مقالة منهجية

مفاعل حيوي متعدد التيار للتروية مدمج مع تجزئة المخرج لزراعة الخلايا الديناميكية

DOI:

10.3791/63935

⸱

يوليو 20, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biochemical Engineering, Rutgers University, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Medicine, Rutgers Biomedical Health Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الورقة طريقة لبناء وتشغيل نظام منخفض التكلفة متعدد القنوات لزراعة خلايا التروية لقياس ديناميكيات إفراز ومعدلات امتصاص المذابات في العمليات الخلوية. يمكن للنظام أيضا تعريض الخلايا لملفات تعريف التحفيز الديناميكية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل بعض وظائف الخلايا والأنسجة ضمن النطاق الزمني الديناميكي من دقائق إلى ساعات يتم حلها بشكل سيئ بواسطة أنظمة الزراعة التقليدية. وقد طور هذا العمل نظاما منخفض التكلفة للمفاعل الحيوي للتروية يسمح بدمج وسط الاستزراع باستمرار في وحدة زراعة الخلايا وتقسيمه في وحدة المصب لقياس الديناميكيات على هذا النطاق. تم بناء النظام بالكامل تقريبا من الأجزاء المتاحة تجاريا ويمكن موازاته لإجراء تجارب مستقلة في لوحات زراعة الخلايا التقليدية متعددة الآبار في وقت واحد. توضح مقالة الفيديو هذه كيفية تجميع الإعداد الأساسي ، والذي لا يتطلب سوى مضخة حقنة واحدة متعددة القنوات وجامع أجزاء معدل لدمج ما يصل إلى ست ثقافات بالتوازي. كما يتم تقديم متغيرات مفيدة على التصميم المعياري تسمح بديناميكيات التحفيز التي يتم التحكم فيها ، مثل النبضات المذابة أو الملامح الشبيهة بالحرائك الدوائية. الأهم من ذلك ، عندما تنتقل الإشارات المذابة عبر النظام ، فإنها مشوهة بسبب تشتت المذاب. علاوة على ذلك ، يتم وصف طريقة لقياس توزيعات وقت الإقامة (RTDs) لمكونات إعداد التروية باستخدام جهاز تتبع باستخدام MATLAB. RTDs مفيدة لحساب كيفية تشويه الإشارات المذابة بسبب التدفق في نظام المقصورات المتعددة. هذا النظام قوي للغاية وقابل للتكرار ، لذلك يمكن للباحثين الأساسيين اعتماده بسهولة دون الحاجة إلى مرافق تصنيع متخصصة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث العديد من العمليات البيولوجية الهامة في مزارع الخلايا والأنسجة على مقياس زمني من دقائق إلى ساعات 1,2,3. في حين أن بعض هذه الظواهر يمكن ملاحظتها وتسجيلها بطريقة آلية باستخدام المجهربفاصل زمني 4 أو التلألؤ الحيوي1 أو طرق أخرى ، فإن التجارب التي تنطوي على جمع عينات من المستنبتات الفائقة للتحليل الكيميائي غالبا ما يتم إجراؤها يدويا في مزارع الخلايا الثابتة. يحد أخذ العينات اليدوي من جدوى بعض الدراسات بسبب إزعاج النقاط الزمنية المتكررة أو بعد ساعات العمل. وتشمل أوجه القصور الأخرى في أساليب الزراعة الثابتة التجارب التي تنطوي على التعرض الخاضع للرقابة والعابرة للمحفزات الكيميائية. في الثقافات الثابتة ، يجب إضافة المحفزات وإزالتها يدويا ، وتقتصر ملفات تعريف التحفيز على تغييرات الخطوة بمرور الوقت ، بينما تضيف التغييرات المتوسطة أيضا مكونات متوسطة أخرى وتزيلها ، والتي يمكن أن تؤثر على الخلايا بطريقة غير منضبطة5. يمكن للأنظمة الموائعة التغلب على هذه التحديات ، لكن الأجهزة الحالية تشكل تحديات أخرى. تأتي أجهزة الموائع الدقيقة مع التكاليف الباهظة للمعدات المتخصصة والتدريب على الإنتاج والاستخدام ، وتتطلب أساليب التحليل الدقيق لمعالجة العينات ، ويصعب استرداد الخلايا من الأجهزة بعد التروية6. تم إنشاء عدد قليل من أنظمة الموائع الكبيرة لأنواع التجارب الموضحة هنا7،8،9،10 ، وهي مبنية من أجزاء مخصصة متعددة مصنوعة داخليا وتتطلب مضخات متعددة أو جامعي كسر. علاوة على ذلك ، فإن المؤلفين ليسوا على دراية بأي أنظمة متاحة تجاريا لزراعة خلايا التروية الموائع الكبيرة بخلاف المفاعلات الحيوية للخزانات المقلوبة لزراعة التعليق ، والتي تعد مفيدة للتصنيع الحيوي ، على الرغم من أنها ليست مصممة لنمذجة ودراسة علم وظائف الأعضاء.

وكان المؤلفون قد أبلغوا سابقا عن تصميم نظام مفاعل حيوي منخفض التكلفة للإرواء يتكون بالكامل تقريبا من الأجزاء11 المتاحة تجاريا. تمكن النسخة الأساسية من النظام من الاحتفاظ بثقافات متعددة في صفيحة بئر في حاضنة CO2 ودمجها باستمرار مع وسيط من مضخة حقنة ، في حين يتم تقسيم تيارات وسط النفايات السائلة من الثقافات تلقائيا إلى عينات بمرور الوقت باستخدام جامع أجزاء مع تعديل مخصص. وبالتالي ، يتيح هذا النظام أخذ عينات آلية من المدخلات المتوسطة للثقافة الفائقة والمذابة المستمرة للثقافات بمرور الوقت. النظام هو macrofluidic ووحدات ويمكن تعديله بسهولة لتلبية احتياجات تصاميم التجارب الجديدة.

الهدف العام للطريقة المعروضة هنا هو بناء وتوصيف واستخدام نظام زراعة خلايا التروية الذي يتيح إجراء تجارب يتم فيها قياس معدلات إفراز أو امتصاص المواد بواسطة الخلايا بمرور الوقت ، و / أو تعرض الخلايا لإشارات مذابة دقيقة وعابرة. تشرح مقالة الفيديو هذه كيفية تجميع الإعداد الأساسي ، القادر على اختراق ما يصل إلى ست مزارع خلايا في وقت واحد باستخدام مضخة حقنة واحدة وجامع أجزاء معدلة. كما يتم عرض متغيرين مفيدين على النظام الأساسي يستخدمان مضخات وأجزاء إضافية للسماح بإجراء تجارب تعرض الخلايا لإشارات تركيز ذائبة عابرة ، بما في ذلك النبضات القصيرة والملامح الشبيهة بالحركية الدوائية12 ، كما هو موضح في الشكل 1.

figure-introduction-1
الشكل 1: ثلاثة اختلافات في تصميم نظام التروية. (أعلى) نظام التروية الأساسي. (الوسط) نظام التروية مع stopcock لمصادر متوسطة متعددة. (أسفل) نظام التروية مع خزان مقلب لتقليد حجم مختلط جيدا من التوزيع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بسبب التشتت والانتشار داخل التدفق ، تصبح الإشارات المذابة مشوهة أو "ملطخة" أثناء انتقالها عبر نظام التدفق. ويمكن تحديد هذا التشويه كميا من خلال استخدام توزيعات وقت الإقامة (RTDs)13. تشرح هذه المقالة كيفية إجراء تجارب التتبع على مكونات نظام التروية (الشكل 2)، وتوفر البرامج النصية MATLAB لإنشاء RTDs من البيانات المقاسة. ويمكن الاطلاع على شرح مفصل لهذا التحليل في الورقة السابقةللمؤلفين رقم 11. تناسب نصوص MATLAB الإضافية الوظائف المناسبة ل RTDs وتستخرج المعلمات الفيزيائية ، وتؤدي التفاف الإشارة باستخدام RTDs للتنبؤ بكيفية انتشار وتشويه إدخال الإشارة المذاب من قبل المستخدم من خلال نظام التروية14.

figure-introduction-2
الشكل 2: توزيعات وقت الإقامة. يتم قياس RTDs لمكونات نظام التدفق ، مثل طول الأنابيب هذا ، عن طريق إدخال نبضة من المقتفي إلى النظام وقياس كيفية "تلطيخها" بحلول الوقت الذي تخرج فيه إلى الكسور التي تم جمعها. وقد عدل هذا الرقم من Erickson et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد أجزاء لتروية لوحة البئر

  1. إعداد الأنابيب
    1. قطع طولين من أنابيب السيليكون (القطر الداخلي 1.6 مم) لكل مزرعة خلية ليتم اختراقها. تأكد من أن القطعة المستخدمة كأنبوب المنبع طويلة بما يكفي للوصول من مضخة المحاقن إلى مزرعة الخلايا داخل الحاضنة ، وأن القطعة النهائية يمكن أن تصل من مزرعة الخلايا إلى أبعد موضع ممتد لجامع الكسر.
    2. امنح كل قطعة من الأنابيب ملصقا فريدا على طرفيها بشريط لاصق.
  2. تحضير سدادات للوحة البئر
    1. احصل على سدادة سيليكون واحدة لكل بئر من صفيحة البئر ليتم اختراقها ، مع قطر مناسب ليتناسب بشكل مريح مع الآبار مع ختم محكم الإغلاق.
    2. اقطع المواد الزائدة من قيعان السدادة بحيث تتناسب مع الآبار مع ترك مساحة في الداخل للهواء فوق مستوى السائل المقصود.
    3. ادفع إبرتين حادتين بوزن 18 جراما من خلال كل سدادة ، إلى الأعلى والخارج من الأسفل لتكون بمثابة مدخل ومخرج للتدفق عبر البئر ، مقابل بعضهما البعض تماما لزيادة المسافة بين أطرافها داخل البئر.
    4. اضبط ارتفاعات الإبر داخل البئر الموصول ، حيث سيحدد ارتفاع إبرة المخرج الارتفاع المستقر لمستوى السائل في البئر أثناء التروية.
      ملاحظة: إذا بدأ التروية بإبرة المخرج فوق مستوى السائل ، فسوف يتراكم السائل في البئر حتى يصل المستوى إلى الإبرة. إذا بدأ التروية بإبرة المخرج تحت مستوى السائل ، فسيبقى مستوى السائل ثابتا ما لم تتدفق فقاعات الهواء إلى البئر ، مما سيؤدي إلى انخفاض ارتفاع السائل حتى يكون نفس ارتفاع إبرة المخرج.
  3. جمع أجزاء إضافية
    1. احصل على حقنة معقمة واحدة لكل مزرعة خلية ليتم تشغيلها وهي كبيرة بما يكفي لاحتواء وسط كاف للتروية بأكملها ، بالإضافة إلى كمية إضافية من الوسط لملء الأنابيب في البداية.
    2. لكي يتم الاطلاع على كل ثقافة ، احصل على موصل Luer واحد من الإناث إلى الانتقادات اللاذعة وموصلين من الذكور إلى اللوح ، بالإضافة إلى اثنين من الإناث واثنين من قبعات Luer للذكور.
  4. تنظيف وتعقيم الأجزاء
    1. إذا تم استخدام الأجزاء من قبل ، فقم بتنظيفها عن طريق دمجها ب 0.1 N NaOH ، تليها شطف بالماء منزوع الأيونات.
    2. عن طريق التعقيم أو غير ذلك ، تأكد من عقم جميع الأجزاء المذكورة أعلاه.

2. قطع الموزع متعدد الرؤوس بالليزر وإرفاقه بجامع الكسر

  1. أعد إنشاء نموذج موزع متعدد الرؤوس من الشكل 3 في برنامج تصميم بمساعدة الكمبيوتر أو قم بتنزيل ملف DXF للنموذج المقدم (الملف التكميلي 1).
  2. استخدم قاطع ليزر لقطع التصميم من 1/8 في ورقة أكريليك.
  3. قم بإزالة البراغي الثلاثة التي تربط رأس التوزيع بالقاعدة المتحركة لجامع الكسور.
  4. قم بمحاذاة أصغر ثلاثة ثقوب في الموزع متعدد الرؤوس مع ثقوب المسمار في القاعدة المتحركة ، وقم بربط البراغي مرة أخرى من خلال الثقوب لتثبيتها.
  5. اضبط ضيق البراغي الثلاثة لزاوية الموزع متعدد الرؤوس لأعلى ولأسفل حتى يتم محاذاة صف فتحات التوزيع مع أنابيب التجميع الموجودة أسفله.
  6. ضع بعناية 300 ميكرولتر من أطراف الماصة من خلال الثقوب المطلوبة لتكون بمثابة نصائح للتوزيع.
    ملاحظة: يمكن استخدام جامع الكسور بدون موزع متعدد الرؤوس لدمج مزرعة خلية واحدة.

3. قياس RTDs المكون وإجراء التفاف الإشارة

  1. قم بإعداد مضخات ومحاقن لنبض التتبع كما هو موضح في الشكل 2.
    1. احصل على مضختي محاقن أحادية القناة أو متعددة القنوات.
    2. اختر حلا للخلفية لتمثيل الوسط الذي سيتم استخدامه في نظام التدفق أثناء تجارب زراعة الخلايا. تأكد من أن حل الخلفية له خصائص نقل كتلة مماثلة للوسيط. في كثير من الحالات ، يكون الماء منزوع الأيونات خيارا مناسبا.
    3. اختر مادة تتبع لتمثيل المذاب الذي سيكون ذا أهمية أثناء تجارب زراعة الخلايا. تأكد من أن المقتفي له خصائص نقل كتلة مماثلة للمذاب ذي الاهتمام ، ويجب أن يكون تركيزه قابلا للقياس. في كثير من الحالات ، تكون صبغة الطعام خيارا مناسبا.
    4. قم بإذابة مادة التتبع في محلول الخلفية لصنع محلول التتبع.
    5. املأ حقنة واحدة بمحلول خلفية وقم بتحميلها في مضخة حقنة واحدة. املأ حقنة أخرى بمحلول التتبع وقم بتحميلها في مضخة المحقنة الثانية.
    6. قم بتوصيل كلا الحقنتين باثنين من المنافذ الثلاثة لجهاز إيقاف رباعي الاتجاهات باستخدام موصلات Luer.
    7. أغلق السدادة على محلول الخلفية وضخ محلول التتبع في المتوقف حتى يبدأ في التنقيط خارج المنفذ المفتوح. أوقف المضخة ولا تقم بضبط المحقنة أكثر.
      ملاحظة: من المهم أن يتم دفع الشريط المتحرك لمضخة المحقنة لأعلى ضد غطاسات المحقنة قبل بدء الأجزاء الموقوتة من التجربة. سيسمح ذلك ببدء التدفق على الفور عند بدء تشغيل المضخة. خلاف ذلك ، قد يتم تشغيل المضخة ، ولكن التدفق لن يبدأ فعليا حتى يلحق الشريط المتحرك بموضع المكبس.
    8. أغلق الموقوف على محلول التتبع وقم بضخ محلول الخلفية في المتوقف حتى يتم طرد جميع حلول التتبع المتبقية من المنفذ المفتوح. أوقف المضخة ولا تقم بضبط المحقنة أكثر.
  2. إعداد مكون نظام التدفق محل الاهتمام وجامع الكسور
    1. قم بإعداد مكون نظام التدفق المطلوب لتحليل RTD. تأكد من أن المكون المراد قياسه ينتهي بقطعة من أنابيب المصب ذات الطول والمرونة المناسبين للوصول إلى جامع الكسور أثناء التشغيل.
    2. أدخل نهاية أنبوب المصب في موزع طرف ماصة في موزع متعدد الرؤوس بحيث يكون متصلا بشكل مريح.
    3. قم بتوصيل المنفذ المفتوح لجهاز التوقف رباعي الاتجاهات بمدخل المكون المراد قياسه. قم بضخ محلول الخلفية من خلال المكون حتى يتم ملؤه بالكامل كما هو الحال أثناء تجربة زراعة الخلايا ، ويبدأ في التنقيط من طرف توزيع جامع الكسور. أوقف المضخة.
  3. حقن نبض المقتفي، وجمع الكسور، وقياس المقتفي
    1. اضبط مضخة محلول التتبع على معدل التدفق المطلوب. أغلق الموقوف إلى حل الخلفية وابدأ تدفق حل التتبع. في الوقت نفسه ، ابدأ جامع الكسور.
    2. استمر في تدفق محلول التتبع لفترة قصيرة من الزمن لتقريب إدخال الدافع للمقتفي. تم العثور على مدة نبض مدتها 10 دقائق تعمل بشكل جيد مع RTDs بمعدل تدفق 1 مل / ساعة.
      ملاحظة: إذا كان نبض المقتفي قصيرا جدا، فلن يدخل المقتفي الكافي إلى التدفق ليكون قابلا للقياس. إذا كان النبض طويلا جدا ، فلن يقترب بعد الآن من الدافع وسيغير شكل RTD.
    3. في نهاية فترة نبض محلول التتبع ، أوقف مضخة محلول التتبع. أغلق السدادة بسرعة إلى حل التتبع وابدأ تدفق محلول الخلفية بنفس معدل التدفق.
    4. اسمح لمحلول الخلفية بالتدفق وجمع الكسور حتى يمر كل المقتفي عبر النظام وإلى الكسور التي تم جمعها.
    5. أوقف النظام وقم بقياس تركيز المقتفي في الكسور. تشمل فقط الكسور التي تم الاستغناء عنها بالكامل. إذا تم إيقاف المجموعة جزئيا من خلال جمع كسر، فلا تقم بتضمين هذا الكسر.
  4. حساب توزيع وقت الإقامة (RTD) من البيانات المقاسة في MATLAB
    ملاحظة: يمكن العثور على شرح مكتوب للتحليل الذي أجراه نص MATLAB هذا في المنشور السابق للمؤلفين11 ، وتتوفر مناقشات النظرية على نطاق واسع في الأدبيات13.
    1. إنتاج ملف .xlsx يحتوي على بيانات التركيز بتنسيق جدول بيانات example_tracer_data.xlsx المتوفر في الملف التكميلي 2. أدخل قيم تركيز المقتفي في الكسور (أي وحدات) بترتيب زمني من اليسار إلى اليمين في الصف 2. أدخل الوقت المنقضي من بداية النبضة إلى نهاية الكسر الأخير في الخلية A5، وأدخل طول نبضة المقتفي بالدقائق في الخلية A8.
    2. احفظ ملف .xlsx في دليل MATLAB.
    3. افتح البرنامج النصي RTD_From_Data.m، من الملف التكميلي 3، في محرر MATLAB.
    4. استبدل اسم ملف .xlsx الموجود بين قوسين في السطر الأول من قسم تحميل البيانات من البرنامج النصي باسم ملف بيانات .xlsx الجديد، باتباع الإرشادات المكتوبة داخل ملف البرنامج النصي. قم بتشغيل البرنامج النصي.
    5. تأكد من أن البرنامج النصي ينفذ بنجاح تحليل RTD13 ، مما ينتج مخططا ل RTD ويعيد قيمة التكامل العددي على RTD يساوي 1. ابحث عن متجه الوقت (t) ومتجه قيم RTD المقترن (Et) المحفوظ بواسطة البرنامج النصي في دليل MATLAB.
  5. ملاءمة دالة نموذج ل RTD في MATLAB
    1. افتح البرنامج النصي Fit_RTD_Function.m في محرر MATLAB من الملف التكميلي 4.
    2. اختر واحدة من وظائف النموذج الثلاث المعلقة لتتناسب مع RTD: نموذج التشتت المحوري13 ، الذي يناسب RTDs للتدفق الرقائقي في أنابيب أسطوانية ؛ نموذج CSTR13 ، الذي يناسب الدبابات التي يتم تحريكها جيدا ؛ ونموذج n-CSTR15 ، الذي يناسب تقريبا لوحات الآبار الأكبر. لاحتواء نموذج آخر غير مضمن هنا، أضفه إلى البرنامج النصي بنفس التنسيق.
    3. قم بإزالة التعليقات الموجودة في قسم البرنامج النصي الذي يحتوي على النموذج المختار للتركيب.
    4. تغيير قيم التخمينات الأولية للمعلمات إلى قيم مناسبة ل RTD.
    5. قم بتشغيل البرنامج النصي لإنتاج مخطط لدالة الملاءمة المتراكبة على بيانات RTD ولطباعة قيم معلمة الملاءمة للدالة. إذا كان الملاءمة ضعيفا جدا أو حدثت أخطاء ، فقم بتغيير التخمينات الأولية للمعلمة وقم بتشغيل البرنامج النصي مرة أخرى.
  6. إجراء التفاف الإشارة في MATLAB
    1. اختر إما إشارة واحدة و RTD واحدة أو اثنين من RTDs للمشاركة.
    2. افتح البرنامج النصي Signal_Convolution.m، من الملف التكميلي 5، في محرر MATLAB.
    3. بالنسبة لكل من الإشارتين المراد الالتفاف بينهما (أي إشارة واحدة و RTD واحدة ، أو اثنين من RTDs) ، حدد متجها واحدا من النقاط الزمنية المتباعدة بالتساوي في الوحدات المطلوبة ومتجها مقابلا لقيم الإشارة في تلك الأوقات.
      ملاحظة: يجب أن يكون لمتجهات الإشارتين نفس عدد العناصر ونفس خطوات وقت الحجم. هذا هو السبب في أنه من المفيد أن يكون RTD كدالة مستمرة يمكن أخذ عينات منها لعدد تعسفي من النقاط في أي فاصل زمني.
    4. أدخل الإشارتين في MATLAB وقم بتشغيل البرنامج النصي للحصول على متجهات الوقت والإشارة لإشارة الإخراج.

4. إعداد نظام التروية الأساسي مع الخلايا في لوحة البئر

  1. تحضير طبق البئر
    1. تأكد من أن زراعة صفيحة البئر لديها العمق المتوسط المناسب لتجربة التروية. قم بإجراء أي تغييرات متوسطة نهائية أو محفزات أو خطوات أخرى حسب الرغبة قبل البدء في التروية. إذا كانت خلايا التعليق تنصهر ، فقم بطرد مركزي اللوحة للتأكد من أنها في القاع.
    2. في ظل ظروف معقمة ، أدخل السدادات بالإبر في مزارع لوحة البئر مع سحب الإبر. بعد أن تكون السدادة في مكانها ، اخفض الإبر إلى الارتفاع المطلوب للتروية ، حيث يحدد ارتفاع إبرة المخرج مستوى السائل المستقر.
    3. قم بتغطية الإبر بأغطية Luer الذكرية واحتفظ بلوحة البئر بأكملها في حاضنة حتى الاستخدام.
  2. تحضير المحاقن وأنابيب المنبع
    1. في ظل ظروف معقمة، املأ حقنة واحدة لكل مزرعة ليتم دمجها بوسط كاف للمدة المطلوبة من التروية، بالإضافة إلى وسط إضافي كاف لملء أنبوب المنبع.
    2. قم بتوصيل أنبوب المنبع بالحقنة باستخدام موصل Luer من أنثى إلى بارب. على الطرف الآخر من الأنبوب، أدخل موصل Luer من الذكور إلى الشرائح.
    3. قم بتوزيع الوسط من المحقنة حتى يمتلئ أنبوب المنبع بالكامل بالمتوسط.
    4. قم بتغطية الطرف المفتوح من الأنبوب بغطاء Luer أنثى.
      ملاحظة: يجب أن يكون لجميع المحاقن المكررة نفس وحدة التخزين بالضبط في هذه المرحلة. إذا لم تكن أحجامها متساوية ، فستكون الغطاسات الخاصة بها في مواضع مختلفة ، ولن تتناسب جميعها بشكل جيد مع مضخة حقنة واحدة متعددة القنوات.
  3. في ظل الظروف المعقمة، أدخل موصل Luer من الذكور إلى القضبان في أحد طرفي الأنابيب السفلية، وقم بتغطيته بغطاء Luer أنثوي.
  4. أحضر بعناية جميع الأنابيب والمحاقن ولوحة البئر المعدة إلى الحاضنة التي سيتم استخدامها للتروية.
  5. ضع مضخة المحقنة وجامع الكسر في المواقع المطلوبة بالقرب من الحاضنة. ضع مضخة المحقنة فوق الحاضنة أو بالقرب منها ، وضع جامع الكسر بجوار الحاضنة ، بالقرب من الميناء.
  6. قم بتجميع الأطراف المغطاة لجميع أنابيب المنبع والمصب معا وادفعها من خارج الحاضنة إلى الداخل من خلال المنفذ.
  7. قم بتحميل المحاقن في مضخة المحاقن وأدخل الأطراف المفتوحة للأنابيب النهائية في أطراف ماصة التوزيع الخاصة بموزع الرؤوس المتعددة لمجمع الكسور.
  8. داخل الحاضنة ، اسحب أكبر قدر ممكن من الركود في أنابيب المنبع إلى الحاضنة لزيادة طول الأنابيب التي يمكن من خلالها للوسط المتدفق تلقي الحرارة و CO2 من هواء الحاضنة. أثناء تثبيتها في مكانها ، اسحب أنابيب المصب من الحاضنة ، بما يكفي فقط حتى تتمكن من الوصول إلى أبعد نقطة ممتدة على جامع الكسور مع الحفاظ على النهايات المغطاة داخل الحاضنة.
  9. لكل بئر موصول ، قم بفك الغطاء بسرعة الإبر وأنابيب المنبع والمصب لهذا البئر وقم بتوصيلها مع موصلات Luer الخاصة بها.
  10. بمجرد توصيل جميع الأجزاء ، قم بتشغيل مضخة المحقنة لفترة وجيزة بسرعة عالية نسبيا لضمان تدفق جميع التيارات بشكل صحيح.
  11. في هذه المرحلة ، إذا كان من المرغوب فيه بدء التجربة باستخدام أنابيب المصب المليئة بالوسط ، فاستمر في تشغيل المضخة حتى يتم ملء كل شيء. خلاف ذلك ، أوقف المضخة.
  12. اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة وتواتر جمع الكسور وابدأ تشغيل كلا الجهازين في وقت واحد لبدء التجربة. جمع الكسور لمدة التجربة المطلوبة.

5. قم بإعداد نظام التروية باستخدام stopcock لمصادر متوسطة متعددة

  1. قم بتنفيذ كافة الخطوات الفرعية للخطوة 4.1 أعلاه.
  2. قم بإعداد الوسائطين لاستخدامهما في التروية ، مع وضع علامة على الوسيط الذي سيتم توزيعه أولا على أنه 1 ، والآخر على أنه متوسط 2.
  3. لكي يتم تشغيل كل ثقافة ، املأ حقنة واحدة بما يكفي من الوسط 1 طوال مدة صرفها ، بالإضافة إلى حجم كاف لملء نظام التروية في البداية. املأ حقنة ثانية بما يكفي من المتوسط 2 طوال مدة صرفها.
  4. قم بتوصيل كلا الحقنتين باثنين من المنافذ الثلاثة لجهاز إيقاف رباعي الاتجاهات.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى طول الأنابيب لتوصيل المحاقن بأجهزة التوقف.
  5. قم بإعداد السدادة والمحاقن بطريقة مماثلة للخطوات 3.1.7-3.1.8 أعلاه عن طريق إغلاق الموقوف إلى المتوسط 1 وتوزيع الوسط 2 في الموقوف حتى يبدأ للتو في التنقيط من المنفذ المفتوح.
  6. أغلق السدادة إلى المتوسط 2 وقم بتوزيع الوسط 1 في الموقف حتى يتم طرد كل الوسط المتبقي 2 من المنفذ المفتوح.
  7. قم بتوصيل أنبوب المنبع بمنفذ التوقف المفتوح باستخدام موصل Luer من أنثى إلى بارب. على الطرف الآخر من الأنبوب، أدخل موصل Luer من الذكور إلى الشرائح.
  8. وزع الوسط 1 من المحقنة حتى يمتلئ أنبوب المنبع بالكامل بالمتوسط.
  9. تابع الخطوات 4.3-4.11 أعلاه ، وقم بتحميل كلا الحقنتين في مضخات حقنة منفصلة وقم بتوزيع الوسط 1 فقط.
  10. اضبط معدل تدفق مضخة المحقنة على المتوسط 1 وتواتر جمع الكسور ، وابدأ تشغيل كلا الجهازين في وقت واحد لبدء التجربة.
  11. عندما يتم تغيير المصدر المتوسط ، أوقف مضخة المحقنة بسرعة للمتوسط 1 ، وأدر الموقوف مغلقا إلى المتوسط 1 ، وابدأ تشغيل مضخة المحقنة للمتوسط 2. إذا رغبت في ذلك لاحقا، قم بتبديل المصدر مرة أخرى إلى الوسط 1 بطريقة مماثلة.
  12. جمع الكسور لمدة التجربة المطلوبة.

6. قم بإعداد نظام التروية بخزان مقلب لتقليد الحرائك الدوائية

  1. الحصول على بيانات الحرائك الدوائية للدواء محل الاهتمام والتأكد من أنه يتكون من ذروة تركيز تليها اضمحلال أسي.
  2. بعد تعيين الذروة إلى الوقت 0 وإزالة نقاط البيانات قبل الذروة، استخدم البرنامج النصي Stirred_Tank_Fit.m (الملف التكميلي 6) لملاءمة معادلة RTD للخزان المتحرك مع البيانات. الإدخال v (معدل تدفق التروية المطلوب) والبيانات التي سيتم ملاءمتها كزوج من المتجهات مباشرة في البرنامج النصي ، إلى جانب t و C لقيم الوقت وقيم التركيز ، على التوالي. قم بتشغيل البرنامج النصي لطباعة المعلمة V ، وهي وحدة تخزين الخزان المتحركة المطلوبة.
  3. خطط لتخطيط لنظام التروية ليشمل مضختين للحقنة وشاكر صفيحة في المنبع من الحاضنة.
  4. قم بقياس RTDs لمكونات نظام التروية خارج الإيقاف وإجراء التفاف إشارة RTDs مع فترات وتركيزات مختلفة لنبض الدواء للعثور على ملف تعريف حركي دوائي مناسب. استخدم معادلة RTD للخزان المتحرك في هذا الحساب.
  5. تابع الخطوات من 5.1 إلى 5.8 أعلاه.
  6. استخدم لوحة بئر إضافية ذات حجم مناسب كخزان متحرك للإعداد. قد يكون كل بئر بمثابة خزان مقلب لثقافة واحدة منصهرة. املأ البئر بالحجم المطلوب من المتوسط ، V ، وقم بتوصيل البئر بالإبر التي تم سحبها في البداية ، ثم دفعها إلى أسفل البئر ، وقم بتغطية الإبر.
  7. قم بتحميل المحاقن في مضخات المحاقن وقم بتوصيل الأنابيب بسرعة من المحاقن بإبر المدخل المغطاة للخزانات المقلوبة. ثم قم بتوصيل مداخل أنبوب المنبع لزراعة الخلايا بإبر المخرج للخزانات المقلوبة.
  8. تابع الخطوات من 5.9 إلى 5.10.
  9. في الوقت المطلوب ، قم بالتبديل إلى توزيع الوسط 2 الذي يحتوي على الدواء ، كما هو موضح في الخطوة 5.11. عد إلى الوسط 1 عند اكتمال ضخ الدواء.
  10. تابع الخطوة 5.12.

figure-protocol-1
الشكل 3: موزع متعدد الرؤوس. تصميم لموزع متعدد الرؤوس المقطوع بالليزر. وقد عدل هذا الرقم من Erickson et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام نظام التروية مع مصادر متوسطة متعددة من القسم 5 من البروتوكول لقياس ديناميكيات التعبير لجين مراسل مدفوع بالعامل النووي كابا - محسن سلسلة الضوء - لعامل النسخ للخلايا البائية المنشطة (NF-κB) في خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) استجابة لنبضة 1.5 ساعة من عامل نخر الورم ألفا (TNF-α). تم نقل خلايا HEK293 بشكل مستقر باستخدام ناقلات فيروسية مع بنية جينية تحتوي على Gaussia luciferase (GLuc) ، مدفوعة من قبل مروج يسمى NFKB يحتوي على عنصر استجابة NF-κB لإنشاء خلايا NFKB-GLuc HEK293 ، والتي تم فرزها عبر فر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل تجميع وتشغيل نظام زراعة خلايا التروية مع مصادر متوسطة متعددة تم إثباتها مع مثال محدد تم فيه قياس ديناميكيات التعبير الجيني المدفوع ب NF-κB استجابة لنبضة عابرة من TNF-α. تم قياس ونمذجة RTDs لمكونات نظام التروية ، وتم استخدام التفاف الإشارة للتنبؤ بكل من تعرض الخلايا لنبضة TNF-α وتوزيع TNF-α في الكسور المتوسطة للنفايات السائلة التي تم جمعها. تعرضت الخلايا للنبض وتم جمع الكسور لمدة 40 ساعة ، وبعد ذلك تم قياس GLuc في الكسور ورسمها جنبا إلى جنب مع إشارة TNF-α المتوقعة للكشف عن ديناميكيات الاستجابة للتحفيز.

<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء هذا البحث بدعم بموجب رقم المنحة. R01EB012521 و R01EB028782 و T32 GM008339 من المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
18 مقياس 1 1/2- في إبرة مسبار يمكن التخلص منها للاستخدام مع المحاقن وآلات الاستغناء عن خلاياGrainger5FVK2
293T خلاياATCCCRL-3216HEK 293T المستخدمة في تجربة النتائج التمثيلية.
96-Well Clear Bottom Plates ، لوحات CorningVWR89091-010لقياس تركيزات الصبغة في تجارب RTD و GLuc في تجربة النتائج التمثيلية.
BD  محاقن يمكن التخلص منها مع أطراف Luer-Lok ، 5 ملFisher Scientific14-829-45
BioFrac Fraction Collector   ؛Bio-Rad7410002مجمع الكسور الذي يمكن استخدامه لدفق واحد ، أو تعديله باستخدام طريقتنا لتمكين التجميع من تدفقات متعددة.
أكريليك شفاف عالي القوة مقاوم للأشعة فوق البنفسجية 12 × 12 × 1/8 بوصةMcMaster-Carr4615T93يتم قطع هذه الورقة باستخدام قاطع ليزر وفقا لملف DXF في المواد التكميلية لإنتاج موزع متعدد الرؤوس يمكن توصيله بمجمع الكسر BioFrac.
Coelenterazine الأصليتقنية NanoLightTechnology 303الركيزة المستخدمة في مقايسة التلألؤ البيولوجي Gaussia luciferase في النتائج التمثيلية.
الآبار المتعددة المعالجة ب Corning Costar TC ، مقاس 48   ؛ الآبار ، صفيحة البوليسترين ، آبار القاع المسطحةMillipore SigmaCLS3548تستخدم لنمو خلايا 293T ونشرها في نتائج تمثيلية.
كورنينج  لوحات ثقافة الخلايا ذات القاع المسطح من كوستار ، حجم 12 بئر فيشر720081العلمي يمكن توصيلها واستخدامها كخزان مقلوب لإنتاج ملامح الحرائك الدوائية في التروية. يمكن أن تحتوي أيضا على خلايا للتروية.
DMEM ، ارتفاع الجلوكوزThermoFisherScientific 11965126
Epilog Zing 24 LaserCutting Edge SystemsEpilog Zing 24قاطع ليزر يستخدم لإنتاج موزع متعدد الرؤوس من لوح الأكريليك. يمكن استخدام قواطع الليزر الأخرى.
محاقن فيشربراند معقمة للاستخدام الفردي ، قفل لور ، 20 ملمحاقن فيشر سيانتيفيك14-955-460
محاقن فيشربراند معقمة للاستخدام الفردي ، قفل لور ، 60 ملفيشر ساینتفيك14-955-461
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفاخرة من فيشربراند: 1.5 ملفيشر سيانتيفيك05-408-129أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لجمع الكسور.
Fisherbrand  أنابيب زجاجية من البورسليكات ذات القاع المستدير مععادية من Fisher Scientific14-961-26لجمع الكسور.
Fisherbrand  أطراف ماصة SureOne Micropoint ، الملاءمة العالمية ،أطراف ماصة Fisher Scientific2707410300 أولتر تناسب أفضل موزع وأنابيب متعددة الرؤوس لتكون بمثابة أطراف للتوزيع.
Gibco  DPBS ، مسحوق ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومفيشر ساينتفيك21600010محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
Labline 4625 Titer ShakerMarshall ScientificLabline 4625 Titer Shakerشاكر يستخدم للحفاظ على الخزانات المخطوبة مختلطة.
تركيب Masterflex ، بولي كربونات ، محبس رباعي الاتجاهات ، قفل لور ذكر ، غير معقم ؛ 10 / PKCole-ParmerEW-30600-04تستخدم للانضمام إلى تيارات مدخل متعددة لتجارب RTD وتجارب زراعة الخلايا.
تركيب Masterflex ، بولي كربونات ، مستقيم ، أنثى لور × غطاء ؛ 25 / PKMasterflexUX-45501-28
Masterflex Fitting ، بولي بروبيلين ، مستقيم ، أنثى Luer إلى Hosebarb محولات ، 1/16 "Cole-ParmerEW-45508-00
Masterflex Fitting ، بولي بروبيلين ، مستقيم ، ذكر قفل لور إلى محول Hosebarb ، 1/16 "معرفCole-ParmerEW-45518-00
تركيب Masterflex ، مادة البولي بروبيلين ، مستقيم ، قفل لور ذكر لمحول التوصيل ؛ 25 / PKMasterflexEW-30800-30
Masterflex L / S أنابيب مضخة دقيقة ، سيليكون معالج بالبلاتين ، L / S 14 ؛ 25 قدماMasterflexEW-96410-14
MATLABMathWorksR2019bالإصدار R2019b. يمكن أيضا استخدام إصدارات أحدث. قد تعمل بعض الإصدارات القديمة.
NE-1600 مضخة حقنة قابلة للبرمجة سداسية القنوات أنظمةمضخات العصر الجديدNE-1600
مجموعة الرف F1Bio-Rad7410010رفوف لعقد أنابيب التجميع في مجمع الكسر.
بروتين عامل نخر الورم البشري المؤتلف ألفا (معبرة عن HEK293) ، CFBio-Techne10291-TA-020Cytokine يستخدم لتحفيز خلايا 293T في نتائج تمثيلية.
سدادات صلبة من Saint Gobain ، سيليكون فرسيليك ، الحجم: 00 ، أسفل 10.5 ممSaint GobainDX263015-50تناسب ألواح 48 بئر.
سدادات صلبة من Saint Gobain ، سيليكون فرسيليك ، الحجم: 4 سفلي 21 ممسانت جوبينDX263027-10يناسب 12 بئر لوحا.
هيدروكسيد الصوديوم ، محلول مائي 10.0 نيوتن APHA ؛ 1 لتركيماويات الطيفS-395-1LT
SolidWorksDassault Systemsبرنامج SolidWorksCAD المستخدم لإنشاء ملف DXF متعدد الرؤوس.
قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع Varioskan LUXقارئVL0000D0ThermoFisher.
عبوة قاعدة نظام الألوان ذات الأداء الصحيح من Wilton ، صبغة طعام BlueMichaels10404779Blue تحتوي على Brilliant Blue FCF ، تستخدم كأداة تتبع في تجارب RTD. يصل طيف الامتصاص إلى ذروته عند 628 نانومتر.
ألواح أنابيب زجاجية غير المفلترة لوحة العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  2. Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).
  3. Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).
  4. Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
  5. Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
  6. Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
  7. Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).
  8. Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
  9. Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
  10. Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
  11. Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).
  12. Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
  13. Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
  14. Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
  15. Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615(2019).
  16. Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
  17. Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
  18. Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
  19. Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
  20. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
  21. Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة