتر من محلول البلازميد. يجب أن تنتفخ العضلات.
  3. اضبط المؤقت لمدة 1 دقيقة وقم بقياس سمك الساق في TA. اعتمادا على حجم الماوس ، يمكن أن يكون هذا من 5-10 ملم. اضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة واضبط جهد الكهربية على 12.5 فولت / مم.
  4. بعد 1 دقيقة ، ضع أقطاب الفرجار حول الطرف السفلي. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية مريحة ولكن ليست ضيقة للغاية. قم بتوصيل 5 نبضات بالموجات المربعة ، مع مدة 20 مللي ثانية وفترات 200 مللي ثانية (يجب أن ترتعش العضلات مع كل نبضة).
  5. كرر ذلك مع الطرف البديل باستخدام ناقل التحكم.
  6. قم بإزالة الماوس من التخدير واتركه يتعافى على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى قفصه.

3. حقن EDL / الكهربائي

  1. مع وجود الماوس في وضع ضعيف ، حدد موقع القمة الأمامية لعظم الساق بصريا ومن خلال الجس اللطيف.
    1. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق ضحل عبر الجلد على الجانب الجانبي من قمة الساق الأمامية 5 مم أقل من الركبة إلى 2 مم متفوقة على الوصلة العضلية TA.
    2. باستخدام مقص صغير ، تشريح حاد للفافة ، وكشف عضلة TA.
    3. مرة أخرى ، باستخدام تشريح حاد مع مقص ، افصل عضلة TA عن الساق بلطف عن طريق سحب العضلات أفقيا ، مما يعرض EDL. يمكن استخدام ملقط صغير منحني للحفاظ على TA واضحا من EDL أثناء العملية.
  2. باستخدام حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر مع إبرة 30 جم قابلة للفصل ، أدخل الإبرة في EDL طوليا حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي من العضلات.
  3. قم بخفض المكبس ببطء مع سحب الإبرة ببطء على طول مسار الحقن لحقن 10 ميكرولتر من محلول البلازميد (يجب أن تنتفخ العضلات).
  4. اضبط جهاز توقيت لمدة 1 دقيقة وقم بقياس سمك الساق في EDL. اعتمادا على حجم الماوس ، يمكن أن يكون هذا من 5-10 ملم. اضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة واضبط جهد الكهربية على 12.5 فولت / مم.
  5. بعد 1 دقيقة ، ضع أقطاب الفرجار حول الطرف السفلي. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية مريحة ولكن ليست ضيقة للغاية. قم بتقديم 5 نبضات بالموجات المربعة ، مع مدة 20 مللي ثانية وفترات 200 مللي ثانية (يجب أن ترتعش العضلات مع كل نبضة).
  6. أغلق الشق باستخدام خيوط نايلون غير قابلة للامتصاص يمكن التخلص منها 4/0.
  7. كرر ذلك مع الطرف البديل أو اترك الطرف دون أن يمسه أحد كتحكم مطلق.
  8. قم بإزالة الماوس من التخدير واتركه يتعافى على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. إعطاء مسكن مناسب تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة و 12-24 ساعة بعد الجراحة. بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى قفصه.
    ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة عجزا في انقباض العضلات في TA مباشرة بعد الكهربية وأن التعافي من الانقباض يحدث على مدار 3 أيام13,15. لهذا السبب ، يتم إجراء تحليل كل من عضلات TA و EDL لعلم الأنسجة أو التعبير عن البروتين أو انقباض العضلات بعد 3-10 أيام من الكهربية. وقد لوحظ التعبير المطول عن EGFP لمدة تصل إلى 3 أسابيع بعد الإجراء13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الكهربية لتسهيل نقل الجينات في العضلات الهيكلية هي تقنية مفيدة تستخدم لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات. لقد أظهرنا إجراء مفصلا خطوة بخطوة لتحقيق نقل الجينات بكفاءة في كل من عضلات TA و EDL. تحدث الاختلافات في كفاءة النقل بسبب عدد من المتغيرات. من بين هذه المتغيرات معلمات الكهربية (النبضات ، الجهد ، مدة النبض ، إلخ) ، حجم بناء الجينات ، وتركيز / حجم الحمض النووي المحقون. لقد أظهرنا سابقا أن معلمات الكهربية ل 5 نبضات عند 125 فولت / سم ، مع مدة 20 مللي ثانية مفصولة بفترات 200 مللي ثانية ، كافية لتحقيق نقل الجينات الفعال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الجسم الحي ، يعد نقل الجينات في العضلات الهيكلية المعززة بالكهرباء أداة مفيدة وبسيطة نسبيا لتعديل تعبير البروتين في العضلات. لقد أظهرنا الخطوات المطلوبة لتحقيق نقل فعال للجينات في عضلات EDL و TA وأثبتنا أن قياس الانقباض في EDL قابل للتطبيق بعد الإجراء. لا تتطلب هذه التقنية ناقلات فيروسية أكثر تعقيدا وتسمح بمقارنة منطقة المقطع العرضي لألياف العضلات المنقولة وغير المنقولة في عضلة واحدة. أحد القيود المفروضة على هذا الإجراء هو أن كفاءة امتصاص البناء لم تكن كاملة وظلت بعض الألياف العضلية غير منقولة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

B.A.H. و D.L.W لا تدعيان أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-0 خياطة نايلون (غير قابلة للامتصاص)خياطة Ethicon662Gلإغلاق شق الجلد
50 & micro ؛ ل حقنة هاميلتونهاميلتون80501حقنة دقيقة
C57BLl / 6NHsd الفئرانEnvigo044إناث الفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا تستخدم للتجريب
الفرجار الكهربائيBTX45-01021.0 سم × 1.0 سم الفولاذ المقاوم للصدأ
التحكم في العضلات الديناميكية الحصول على / تحليلبرنامج Aurora Scientific605Aالمستخدم لقياس وتحليل انقباض العضلات
ECM 830 نظام التثقيب الكهربائيBTX45-0662المثقور
الكهربائي EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362طقم تنقية البلازميد
مقص ضيق للغايةأدوات العلوم الدقيقة14088-10مقص لتشريح حاد
محول قوةAurora Scientific407Aلقياس القوة من EDL
Micro-Masquito Hemastatsأدوات العلوم الدقيقة13010-12هيماستاتات لتحريك
pcDNA3.1 ناقلات تعبير الثديياتفيشر ScientificV79020ناقل التحكم
pcDNA3-EGFP تعبير البلازميدAddgene13031البلازميد للتعبير عن
GFP ملقط منحني Semkenأدوات العلوم الدقيقة11009-13ملقط للجراحة
شفرات جراحية من الفولاذ المقاوم للصدأ رقم 10Becton Dickinson37 1210شفرات مشرط
Tissue-Tek O.C.T. mediaVWR25608-930وسائط التجميد للأنسجة
جنين القمح Agglutinin- Texas RedThermo-Fisher ScientificW21405تلطيخ الغشاء للمقطع العرضي للعضلات
بيانات

المراجع

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732(2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

التثقيب الكهربائي للبلازميدنقل الجيناتعضلات الفأرانقباض العضلاتحقن الحمض النوويتعديل التعبير الجينيالعضلة الظنبوبية الأماميةالعضلة باسطة الأصابع الطويلةتموضع البروتين
كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.