مقالة منهجية

استخدام شريحة الرئة المقطوعة بدقة لدراسة التنظيم الانقباضي للمجرى الهوائي والعضلات الملساء الشريانية داخل الرئة

DOI:

10.3791/63932

⸱

مايو 5, 2022

 , 
1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إعداد واستخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة للفأر لتقييم مجرى الهواء وانقباض العضلات الملساء الشريانية داخل الرئة في بيئة حية تقريبا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتوسط خلايا العضلات الملساء (SMC) في تقلص مجرى الهواء والشريان داخل الرئة لتعديل مقاومة تدفق الهواء والدورة الدموية الرئوية ، على التوالي ، وبالتالي تلعب دورا حاسما في توازن الجهاز الرئوي. يساهم تحرير انقباض SMC في العديد من الأمراض الرئوية ، بما في ذلك الربو وارتفاع ضغط الدم الرئوي. ومع ذلك ، نظرا لمحدودية الوصول إلى الأنسجة وعدم وجود أنظمة استزراع للحفاظ على الأنماط الظاهرية SMC في الجسم الحي ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء انقباض SMC غير المنظم في هذه الأمراض لا تزال محددة بالكامل. توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) نموذجا خارج الجسم الحي يتحايل على هذه الصعوبات التقنية. كقسم أنسجة رئوية حي ورقيق ، يحتفظ PCLS ب SMC في المناطق الطبيعية المحيطة ويسمح في الموقع بتتبع تقلص SMC وإشارات Ca2 + داخل الخلايا التي تنظم انقباض SMC. هنا ، يتم توفير بروتوكول إعداد PCLS مفصل للماوس ، والذي يحافظ على الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة. يتضمن هذا البروتوكول خطوتين أساسيتين قبل إخضاع فص الرئة للتقطيع: تضخيم مجرى الهواء باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار عبر القصبة الهوائية وملء الأوعية الرئوية بالجيلاتين من خلال البطين الأيمن. يمكن استخدام PCLS المعد باستخدام هذا البروتوكول للمقايسات الحيوية لتقييم تنظيم الانقباض بوساطة Ca2 + ل SMC في كل من مجرى الهواء ومقصورات الشرايين داخل الرئة. عند تطبيقه على نماذج الفئران لأمراض الجهاز التنفسي ، يمكن هذا البروتوكول من التحقيق الوظيفي ل SMC ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة على الآلية الأساسية لإزالة الانقباض SMC في الأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلية العضلات الملساء (SMC) هي نوع رئيسي من الخلايا الهيكلية في الرئة ، وتقيم في المقام الأول في الجدار الإعلامي للممرات الهوائية والأوعية الرئوية. تتعاقد SMCs لتغيير العيار المضيء ، وبالتالي تنظيم تدفق الهواء والدم 1,2. لذلك ، فإن التنظيم الانقباضي ل SMCs ضروري للحفاظ على توازن تهوية الهواء والدورة الدموية الرئوية. في المقابل ، يثير انقباض SMC الشاذ انسداد مجرى الهواء أو أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل الربو وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. ومع ذلك ، فقد واجه التقييم الوظيفي ل SMCs الرئة تحديا بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة الرئة ، وخاصة تلك الشعب الهوائية الصغيرة والأوعية الدقيقة في الجزء البعيد من الرئة 2,3. تلجأ الحلول الحالية إلى المقايسات غير المباشرة ، مثل قياس مقاومة تدفق الهواء بواسطة Flexivent لتعكس انقباض مجرى الهواء ، وفحص ضغط الدم الشرياني الرئوي عن طريق قسطرة القلب اليمنى لتقييم تقلص الأوعية الرئوية 4,5. ومع ذلك ، فإن هذه الفحوصات غير المباشرة لها عيوب متعددة ، مثل الارتباك بسبب العوامل الهيكلية ، والفشل في التقاط التنوع المكاني للمجرى الهوائي أو الاستجابات الوعائية في مقياس الرئة بأكمله 6,7 ، وغير مناسب للدراسة الميكانيكية للتنظيم الانقباضي على المستوى الخلوي. لذلك ، تم تطبيق طرق بديلة باستخدام الخلايا الأولية المعزولة ، أو شرائط عضلات القصبة الهوائية / الشعب الهوائية 8,9 ، أو شرائح الأوعية الدموية الكبيرة10 لدراسة SMC في المختبر. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها قيود أيضا. على سبيل المثال ، فإن التكيف الظاهري السريع ل SMCs الأولية في حالة الثقافة11,12 يجعل من الصعب استقراء النتائج من زراعة الخلايا إلى إعدادات الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد لا يمثل النمط الظاهري المقلص ل SMCs في مجرى الهواء القريب المعزول أو الأجزاء الوعائية SMCs في الرئة البعيدة 6,7. علاوة على ذلك ، يظل قياس قوة العضلات على مستوى الأنسجة منفصلا عن الأحداث الجزيئية والخلوية الضرورية للرؤية الميكانيكية لتنظيم الانقباض.

توفر شريحة الرئة المقطوعة بدقة (PCLS)، وهي قسم أنسجة رئوية حية، أداة مثالية خارج الجسم الحي لتوصيف SMCs الرئوية في بيئة دقيقة قريبة من الجسم الحي (أي البنية والتفاعل متعدد الخلايا المحفوظة)13. منذ أن قدم الدكتوران بلاكي وفيشر لأول مرة إعداد شرائح الرئة من رئتي الفئران والهامستر المنفوخة بالأغاروز في1980s 14,15 ، تم تطوير هذه التقنية باستمرار لتزويد PCLSs بجودة أعلى وتنوع أكبر للبحوث الطبية الحيوية. أحد التحسينات الهامة هو تعزيز الحفاظ على الشرايين الرئوية عن طريق ضخ الجيلاتين بالإضافة إلى تضخم الرئة مع الأغاروز عبر القصبة الهوائية. ونتيجة لذلك ، يتم الحفاظ على كل من مجرى الهواء والشرايين الرئوية سليمة في PCLS لتقييم خارج الجسم الحي 16. علاوة على ذلك ، فإن PCLS قابل للتطبيق لفترة طويلة في الثقافة. على سبيل المثال ، لم يكن لدى PCLSs الفئران أي تغيير كبير في صلاحية الخلايا والتمثيل الغذائي لمدة لا تقل عن 12 يوما في الثقافة ، وكذلك احتفظت بانقباض مجرى الهواء لمدة تصل إلى 7 أيام17. بالإضافة إلى ذلك ، يحتفظ PCLS بممرات هوائية أو أوعية مختلفة الأحجام لفحوصات الانكماش والاسترخاء. علاوة على ذلك ، يمكن فحص إشارات Ca 2 + داخل الخلايا ل SMCs ، العامل المحدد لانقباض الخلايا ، باستخدام أصباغ مراسل Ca 2+ التي تم تصويرها بواسطة مجهر متحد البؤرة أو2-photon 13.

بالنظر إلى التطبيق المكثف لنموذج الماوس في أبحاث الرئة ، يتم وصف بروتوكول مفصل هنا لإعداد PCLS للفأر مع الشعب الهوائية السليمة والشرايين داخل الرئة لأبحاث الرئة خارج الجسم الحي . باستخدام PCLSs المعدة ، أوضحنا لاحقا كيفية تقييم استجابات مجرى الهواء والشرايين الرئوية للمحفزات الانقباضية أو المرخية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف طريقة تحميل PCLS بصبغة مراسل Ca2 + ثم تصوير إشارات Ca2 + ل SMCs المرتبطة بالاستجابات الانقباضية أو المرخية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى ماساتشوستس العام. تم استخدام الفئران الذكور من النوع البري C57 / B6 ، التي يبلغ عمرها 8 أسابيع ، لهذه الدراسة.

1. التحضير التجريبي

  1. إعداد حل العمل.
    1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن 1x Hank (HBSS ، مع Ca 2+ و Mg 2+ ، ودرجة الحموضة المتوازنة مع20 mM HEPES ، انظر جدول المواد). استخدم حل HBSS لإعداد ومعالجة PCLS. حافظ على برودة محلول HBSS على الجليد عند تحضير PCLSs.
  2. قم بإعداد الوسط الاستزراعي ل PCLS عن طريق استكمال Dulbecco's Modified Eagle Medium و F-12 (DMEM-F12) بعامل مضاد حيوي مضاد للفطريات (نسبة حجم 1:100 ، انظر جدول المواد).
  3. تحضير 1.5 ٪ من محلول الأغاروز و 6 ٪ من محلول الجيلاتين.
    1. امزج مسحوق الأغاروز أو الجيلاتين منخفض درجة الانصهار (LMP) (انظر جدول المواد) مع محلول HBSS بشكل منفصل في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 مل (أو أنابيب 50 مل إذا كان حجم المحلول >10 مل) إلى التركيزات النهائية.
      ملاحظة: الحجم الإجمالي لمحلول الأغاروز = 5 مل / ماوس × عدد الفئران ؛ محلول الجيلاتين = 2 مل / فأر × عدد الفئران.
    2. سخني أنابيب المحلول في الماء المغلي حتى يذوب المسحوق تماما. احتفظ بكل من محاليل الأغاروز والجيلاتين في حمام مائي 42 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مصباح التسخين الموجود على طاولة التشريح مفيدا للحفاظ على بيئة التشغيل دافئة ومنع محلول الأغاروز من التصلب قبل حقنه في رئة الماوس.
  4. قم بغمر جميع أدوات التشريح ، بما في ذلك زوج من مقص التشريح ، وزوجان من ملقط التشريح الدقيق المنحني ، وزوج من ملقط مرقئ في محلول الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل للتعقيم.
  5. حافظ على اهتزاز جاهز (انظر جدول المواد) لتقسيم أنسجة الرئة إلى شرائح رقيقة.
  6. احتفظ بمجهر مقلوب لتباين الطور باستخدام كاميرا CCD لتقييم استجابات مجرى الهواء أو انقباض الأوعية الدموية ومجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر مصمم خصيصا (انظر جدول المواد) لتقييم إشارات Ca2+ في SMCs الرئوية18.

2. تضخم رئتي الفأر بمحلول الأغاروز والجيلاتين

  1. القتل الرحيم للماوس.
    1. ضع الماوس في غرفة بلاستيكية (حوالي 750 سم3) مع 5٪ isoflurane. احتفظ بالماوس في الغرفة حتى يتوقف عن التنفس لمدة 1 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن تطبيق طرق القتل الرحيم الأولية الأخرى، مثل الحقن داخل الصفاق للكيتامين (240 مغ/كغ) والزيلازين (32 مغ/كغ)19 أو بنتوباربيتال (0.3 مل)20، كبدائل للإيزوفلوران المستنشق.
    2. ضع جسم الماوس على لوحة تشريح في وضع الاستلقاء. قم بإصلاح الجسم في موضعه عن طريق تثبيت الذيل والكفوف الأمامية والرأس باستخدام إبر حقنة 25 جم ، وقم بتعقيم الجسم باستخدام رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪.
    3. اقطع بطن الفأر بمقص جراحي (شق ، طوله ~ 2 سم × عرضه 2 سم). ثم ، قطع الشريان الأورطي البطني لاستنفاد حجم الدم.
  2. تضخيم فصوص الرئة باتباع الخطوات أدناه.
    1. افتح تجويف الصدر بعناية على طول القص والقفص الصدري السفلي الثنائي فوق الحجاب الحاجز ، ولاحظ انهيار فصوص الرئة عند فتح تجويف الصدر.
    2. إزالة جزء من الأقفاص الصدرية البطنية الثنائية لفضح القلب. تجنب تلف الرئة عن طريق توجيه طرف المقص الحاد بعيدا عن أنسجة الرئة.
    3. استخدم الملقط لفصل الغدة الصعترية والأنسجة الرخوة في عنق الفأر لفضح القصبة الهوائية.
    4. قم بقص ثقب صغير (قطره 1.2 مم) في الطرف العلوي من القصبة الهوائية مما يسمح بمرور طرف قسطرة وريدية على شكل حرف Y بحجم 20 جم (انظر جدول المواد).
    5. قم بتوصيل منفذ محول واحد من القسطرة على شكل حرف Y بحقنة 3 مل مملوءة مسبقا ب 0.5 مل من الهواء ، والمنفذ الآخر بحقنة 3 مل معبأة مسبقا ب 2 مل من محلول الأغاروز الدافئ بنسبة 1.5٪ (42 درجة مئوية).
    6. حقن محلول الأغاروز لملء القسطرة ثم دفع القسطرة من خلال فتحة القطع مسبقا في القصبة الهوائية لمدة 5-8 مم في الطول.
    7. حقن محلول الأغاروز ببطء في حوالي 1 مل / 5 ثانية. سوف تتوسع الرئة على طول المحور القريب إلى البعيد. توقف عن الحقن عندما يتم تضخيم حافة كل فص رئة.
      ملاحظة: لا تبالغ في تضخيم الرئة، لأن هذا يمكن أن يمزقها. يبلغ حجم محلول agarose لتضخيم الرئة الكاملة لفأر شاب بالغ حوالي 1.3 ± 0.1 مل.
    8. حقن 0.2-0.3 مل من الهواء من المحقنة الأخرى لدفع الأغاروز المتبقي في القسطرة والشعب الهوائية الموصلة إلى الفضاء الحويصلات الهوائية البعيدة.
    9. أغلق القصبة الهوائية بزوج من ملقط مرقئ منحني (انظر جدول المواد).
  3. املأ الأوعية الدموية الرئوية.
    1. املأ حقنة 1 مل بالجيلاتين الدافئ بنسبة 6٪. قم بالاتصال بقسطرة وريد فروة الرأس بالإبرة ، واملأ القسطرة بمحلول الجيلاتين ، ثم ثقب البطين الأيمن بالقرب من الجدار السفلي بالإبرة.
    2. ادفع الإبرة إلى البطين الأيمن لطول 2-3 مم ووجه طرف الإبرة إلى الشريان الرئوي الرئيسي.
    3. حقن 0.2 مل من محلول الجيلاتين ببطء في البطين الأيمن والأوعية الشريانية الرئوية.
      ملاحظة: تبدو فصوص الرئة شاحبة قليلا مع تضخم الجيلاتين المناسب.
    4. حافظ على الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق بعد الحقن ، وقم بتبريد فصوص الرئة عن طريق سكب محلول HBSS البارد على القلب والرئة ، ثم ضع الجسم مع لوح التشريح في ثلاجة 4 درجات مئوية أو على الجليد لمدة 10 دقائق.
    5. قم بإزالة رئة الفأر والقلب من الأنسجة الضامة المحيطة باستخدام المقص. ثم افصل كل فص رئوي واحتفظ به في محلول HBSS على الجليد.

3. تقسيم فصوص الرئة إلى شرائح رقيقة

  1. قم بتقليم وربط فص الرئة في الجزء العلوي من عمود العينة باستخدام الغراء الفائق ، وتوجيه الفص (الشكل 1A ، B) للسماح لاتجاه القطع بأن يكون عموديا على معظم الشعب الهوائية من الهيلا إلى سطح الرئة.
  2. استخدم اهتزازا مع شفرة حلاقة رقيقة جديدة لقطع فص الرئة إلى شرائح 150 ميكرومتر. اجمع الشرائح في أطباق بتري معقمة مقاس 100 مم معبأة مسبقا بمحلول HBSS البارد.
    ملاحظة: اضبط سرعة تحريك الشفرة المناسبة وتردد التذبذب قبل بدء التقطيع. الإعداد النموذجي للضغط هو مستوى السرعة 4 ومستوى التذبذب 4.
  3. انقل الشرائح إلى أطباق بتري المملوءة بوسط ثقافة DMEM / F-12 (20 شريحة / 15 مل متوسطة / طبق) واحتفظ بها في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل التجارب.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على PCLSs الماوس في الثقافة لمدة 7 أيام تقريبا دون فقدان استجابات انقباض مجرى الهواء17. لم يتم تقييم طول عمر الشرايين الرئوية بدقة. في ملاحظتنا ، فإنها تحتفظ ببنية سليمة ورد فعل وعائي لمدة 3 أيام على الأقل في وسط DMEM / F12. للتخزين على المدى الطويل ، يمكن وضع PCLSs الماوس في cryovials مليئة بوسط DMEM / F12 الذي يحتوي على 10٪ DMSO (5 شرائح في 1 مل وسط لكل قارورة) ، وتجميدها في حاوية مملوءة بالكحول الأيزوبروبيل عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، والمحفوظة في الثلاجة في النيتروجين السائل لأسابيع إلى أشهر21.

4. تحليل الاستجابات الانقباضية للممرات الهوائية والشرايين داخل الرئة

  1. ضع PCLSs في لوحة استزراع مملوءة ب HBSS مكونة من 24 بئرا ، واحدة في كل بئر. حدد موقع PCLS في منتصف البئر ، ثم قم بإزالة محلول HBSS باستخدام ماصة.
  2. ابحث عن مجرى الهواء المستهدف والأوعية في الشريحة تحت المجهر ، ثم قم بتغطية الشريحة باستخدام شبكة نايلون مع ثقب مركزي مقطوع مسبقا (قطره 2-3 مم) لفضح المنطقة المستهدفة.
  3. ضع غسالة معدنية مجوفة فوق الشبكة لتثبيت الشرائح في مكانها (الشكل 2A).
  4. أضف 600 ميكرولتر من محلول HBSS لغمر PCLS. ضع الشريحة لمدة 10 دقائق، ثم سجل الصور الأساسية للممرات الهوائية أو السفن.
  5. حث مجرى الهواء أو تقلص الأوعية الدموية عن طريق شفط محلول HBSS الفارغ بحذر باستخدام ماصة وإضافة 600 ميكرولتر من HBSS مع ناهض ، مثل 1 ميكرومتر من الميثاكولين (MCh) أو 10 نانومتر من الإندوثيلين (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تحفيز KCl كمعيار لمجموعة الأدوات غير مطلوب قبل التعرض للميثاكولين أو الإندوثيلين. 100 mM من تحفيز KCl في الشعب الهوائية للفئران يحفز فقط تقلص مجرى الهواء الصغير وغير المنتظم (10٪ -15٪)20. وبالمثل ، فإن تحفيز الميثاكولين التحضيري غير ملزم لأننا أكدنا أن نفس المنبهات ، على سبيل المثال ، الميثاكولين أو السيروتونين ، يؤدي إلى تقلص مجرى الهواء المماثل في التعرض الأول والمتكرر20,22.
  6. راقب التفاعل تحت المجهر حتى يصل تغيير المنطقة المضيئة إلى حالة توازن ، ثم سجل صور مجرى الهواء أو الأوعية الدموية لتحليلها.
  7. قم بإزالة محلول MCh أو endothelin باستخدام ماصة وإضافة محلول HBSS جديد سعة 600 ميكرولتر بنفس تركيز ناهض ومرخي ؛ مراقبة وتسجيل مجرى الهواء أو استرخاء الأوعية الدموية.
  8. حدد كمية مجرى الهواء أو تفاعل الأوعية الدموية باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بتحميل الصور إلى برنامج FIJI المجاني الذي ترعاه المعاهد الوطنية للصحة.
    2. حدد تحديد المضلع في شريط الأدوات لتحديد مجرى الهواء أو تجويف الأوعية الدموية على كل إطار.
    3. اختر تحليل > مجموعة قياسات > منطقة.
    4. اختر تحليل > قياس لتحديد مجال الاهتمام. يتم عرض النتائج في نافذة منفصلة للتحليل الإحصائي.

5. تحليل إشارات Ca2+ للمجرى الهوائي أو SMCs الوعائية

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحميل الصبغة Ca2+ .
    1. قم بإذابة صبغة Ca2+ ، أوريغون جرين 488 BAPTA-1-AM (انظر جدول المواد) ، 50 ميكروغرام (قارورة واحدة) مع 10 ميكرولتر من DMSO.
    2. قم بإذابة 0.2 جم من مسحوق Pluronic F-12 (انظر جدول المواد) في 1 مل من DMSO لإنشاء محلول Pluronic بنسبة 20٪.
    3. امزج 10 ميكرولتر من محلول Pluronic بنسبة 20٪ مع 10 ميكرولتر من محلول صبغة Ca2+ DMSO.
    4. اجعل Ca 2+ مخزن مؤقت لتحميل الصبغة عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من الخليط إلى 2 مل من محلول HBSS مع200 ميكرومتر من السلفوبروموفثالين (انظر جدول المواد).
  2. ضع 15 PCLSs بالماوس في 2 مل من مخزن التخزين المؤقت للتحميل Ca2+ واحتضنه عند 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم حرك الشرائح إلى 2 مل من محلول HBSS مع 100 ميكرومتر من السلفوبروموفثالين لمدة 30 دقيقة إضافية لإزالة أسترة صبغة الفلورسنت في درجة حرارة الغرفة.
  3. الكشف عن إشارات Ca2+ من SMCs.
    1. ضع شرائح Ca2+ المحملة بالصبغة على غطاء زجاجي كبير.
    2. املأ حقنة سعة 3 مل بشحوم سيليكون عالية الفراغ. اضغط على الشحوم من خلال إبرة مخففة بوزن 18 جم لرسم خطين متوازيين عبر زجاج الغطاء أعلى وأسفل الشريحة.
    3. غطي الشريحة باستخدام شبكة نايلون بين خطين من الشحوم. ضع زجاج الغطاء الثاني فوق الشبكة لإنشاء غرفة مغلقة بالشحوم على الجانبين (الشكل 3A).
      ملاحظة: شبكة النايلون ضرورية للحفاظ على الشريحة متصلة بالغطاء السفلي وبالتالي البقاء ضمن مسافة العمل لهدف مقلوب عالي الحجم ، مثل زيت 40x.
    4. أضف HBSS أو محلول ناهض إلى الغرفة من طرف واحد عن طريق السحب يدويا أو عبر نظام التروية. قم بإزالة السائل من الغرفة عن طريق الشفط من الطرف الآخر باستخدام المناديل الورقية أو الفراغ في حالة تروية السوائل المستمرة.
    5. ضع غرفة PCLS على مرحلة المجهر. اكتشف إشارات Ca 2+ ل SMC23 باستخدام مجهر بؤري بؤري ضوئي رنين مصمم خصيصا بمعدل مسح ضوئي بالليزر يبلغ 15 أو 30 صورة / صورة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق مجهر بؤري بؤري المسح الضوئي بالليزر التجاري عالي السرعة ، وهو متاح على نطاق واسع في الوقت الحاضر ، في فحص إشارات Ca2 + ل SMCs الرئوي في PCLS.
  4. حدد كميا التألق Ca2+ في SMCs.
    1. قم بتحميل تسلسل الصور المسجلة إلى FIJI واختر نوع الصورة > > تدرج رمادي 8 بت.
    2. حدد تحديد المستطيل في شريط الأدوات وحدد منطقة اهتمام 5 بكسل × 5 بكسل (ROI) في خلية عضلية ملساء.
    3. اختر تحليل > تعيين القياسات > متوسط القيمة الرمادية ، التي تمثل كثافة التألق Ca2+ .
    4. إذا تغير موضع عائد الاستثمار مع انكماش SMC، فاختر تحليل > قياس كثافة الفلورسنت Ca2+ إطارا تلو الآخر.
    5. إذا ظل عائد الاستثمار ل SMC في موضع مماثل في مكدس من الصور، فاختر مكدسات > الصور > مكدس قياس كثافة الفلورسنت Ca2+ .
      ملاحظة: يمكن توصيل ماكرو مكتوب خصيصا لتتبع عائد الاستثمار داخل SMC عندما يتحرك مع انكماش في مكدس صورة ويقيس تلقائيا كثافة Ca2+ (القيمة الرمادية) لعائد الاستثمار إطارا تلو الآخر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد PCLS الماوس الحفاظ على الشعب الهوائية داخل الرئة سليمة والشرايين
وقد لوحظت PCLS بسماكة 150 ميكرومتر تحت مجهر تباين الطور المقلوب. في رئتي الفأر ، تكون الشعب الهوائية الموصلة مصحوبة بشرايين داخل الرئة ، تمتد من التلال إلى الرئة الطرفية. يظهر الشكل 2B حزمة تمثيلية للمجرى الهوائي الرئوي في PCLS للماوس. يمكن التعرف بسهولة على مجرى الهواء بواسطة الخلايا الظهارية المكعبة مع الضرب الأهداب النشطة التي تبطن السطح الداخلي للتجويف. في المقابل ، يتميز الشريان الرئوي القريب ببطا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن إعداد PCLS عدة خطوات حاسمة. أولا ، من الضروري تضخيم فص الرئة بشكل متجانس لتجنب اختلاف تصلب الأنسجة عن توزيع الأغاروز غير المتساوي. نظرا لأن الأغاروز السائل يتدفق بسرعة في القسطرة الرقيقة أو الشعب الهوائية عند درجة حرارة أقل من 37 درجة مئوية ، فإن عيب الملء الناتج في مجال الرئة البعيد يمكن أن يزيد من تباين تصلب أنسجة الرئة ويسبب تمزق الأنسجة أثناء قسم الاهتزاز. لذلك ، يمكن ممارسة الحفاظ على محلول الأغاروز منخفض الذوبان عند 42 درجة مئوية في حمام مائي واستخدام مصباح تسخين على طاولة التشريح لتجنب تبلور الأغاروز السريع....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة ، K08135443 (Y.B) ، 1R01HL132991 (X.A).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل حقنةBD309626
15 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمةCelltreat229411
3 مل حقنةBD309585
50 مل أنابيب الطرد المركزي المعقمةCelltreat229422
أسيتيل بيتا ميثاكولينميليبور سيجما62-51-1
المضادات الحيوية المضطردةللحرارة فيشر15240-062
CCD-cameraنيكونDS-Ri2
غطاء كاميرا glassessmentفيشر Scientific12-548-5CP; 12-548-5PP
قوارير مبردةفيشر Scientific430488
مجهرالمصمم خصيصا تفاصيل في المرجع 18
DMEM / F12Fisher ScientificMT-10-092-CM
Endothelin 1Millipore SigmaE7764
مقص تشريح ناعمحاوية تجميد فيشر ScientificNC9702861
Sigma-AldrichC1562
الجيلاتين من جلد الخنازيرSigma-Aldrich9000-70-8
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)ثيرمو فيشرملقط مرقئ 14025092
فيشر Scientific16-100-117
HEPESThermo Fisher15630080
شحم سيليكون عاليالفراغ فيشر Scientific146355d
كحول الأيزوبروبيلسيجما ألدريتشW292907-1KG-K
غسالات معدنيةهوم ديبوت سلطة المنتجات800442إيفربيلت غسالات مسطحة # 10
ملقط تشريح دقيقSigma-AldrichF4142
مجموعة وريد فروة الرأس بإبرة (25 جم)EXELINT26708
NOC-5Cayman Chemical16534
شبكة نايلونتوريد مكوناتU-CMN-300
أوريغون أخضر 488 BAPTA-1 AMLife Technologieso-6807
تباين الطور مجهرنيكوننيكون كسوف TS 100
بلورونيك F-127ثيرمو فيشرP-6867
شفرات الحلاقةPersonnaPersonna شفرات حلاقة مزدوجة الحواف في غلاف أبيض 100 عدد
SulfobromophthaleinSigma-AldrichS0252
SuperglueKrazy GlueKrazy Glue ، جميع الأغراض
منخفضة عالية النقاء نقطة الانصهار الاغاروزThermo Fisher16520050
VibratomePrecisionaryVF 310-0Z
كتلة تقشعر لها الأبدان الاهتزازدقيقةSKU-VM-CB12.5-NC
أنبوب عينة الاهتزازدقيقSKU VF-SPS-VM-12.5-NC
Y على شكل قسطرة IVBD383336BD Saf-T-Intima قسطرة IV مغلقة
نيكون متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prakash, Y. S. Emerging concepts in smooth muscle contributions to airway structure and function: implications for health and disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 311 (6), 1113-1140 (2016).
  2. Lechartier, B., et al. Phenotypic diversity of vascular smooth muscle cells in pulmonary arterial hypertension: implications for therapy. Chest. 161 (1), 219-231 (2022).
  3. Doeing, D. C., Solway, J. Airway smooth muscle in the pathophysiology and treatment of asthma. Journal of Applied Physiology. 114 (7), 834-843 (2013).
  4. McGovern, T. K., et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (75), e50172(2013).
  5. Bikou, O., et al. Induction and characterization of pulmonary hypertension in mice using the hypoxia/SU5416 model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (160), e59252(2020).
  6. Stenmark, K. R., et al. Dynamic and diverse changes in the functional properties of vascular smooth muscle cells in pulmonary hypertension. Cardiovascular Research. 114 (4), 551-564 (2018).
  7. Bai, Y., Zhang, M., Sanderson, M. J. Contractility and Ca2+ signaling of smooth muscle cells in different generations of mouse airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (1), 122-130 (2007).
  8. Chin, L. Y., et al. Human airway smooth muscle is structurally and mechanically similar to that of other species. The European Respiratory Journal. 36 (1), 170-177 (2010).
  9. Wang, P., et al. Inflammatory mediators mediate airway smooth muscle contraction through a G protein-coupled receptor-transmembrane protein 16A-voltage-dependent Ca(2+) channel axis and contribute to bronchial hyperresponsiveness in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1259-1268 (2018).
  10. Currigan, D. A., et al. Vasoconstrictor responses to vasopressor agents in human pulmonary and radial arteries: an in vitro study. Anesthesiology. 121 (5), 930-936 (2014).
  11. Halayko, A. J., et al. Divergent differentiation paths in airway smooth muscle culture: induction of functionally contractile myocytes. The American Journal of Physiology. 276 (1), 197-206 (1999).
  12. Worth, N. F., et al. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49 (3), 130-145 (2001).
  13. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  14. Placke, M. E., Fisher, G. L. Adult peripheral lung organ culture-a model for respiratory tract toxicology. Toxicology and Applied Pharmacology. 90 (2), 284-298 (1987).
  15. Fisher, G. L., Placke, M. E. In vitro models of lung toxicity. Toxicology. 47 (1-2), 71-93 (1987).
  16. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary arterioles is determined by the frequency of Ca2+ oscillations induced by 5-HT and KCl. The Journal of General Physiology. 125 (6), 555-567 (2005).
  17. Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480(2020).
  18. Sanderson, M. J., Parker, I. Video-rate confocal microscopy. Methods in Enzymology. 360, 447-481 (2003).
  19. Kolbe, U., et al. Early cytokine induction upon pseudomonas aeruginosa infection in murine precision cut lung slices depends on sensing of bacterial viability. Frontiers in Immunology. 11, 598636(2020).
  20. Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
  21. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (5), 876-881 (2014).
  22. Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).
  24. Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).
  25. Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations. The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).
  26. Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).
  27. Patel, K. R., et al. Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).
  28. Aven, L., et al. An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).
  29. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  30. Wu, X., et al. Mouse lung tissue slice culture. Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).
  31. Bai, Y., et al. CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).
  32. Khan, M. M., et al. An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices. The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).
  33. Kennedy, J. L., et al. Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).
  34. Bai, Y., et al. Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).
  35. Mondoñedo, J. R., et al. A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure. Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).
  36. Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).
  37. Ram-Mohan, S., et al. Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة