مقالة منهجية

تطوير نماذج ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر للتصوير والتحكم البصري الوراثي لوظيفة القلب

DOI:

10.3791/63939

⸱

أغسطس 25, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Computer Science and Engineering, Washington University in St. Louis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول جيل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر التي تعبر عن eNpHR2.0 أو ReaChR opsins في القلب لتصوير OCT وسرعة القلب البصرية الوراثية. تم الإبلاغ عن تعليمات مفصلة لتصوير ذبابة الفاكهة OCT وتعديل ضربات القلب ، بما في ذلك محاكاة السكتة القلبية القابلة للاستعادة ، وبطء القلب ، وعدم انتظام دقات القلب في الحيوانات الحية في مراحل النمو المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ضمن استخدام ذبابة الفاكهة الميلانوغاست r (ذبابة الفاكهة) ككائن حي نموذجي تقدما كبيرا في العديد من مجالات العلوم البيولوجية ، من التنظيم الخلوي والتحقيقات الجينومية إلى الدراسات السلوكية. بسبب المعرفة العلمية المتراكمة ، في السنوات الأخيرة ، تم جلب ذبابة الفاكهة إلى مجال نمذجة الأمراض البشرية ، بما في ذلك اضطرابات القلب. يصف العمل المقدم النظام التجريبي لمراقبة وظيفة القلب والتلاعب بها في سياق كائن حي كامل باستخدام الضوء الأحمر (617 نانومتر) وبدون إجراءات غازية. تم تحقيق السيطرة على القلب باستخدام أدوات البصريات الوراثية. يجمع علم البصريات الوراثي بين التعبير عن الأوبسينات المعدلة وراثيا الحساسة للضوء وتنشيطها البصري لتنظيم الأنسجة البيولوجية ذات الاهتمام. في هذا العمل ، تم استخدام نظام التصوير المقطعي المتكامل للتماسك البصري (OCT) المخصص ونظام التحفيز البصري الوراثي لتصور وتعديل قلب D. melanogaster الوظيفي في 3rd instar larval ومراحل نمو العذراء المبكرة. تم استخدام النظام الوراثي المزدوج UAS/GAL4 للتعبير عن الهالورودوبسين (eNpHR2.0) وقناة رودوبسين ذات الانزياح الأحمر (ReaChR)، وتحديدا في قلب الذبابة. يتم توفير تفاصيل حول إعداد D. melanogaster للتصوير المباشر OCT والسرعة البصرية الوراثية. قام برنامج تكامل تم تطويره في المختبر بمعالجة بيانات التصوير لإنشاء عروض مرئية وخصائص كمية لوظيفة القلب ذبابة الفاكهة . تظهر النتائج جدوى بدء السكتة القلبية وبطء القلب الناجم عن تنشيط eNpHR2.0 وأداء سرعة القلب عند تنشيط ReaChR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في نهاية عام 2010 ، اختارت مجلة Nature Methods علم البصريات الوراثي كطريقة للعام1. إن استخدام الأدوات الجينية (العمليات المعدلة وراثيا) التي ينظمها الضوء للتحكم في الأنسجة البيولوجية ذات الأهمية بدقة وسرعة غير مسبوقة فتح بوابة فيضان للتطبيقات الجديدة. حتى الآن ، تنتمي غالبية الإنجازات إلى علم الأعصاب. تم تقديم التكنولوجيا كطريقة جديدة للتحكم الدقيق في الخلايا العصبية المفردة2 وتقدمت إلى اكتشافات في مجال الوظائف المعرفية للكائنات الحية3. منذ البداية ، أظهر علماء الأعصاب القدرة على تعديل سلوك الكائن الحي بأكمله. تسبب التعبير والتنشيط الضوئي ل ChR2 opsin في الخلايا العصبية الدوبامينية للفئران في تنشيطها وكانت كافية لدفع التكييف السلوكي4. أدى التثبيط البصري الوراثي لمجموعة فرعية من الخلايا العصبية التي تحتوي على هالورهودوبسين NpHR2.0 الذي تم تسليمه إلى التركيز الصرعي لدماغ القوارض إلى تخفيف النوبات الكهربية الدماغية5.

تتطور التطبيقات البصرية الجينية في أمراض القلب بوتيرة ثابتة6. تم التعبير عن ChR2 بنجاح في زراعة خلايا الخلايا العضلية القلبية وفي الفئران. تم إجراء وتيرة القلب عن طريق ومضات من الضوء الأزرق (أجريت باستخدام ألياف مزروعة في الحيوانات الحية)7. في أسماك الزرد ، تم التعبير عن ChR2 واستخدامه لتحديد منطقة القلب التي تصنع السرعة. تنشيط NpHR الناجم عن السكتة القلبية8. تتمتع سرعة القلب البصرية الجينية بإمكانات فريدة لتطوير علاجات جديدة للسرعة وإعادة المزامنة9. تم الإبلاغ مؤخرا عن محاولات لإنشاء نظام إنهاء عدم انتظام ضربات القلب الذاتي وكذلك10.

تتطلب الأبحاث المكثفة وتطوير علاجات علاجية جديدة تطبيق أنظمة نموذجية مختلفة ، من زراعة الخلايا إلى الثدييات. قلب الفقاريات هو عضو معقد للغاية. تشكل الخلايا العضلية القلبية (CM) ثلث جميع خلايا القلب. وتشمل الخلايا الأخرى الخلايا العصبية، وخلايا العضلات الملساء الوعائية، والخلايا غير القابلة للإثارة (أي الخلايا البطانية، والخلايا الليفية، والخلايا المناعية). البحث في زراعة خلايا CM يحد من ترجمة النتائج التي تم الحصول عليها إلى التطبيقات الطبية البشرية. إن التلاعب الجيني لكائنات النماذج الثديية محدود ويستغرق وقتا طويلا. نماذج اللافقاريات الأصغر لها العديد من المزايا. نظام القلب والأوعية الدموية يحمل جميع العناصر النسيجية الأساسية. ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة) هو نظام نموذج وراثي بسيط وقوي للتحقيق في دور الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية ، بما في ذلك أمراض القلب11،12،13. كحيوانات قصيرة العمر ، يمثل ذباب الفاكهة فرصة ممتازة لنمذجة تغيرات وظائف القلب التي تعتمد على العمر أو المرض والتي يمكن تتبعها طوال الحياة14،15،16،17. يقع أنبوب قلب ذبابة الفاكهة على الجانب الظهري من جسمها على بعد 200 ميكرومتر من سطح البشرة ، مما يسمح للضوء المرئي للأشعة تحت الحمراء القريبة بالوصول إلى أنبوب القلب. تتيح هذه الميزة التشريحية الوتيرة البصرية غير الغازية لقلب ذبابة الفاكهة باستخدام الأدوات البصرية الوراثية الموجودة.

لمراقبة قلب ذبابة الفاكهة ، تم تطوير نظام تصوير مقطعي بصري مخصص للتماسك البصري (SD-OCT) مع وحدة إثارة LED مدمجة للضوء الأحمر18. يمكن تحليل التغيرات المورفولوجية والإيقاعية في قلب ذبابة الفاكهة البسيط نسبيا بسهولة باستخدام تقنية التصوير الطبي الحيوي غير الغازية هذه12،19،20،21. مع تحسين أداء التقسيم البصري والدقة المكانية على نطاق ميكرون ، تم استخدام OCT بنجاح للتحقيق في بنية ومراقبة وظيفة قلب ذبابة الفاكهة في مراحل النمو المختلفة ، بما في ذلك اليرقة 3rd instar والخادرة المبكرة18. يتيح هذا النظام أيضا المراقبة والتحفيز المتزامنين لحالة ذبابة الفاكهة القلبية في الحيوان السليم. يظهر الشكل 1 عرضا تخطيطيا لنظام OCT. يستخدم نظام SD-OCT الصمام الثنائي فائق الإضاءة (SLD) كمصدر للضوء (الطول الموجي للمركز: 850 نانومتر ± 10 نانومتر، FWHM: 165 نانومتر، انظر جدول المواد). باستخدام عدسة موضوعية 10x ، يمكن لنظام التصوير OCT تحقيق دقة محورية تبلغ ~ 4.4 ميكرومتر في الهواء و ~ 3.3 ميكرومتر في الأنسجة ودقة جانبية تبلغ ~ 2.8 ميكرومتر ، وهي كافية لحل التفاصيل الدقيقة لهياكل قلب الذبابة18,22. يتم الكشف عن إشارات التداخل للضوء المنعكس من الذراع المرجعي وذراع العينة باستخدام مقياس الطيف المزود بكاميرا مسح خطي بدقة 2048 بكسل (الحد الأقصى لمعدل الخط: 80 كيلو هرتز، انظر جدول المواد). حساسية النظام المقاسة هي ~ 95.1 ديسيبل. يقوم كل مسح ضوئي OCT في الوضع B بإنشاء صورة مقطعية عرضية في مستوى الصورة xz. يتم الحصول على صور B-mode المتكررة في نفس الموقع لإنشاء صور في الوضع M تلتقط القلب النابض لأكثر من 30 ثانيةتقريبا 18،22،23. يبلغ معدل الإطارات للتصوير في وضع M حوالي 125 إطارا / ثانية ، وهو ما يكفي لالتقاط ديناميكيات نبض قلب ذبابة الفاكهة.

من أجل التنظيم البصري الوراثي لوظيفة قلب ذبابة الفاكهة ، يتم دمج وحدة إضاءة مع مصدر ضوء LED 617 نانومتر مع ذراع العينة لنظام SD-CT. يركز ضوء التحفيز على بقعة قطرها ~ 2.2 مم على سطح العينة ، في نفس موضع بقعة تركيز التصوير. يتم استخدام برنامج مكتوب خصيصا للتحكم في وضع الإضاءة (شدة الضوء وعرض النبضة ودورة العمل) ، وضبط تردد تحفيز نبضة الضوء ، ومزامنة إضاءة وحدة LED واكتساب التصوير OCT في وضع M22.

وصفت المنشورات الحديثة نظام ذبابة الفاكهة المعدل وراثيا الذي يتكون من عمليات ChR2 و ReaChR و eNpHR2.0 المنظمة زمنيا والمكانية باستخدام النظام الوراثي UAS / GAL4. أظهرت النتائج التي تم الحصول عليها القدرة على بدء السكتة القلبية وبطء القلب الناجم عن تنشيط الضوء الأحمر ل eNpHR2.0 وسرعة القلب ذات التردد العالي الناجم عن تنشيط الضوء الأزرق ل ChR2. تم إجراء تجارب وتيرة مماثلة مع قناة أخرى ، ReaChR ، يمكن تحريضها بواسطة إضاءة الضوء الأحمر22،23،24. كان تعبير opsin في جميع التجارب الموصوفة مدفوعا ب 24B-GAL4 ، حيث لوحظ تعبير opsin في مجموعة واسعة من الأنسجة ، بما في ذلك الخلايا العضلية القلبية وخلايا العضلات المحيطة. في الدراسة الحالية ، تم استبدال 24B-GAL4 ببرنامج تشغيل Hand-GAL4 لتحقيق تعبير eNpHR2.0 و ReaChR opsins الخاص بالقلب.

بشكل عام ، تظهر النتائج التجريبية المقدمة سكتة قلبية قابلة للإصلاح وبطء القلب المستحث وأمراض القلب وعدم انتظام دقات القلب. يتم توفير بروتوكول مفصل مع تعليمات خطوة بخطوة حول إنشاء نماذج ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا وإجراء التصوير OCT المتزامن وتجارب السرعة البصرية الجينية في الحيوانات الحية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة لهذه الدراسة ، eNpHR2.0 خط معدل وراثيا w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR خط معدل وراثيا w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO، وبرنامج تشغيل GAL4 الخاص بالقلب الذي يحتوي على جزء تنظيمي من جين اليد w[1118]؛ تم استخدام P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (سيتم الإشارة إلى مخزون برنامج التشغيل هذا على أنه Hand-GAL4). y[*] w[*]؛ P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 تم استخدامه كخط مراسل GFP. تم الحصول على مخزونات ذبابة الفاكهة المذكورة من مركز بلومنغتون لمخزون ذبابة الفاكهة (BDSC ، انظر جدول المواد) وتم الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة أو عند 18 درجة مئوية على وسائط دقيق الذرة القياسية. تتوفر نماذج ذبابة الفاكهة التي تم تطويرها في هذه الدراسة عند الطلب للعمل التعاوني.

1. ذبابة الفاكهة الصلبان الوراثية وإعداد الوسائط

  1. تغيير موازن الكروموسوم الثالث TM3 Sb[1] إلى TM6 Sb Tb ، مما يخلق w[1118] ؛ P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). انظر الشكل التكميلي 1 للاطلاع على مخطط العبور. ضع الصلبان في قوارير مع وسائط دقيق الذرة العادية.
    ملاحظة: يسمح وجود علامة السل للمستخدمين بالتمييز بين اليرقات والشرانق التي تحتوي على الجين العابر للأوبسين وبرنامج تشغيل GAL4 من الحيوانات التي تحتوي على أوبسين ولكن بدون سائق25.
  2. احتفظ بالصلبان الجينية في حاضنة رطوبة تبلغ 25 درجة مئوية و 70٪ على وسائط تحتوي على شبكية العين المتحولة بالكامل (ATR) المصممة خصيصا (انظر جدول المواد) في الظلام لمدة 5 أيام لجمع اليرقات و 6 أيام لجمع الشرانق.
  3. الجمع بين خمس إناث عذراء من نوع Hand-GAL4/TM6 Sb Tb واثنين إلى ثلاثة ذكور من مخزونات UAS-opsin (eNpHR2.0 أو ReaChR) لكل قارورة. انظر الرسم البياني المتقاطع ل eNpHR2.0 و ReaChR opsin في الشكل 2A والشكل 2B ، على التوالي.
  4. في اليوم التالي ، قم بإعداد قوارير الوسائط التي تحتوي على ATR.
    1. تحضير الطعام شبه المحدد وفقا لتعليمات BDSC26. بدلا من السكروز والجلوكوز ، أضف السكروز فقط (5.14 جم / 100 مل). تبرد إلى ~ 60 درجة مئوية مع التحريك المستمر.
    2. قم بإعداد قوارير ذبابة ضيقة ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول ATR-ethanol 100 mM إلى كل قارورة.
    3. باستخدام ماصة مصلية ، تخلص من طعام الذبابة لتضييق قوارير الذباب ، 5 مل لكل قارورة. دوامة في السرعة القصوى لمدة 10 ثوان.
    4. قم بتوصيل القوارير ، ولفها في القماش الداكن لحمايتها من الضوء. اترك القوارير تجف لمدة 12 ساعة على الأقل (طوال الليل).
  5. في اليوم التالي ، انقل الذباب الذي يضع البيض بثبات من الخطوة 1.3. إلى القوارير التي تحتوي على طعام يحتوي على ATR (الخطوة 1.4.4). حماية الرفوف مع قوارير من الضوء.
  6. بعد 24-48 ساعة (اعتمادا على عدد البيض الموضوع) ، تخلص من الوالدين لمنع زيادة عدد السكان في القارورة.
  7. جمع ذرية غير السل واستخدامها لتصوير القلب.
    ملاحظة: تظهر الاختلافات المظهرية في مرحلتي اليرقات والعذراء في الشكل 2C. ويبين الشكل 3 الملخص والجدول الزمني التقريبي لخطوات إعداد العينة.

2. التحكم البصري الوراثي في قلب ذبابة الفاكهة

  1. اختر UAS-opsin/Hand-GAL4 يرقة / خادرة من القارورة (الخطوة 1.7) ، وضعيها على الأنسجة ، وامسحي الوسائط برفق من سطح الجسم باستخدام فرشاة طلاء.
  2. قم بإعداد شريحة المجهر ووضع قطعة صغيرة من الشريط على الوجهين في المنتصف.
  3. باستخدام فرشاة أو ملاقط دقيقة ، ضع اليرقة / الخادرة بلطف على سطح الشريط مع الجانب الظهري لأعلى وعموديا على الجانب الطويل من الشريحة. ضع ضغطا لطيفا لتوصيل اليرقة / الخادرة بسطح الشريط.
  4. قم بإعداد الشريحة على مرحلة التصوير ، واليرقة / الخادرة متجهة لأسفل.
  5. قم بتشغيل مصدر ضوء OCT بواسطة برنامج التحكم بالليزر (انظر جدول المواد). افتح برنامج التحكم SD-OCT المكتوب حسب الطلب ، ثم انقر فوق نافذة المعاينة .
  6. قم بتعيين معلمات الفحص في برنامج SD-OCT.
    ملاحظة: الهدف هو محاذاة العينة للحصول على التصوير الأمثل للقلب النابض، لذا فإن اختيار نطاق X ونطاق Y يغطي منطقة القلب. في هذه الخطوة ، يكون كل من عدد عمليات الفحص A و B-scans 400. النطاق في الاتجاهين x و y هو ~ 490 ميكرومتر و ~ 537 ميكرومتر ، مما يدل على المقطعين العرضيين المتعامدين للقلب (xz و yz) ، على التوالي.
  7. استخدم المتلاعبين الدقيقين للتحكم في مرحلة العينة لجلب قلب الذبابة إلى بؤرة التركيز. اضبط الوضع البؤري لتقليل انعكاس الضوء من سطح بشرة الذبابة. فكر في تطبيق الزيت المعدني على سطح اليرقة / الخادرة لتقليل الانعكاس.
    ملاحظة: قد يزيد الزيت من خطر حركة الحيوانات عن طريق المساس بخصائص لاصق الشريط.
  8. تأكد من أن قلب الذبابة يمكن رؤيته بالكامل في نافذة الصورة دون أي تشوهات ، وحظره بواسطة الأنسجة ، والظلال والانعكاسات التي لا تكاد تذكر ؛ وإلا، ارجع إلى الخطوة 2.7.
  9. اضبط معلمات المسح الضوئي للحصول على صورة OCT في الوضع M.
    ملاحظة: يتم تقليل عدد عمليات الفحص A مقارنة بالخطوة 2.7. للحصول على معدل إطارات أسرع لالتقاط ديناميكيات نبض قلب الذبابة (عدة هرتز). يشير عدد عمليات المسح الضوئي B إلى عدد الإطارات المتكررة للتصوير في الوضع M ، والتي يمكن ضبطها بناء على وقت التسجيل وذاكرة النظام المتاحة. في هذه التجربة ، يمكن أن تسمح 128 عملية مسح ضوئي A بسرعة ~ 125 إطارا / ثانية ، ويتم تسجيل 4000 عملية مسح B متكررة ، مما يوفر تسجيلا مستمرا ل ~ 32 ثانية.
  10. احصل على خمس مجموعات من بيانات التحكم بدون نبضات تحفيز الضوء الأحمر لحساب معدل ضربات القلب أثناء الراحة (RHR).
  11. صمم نبضة الضوء لتحفيز السرعة في برنامج التحكم OCT المخصص. في "الإعدادات"، أضف تسلسلات نبضات الضوء المصممة للتحكم في تردد النبضة وعرض النبضة ومدة التحفيز ووقت الانتظار وفقا لبروتوكولات التحفيز المختلفة.
    ملاحظة: يتم قياس RHR من تجربة التحكم بدون إضاءة ضوئية ويستخدم لحساب التردد الذي يجب أن ينبض به الضوء لتجارب عدم انتظام دقات السرعة وسرعة البطء22.
  12. افتح برنامج التحكم في الضوء (انظر جدول المواد) لإنشاء نبضات الضوء الأحمر. اختر وضع النبض في "تحديد الوضع". انقر نقرا مزدوجا فوق الشكل الخاص بإعدادات "ملف تعريف النبض" واختر وضع المتابع. حافظ على شدة OFF على أنها 0 ، واضبط النسبة المئوية لكثافة ON عند حساب كثافة الطاقة الفعلية.
    ملاحظة: يتم تشغيل نبضات ضوء التحفيز بواسطة إشارة من برنامج التحكم OCT وفقا للإعدادات الواردة في الخطوة 2.12.
  13. احصل على مقاطع فيديو M-mode لقلب ذبابة الفاكهة النابض مع التحفيز الضوئي بالنقر فوق اكتساب في برنامج التحكم OCT. كرر القياسات 5x.

3. تحليل الصور

  1. افتح برنامج تجزئة قلب الذبابة المطور خصيصا.
  2. انقر فوق تحديد ملف ثم حدد الملف المراد تحليله في واجهة المستخدم الرسومية التي تظهر.
  3. أدخل كلا من الحدود الرأسية والأفقية لمنطقة القلب بالبكسل في مربعات النص العلوية. انقر على تغيير الحجم. باستخدام شريط التمرير الموجود في الأسفل ، تأكد من أن منطقة القلب بأكملها مرئية وأنها تملأ الصندوق بأكمله للمجموعة بأكملها. إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر هذه العملية واضبط الحدود.
  4. انقر فوق توقع للتنبؤ بمنطقة القلب. سيقوم البرنامج الآن بمراجعة كل شريحة في المجموعة وتحديد منطقة القلب ، ويستغرق حوالي 3 دقائق.
  5. انقر على HR Plot بمجرد اكتمال التنبؤ. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة تعرض قطعة أرض لمنطقة القلب بمرور الوقت. تأكد من اختيار مناطق الذروة أو الوادي الصحيحة. اختر Pulse ثم HR لإنشاء رقم نهائي ، وسيتم حفظ المعلمات الوظيفية في ملفات .csv في وقت واحد.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D. تم توليد الميلانوغاستر التي تعبر عن أوبسينات حساسة للضوء الأحمر eNpHR2.0 أو ReaChR في أنبوب القلب عن طريق الحصول على ذرية من الصليب بين كل خط معدل وراثيا UAS-opsin وبرنامج تشغيل Hand-GAL4. تم التحقق من خصوصية الأنسجة لبرنامج تشغيل GAL4 عن طريق تصوير تعبير GFP (الشكل 4). تم استخدام يرقة ذبابة الفاكهة 3rd instar ومراحل نمو الخادرة المبكرة لإظهار آثار eNpHR2.0 وتنشيط ReaChR بواسطة الضوء الأحمر. تم تصميم نبضات الضوء الأحمر ~ 617 نانومتر ، التي تقدمها LED ، وأضاءت اليرقة / الخادرة ونشطت eNpHR2.0 و ReaChR في القلب. على الرغم من أن الحد الأقصى للطول الموجي للاستجابة المبلغ عنه ل NpHR هو ~ 580 نانومتر و ReaChR هو ~ 600 نانومتر ، إلا أن إضاءة الضوء 617 نانومتر يمكن أن تخترق أعمق مع تعزيز توصيل الطاقة الضوئية نحو أنسجة القلب المعبرة عن الأوبسين22.

تم تركيب اليرقة / الخادرة على شريحة المجهر مع الجانب الظهري لأسفل في إعداد المجهر المقلوب ، وتم إضاءة اليرقة / الخادرة بواسطة شعاع ضوء LED موجه إلى جزء الجسم A7. وترد أمثلة على صور المقطع العرضي للجسم في الشكل 5A والشكل 6A. يظهر القلب كشكل دائري متقلص وموسع في تسجيلات الفيديو التي تتكون من 4000 إطار (مقاطع الفيديو التكميلية 1-6). لتقليد أمراض القلب المختلفة ، تم تصميم أربعة أنواع من نبضات الضوء. نبضة واحدة تدوم 10 ثوان بعد 5 ثوان من وقت الانتظار ولدت سكتة قلبية قابلة للاستعادة ناجمة عن eNpHR2.0 ، كما هو موضح في الشكل 5B. بالنسبة لسرعة القلب بترددات أبطأ من معدل ضربات القلب أثناء الراحة (RHR) ، بوساطة eNpHR2.0 ، تم استخدام تسلسلين للنبضات الضوئية بترددات سرعة تساوي RHR / 2 و RHR / 4 يدوم 8 ثوان مع وقت انتظار قدره 6 ثوان بينهما (الشكل 5C). كانت دورة العمل لكل تسلسل نبضة ضوئية 90٪. تسبب نظام التحفيز الخفيف هذا في حدوث حالة قلبية تذكرنا ببطء القلب. يتكون نمط التحفيز لزيادة معدل ضربات القلب بسبب تنشيط ReaChR من ثلاث تسلسلات من نبضات الضوء عند ترددات RHR + 0.5 Hz و RHR + 1 Hz و RHR + 1.5 Hz ، على التوالي ، بعرض نبضة يبلغ 20 مللي ثانية (الشكل 5D). كان نظام النبض هذا يهدف إلى التسبب في حالة عدم انتظام دقات القلب القلبية. كانت كثافة الطاقة الضوئية 7.49 mW / mm2 خلال جميع التجارب. بالنسبة لتجارب التحكم ، لم يتم تعيين إضاءة ضوئية.

تم تسجيل كل متغير تجريبي خمس مرات. تمت معالجة مقاطع الفيديو M-mode لقلب الذبابة إلى أقنعة ثنائية الأبعاد باستخدام FlyNet 2.027. يقوم هذا البرنامج تلقائيا بتقسيم منطقة القلب لإنتاج مجموعات بيانات وظائف القلب. يوفر البرنامج قناعا للقلب في كل إطار ، والذي يمكن تصحيحه يدويا ، إذا لزم الأمر ، لإنشاء تقدير كمي دقيق للمعلمات الوظيفية للقلب النابض ، مثل معدل ضربات القلب (HR) ، والبعد الانبساطي النهائي (EDD) ، والبعد الانقباضي النهائي (ESD) ، والتقصير الجزئي (FR) ، والمنطقة الانبساطية النهائية (EDA) ، والمنطقة الانقباضية النهائية (ESA) ، إلخ. يتم قياس معدل ضربات القلب عن طريق تحليل منطقة القلب مع مرور الوقت. يتم استخدام فيديو التحكم بدون نبضات ضوئية لتحديد معدل ضربات القلب الأساسي (على سبيل المثال ، RHR) لكل.

يوضح الشكل 5B والشكل 6B توقف القلب الطويل لمدة 10 ثوان الناجم عن تنشيط Hand>eNpHR2.0 باستخدام الضوء الأحمر (617 نانومتر) في اليرقة والخادرة ، على التوالي. عندما تم تشغيل الضوء الأحمر ، توقف قلب ذبابة الفاكهة عن النبض وبقي في هذه الحالة حتى نهاية إضاءة الضوء. تمت استعادة وظيفة القلب بعد إيقاف تشغيل الضوء الأحمر. الحيوانات التي لم يكن لديها opsin معبرا عنه ("لا يوجد أوبسين") لم تستجب لإضاءة الضوء الأحمر (الشكل التكميلي 2A والشكل التكميلي 3A). أظهرت تجارب التحكم مع Hand>eNpHR2.0 حيث لم يتم تشغيل إضاءة الضوء الأحمر 10 s (التحكم "بدون ضوء") أن القلب ينبض بشكل طبيعي (الشكل التكميلي 4A والشكل التكميلي 4C).

باستخدام Hand>eNpHR2.0 ، تم تطبيق نبضات الضوء الأحمر بترددات أقل من RHR. تم تقليل تردد تقلص القلب بعد الإشارات الضوئية. يحاكي معدل ضربات القلب البطيء هذا نوعا واحدا من عدم انتظام ضربات القلب ، بطء القلب (الشكل 5C والشكل 6C لليرقة والخادرة ، على التوالي). لم يلاحظ تباطؤ وتيرة القلب في تجارب التحكم "لا أوبسين" (الشكل التكميلي 2B والشكل التكميلي 3B) وفي "لا ضوء" (الشكل التكميلي 4A والشكل التكميلي 4C).

يمكن تحقيق زيادة معدلات ضربات القلب عن طريق تنشيط Hand>ReaChR opsin مع قطارات نبض الضوء الأحمر بتردد أعلى من RHR للحيوان المحدد. تم تطبيق سلسلة من ثلاثة قطارات نبضية ضوئية بترددات تحفيز مختلفة (على سبيل المثال ، RHR + 0.5 Hz ، RHR + 1 Hz ، RHR + 1.5 Hz) على يرقات Hand>ReaChR وقلوب الشرانق. تظهر البيانات التي تم الحصول عليها بوضوح زيادة معدل ضربات القلب بعد نبضات الضوء (الشكل 5D والشكل 6D لليرقة والخادرة ، على التوالي). حالة القلب التي أظهرتها هذه التجارب تحاكي عدم انتظام دقات القلب. وترد تجارب المكافحة السلبية في الشكل التكميلي 2 جيم والشكل التكميلي 3 جيم والشكل التكميلي 4 ب ودال.

بشكل عام ، تظهر النتائج جدوى التحكم البصري الوراثي غير الغازي والمحدد لإيقاع القلب في مراحل النمو المختلفة في النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا من D. melanogaster.

figure-results-1
الشكل 1: نظام التصوير OCT مدمج مع وحدة LED 617 نانومتر للتحكم البصري الوراثي في وظيفة القلب ذبابة الفاكهة.

figure-results-2
الشكل 2: توليد D. melanogaster الحيوانات التي تعبر عن opsin في القلب. (A) الرسم البياني الوراثي المتقاطع. تم عبور الإناث Hand-GAL4 / TM6 SbTb إلى الذكور الذين يحملون eNpHR2.0. تم جمع ذرية Hand-GAL4/eNpHR2.0 الناتجة (التي تتميز بالنجمة الحمراء) لتصوير OCT ، وتم التخلص من Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb بناء على مظهرها الظاهري. (ب) الرسم البياني الوراثي المتقاطع. تم عبور الإناث Hand-GAL4 / TM6 SbTb إلى الذكور الذين يحملون ReaChR. تم جمع ذرية Hand-GAL4 / ReaChR الناتجة (التي تتميز بالنجمة الحمراء) للتصوير OCT ، وتم التخلص من Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb بناء على مظهرها الظاهري. (ج) الاختلافات المظهرية بين Hand-GAL4/opsin (النجمة الحمراء) وذرية Hand-GAL4/TM6 Tb. الحيوانات التي تحمل طفرة جين السل على كروموسوم TM6 لها شكل جسم "أنبوبي" مقارنة باليرقة العادية غير السلية أو الخادرة. تظهر اللوحة اليسرى اليرقات. تظهر اللوحة اليمنى الشرانق المبكرة. تتضمن الصور أيضا مسطرة بعلامات 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: العرض التخطيطي والجدول الزمني لإجراءات إعداد التصوير. يتم الاحتفاظ بمخزون الوالدين في زجاجات ذبابة. يتم عبور الإناث والذكور البكر في قوارير ضيقة مليئة بالطعام العادي (يشار إليها باللون الأصفر). يتم نقل الذباب الذي يضع البيض بنشاط إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على ATR (كما هو موضح في قوارير بنية). يجب أن تبقى القوارير ذات النسل النامي في الظلام من هذه الخطوة. يتم جمع يرقات 3rd instar والخادرة المبكرة من جدران القارورة للتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: D. melanogaster الخادرة المبكرة التي تعبر عن UAS-GFP (BDSC 6658) مدفوعة ب Hand-GAL4 (BDSC 48396). يؤكد نمط التألق خصوصية القلب لسائق Hand-GAL4 . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: محاكاة السكتة القلبية وبطء القلب وعدم انتظام دقات القلب في يرقة D. melanogaster. (أ) صورة OCT لمقطع عرضي لجسم اليرقات. يظهر القلب كدائرة تحت سطح الجسم. (ب) عرض بياني للسكتة القلبية القابلة للترميم. تعرض اللوحة العلوية توقيت (المحور X) لإضاءة الضوء الأحمر (المحور Y، النسبة المئوية لمستوى طاقة مصدر الضوء). تشير اللوحة الوسطى إلى التغير في مساحة القلب (المحور Y، الميكرومتر المربع) بمرور الوقت (المحور X). تعرض اللوحة السفلية تغير معدل ضربات القلب (المحور Y، الهرتز) بمرور الوقت (المحور X). (ج) عرض بياني لبطء القلب القابل للاستعادة بوساطة eNpHR2.0. تظهر اللوحة العلوية نبضات من إضاءة الضوء الأحمر ، مما يؤدي إلى فترتين من بطء القلب: 50٪ من RHR و 25٪ من RHR. تظهر تغيرات منطقة القلب ومعدل ضربات القلب على اللوحتين الوسطى والسفلية على التوالي. (د) عرض بياني لسرعة القلب بواسطة ReaChR المنشط. تعرض اللوحة العلوية سلسلة من نبضات الضوء الأحمر بسرعة 20 مللي ثانية تحدث عند ترددات RHR + 0.5 Hz و RHR + 1 Hz و RHR + 1.5 Hz. تتبع تقلصات القلب ترددات نبضة الضوء، كما هو موضح في اللوحتين الوسطى والسفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: محاكاة السكتة القلبية وبطء القلب وعدم انتظام دقات القلب في D. melanogaster pupa . (A) صورة OCT للمقطع العرضي لجسم العذراء. يظهر القلب كدائرة تحت سطح الجسم. (ب) عرض بياني للسكتة القلبية القابلة للترميم. تعرض اللوحة العلوية توقيت (المحور X) لإضاءة الضوء الأحمر (المحور Y، النسبة المئوية لمستوى طاقة مصدر الضوء). تشير اللوحة الوسطى إلى التغير في مساحة القلب (المحور Y، الميكرومتر المربع) بمرور الوقت (المحور X). تعرض اللوحة السفلية تغير معدل ضربات القلب (المحور Y، الهرتز) بمرور الوقت (المحور X). (ج) عرض بياني لبطء القلب القابل للاستعادة بوساطة eNpHR2.0. تظهر اللوحة العلوية نبضات من إضاءة الضوء الأحمر ، مما يؤدي إلى فترتين من بطء القلب: 50٪ من RHR و 25٪ من RHR. تظهر اللوحات الوسطى والسفلية تغيرات في منطقة القلب ومعدل ضربات القلب ، على التوالي. (د) عرض بياني لسرعة القلب بواسطة ReaChR المنشط. تعرض اللوحة العلوية سلسلة من نبضات الضوء الأحمر بسرعة 20 مللي ثانية عند ترددات RHR + 0.5 Hz و RHR + 1 Hz و RHR + 1.5 Hz. تتبع تقلصات القلب ترددات نبضة الضوء ، كما هو موضح في الألواح الوسطى والسفلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الصلبان الجينية لاستبدال كروموسوم موازن TM3 Sb ب TM6 Sb Tb. تم عبور الإناث العذراء Hand-GAL4 w + / TM3 Sb مع nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w + / TM6 Sb Tb الذكور. تم اختيار ذرية Hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb ، بما في ذلك الإناث والذكور البكر (فحص العيون المصطبغة جنبا إلى جنب مع شكل الجسم الأنبوبي). تم عبور الذباب المختار ذاتيا لإنشاء مخزون مستقر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: في تجارب التحكم ، لا يتغير إيقاع قلب اليرقة من النوع البري (wt) عند إضاءة الضوء الأحمر. (أ) لم يلاحظ أي توقف قلبي أثناء إضاءة الضوء الأحمر في يرقة الوزن. تعرض اللوحة العلوية صور القلب في الوضع M. يشير الخط الأحمر إلى توقيت الإضاءة. تظهر اللوحتان الوسطى والسفلية منطقة القلب ومعدلات ضربات القلب خلال وقت التصوير 32 ثانية. (ب، ج) نبضات الضوء الأحمر لا تغير معدلات ضربات القلب في يرقة الوزن. تعرض اللوحات العلوية صور القلب في الوضع M. يشير الخط الأحمر إلى توقيت الإضاءة. تظهر اللوحتان الوسطى والسفلية منطقة القلب ومعدلات ضربات القلب خلال وقت التصوير 32 ثانية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: في تجارب التحكم، لا يتغير إيقاع قلب الخادرة من النوع البري (wt) عند إضاءة الضوء الأحمر. (أ) لم يلاحظ أي توقف قلبي أثناء إضاءة الضوء الأحمر في يرقة الوزن. تعرض اللوحة العلوية صور القلب في الوضع M. يشير الخط الأحمر إلى توقيت الإضاءة. تظهر اللوحتان الوسطى والسفلية منطقة القلب ومعدلات ضربات القلب خلال وقت التصوير 32 ثانية. (ب، ج) نبضات الضوء الأحمر لا تغير معدلات ضربات القلب في الجرثاء wt. تعرض اللوحات العلوية صور القلب في الوضع M. يشير الخط الأحمر إلى توقيت الإضاءة. تظهر اللوحتان الوسطى والسفلية منطقة القلب ومعدل ضربات القلب خلال وقت التصوير البالغ 32 ثانية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: لا تظهر يرقات D. melanogaster والشرانق التي تعبر عن Hand> eNpHR2.0 أو Hand>ReaChR تغيرات كبيرة في الموارد البشرية أثناء التصوير OCT دون إضاءة الضوء الأحمر. (أ) معدلات ضربات القلب من يرقة Hand>eNpHR2.0. (ب) معدلات ضربات القلب من يرقة اليد >ReaChR . (ج) معدل ضربات القلب من الخادرة Hand>eNpHR2.0. (د) معدل ضربات القلب من هاند > ReaChR الخادرة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 1: يسبب eNpHR2.0 المنشط السكتة القلبية في يرقة D. melanogaster. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 2: يسبب eNpHR2.0 المنشط السكتة القلبية في د. ميلانوغاستر الخادرة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 3: بطء القلب القابل للاستعادة بوساطة eNpHR2.0 في يرقة D. melanogaster. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 4: بطء القلب القابل للاستعادة بوساطة eNpHR2.0 في د. الخادرة الميلانوغاستر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 5: سرعة القلب عن طريق تنشيط ReaChR في يرقة D. melanogaster. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو تكميلي 6: سرعة القلب عن طريق تنشيط ReaChR في D. melanogaster pupa. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالمقارنة مع تقاريرنا السابقة حيث كان التعبير عن opsins مدفوعا ليس فقط في القلب ولكن أيضا في الأنسجة العضلية المحيطة ، فإن تقارير العمل الحالية تستخدم سائقا خاصا بالقلب ، Hand-GAL4. يؤكد هذا التكوين الجيني الجديد ل Hand> opsin المستخدم في تنظيم القلب البصري الوراثي النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا ويؤسس نموذجا أفضل لأبحاث ذبابة الفاكهة القلبية الوعائية.

يعد إعداد وسائل الإعلام ضروريا لنجاح التجارب. تتطلب بروتينات Opsin شبكة شبكية متحولة بالكامل (ATR) لتعمل28. الذباب لا ينتج ما يكفي من ATR ، لذلك يجب استكمال ATR إلى وسائط الطيران. في هذه الدراسة ، تم استبدال الطعام الفوري الذي تم الإبلاغ عنه سابقا بوسائط شبه محددة29. تم تقديم الوصفة الجديدة للوسائط التي تحتوي على ATR لضمان توزيع موحد ل ATR. ATR غير قابل للذوبان في الماء. عندما يضاف مخزون ATR القائم على الإيثانول 100 mM إلى الوسائط المائية ، يتم تشتيته عن طريق دوامة القوارير التي تحتوي على وسائط دافئة شبه محددة. أيضا ، تم تخفيض تركيز ATR المبلغ عنه سابقا من 10 mM ل eNpHR2.0 و 3 mM ل ReaChR22 إلى تركيز نهائي 1 mM لكليهما. هذا التركيز كاف لضمان وظيفة eNpHR2.0 و ReaChR المناسبة.

أحد المكونات الحيوية للنجاح التجريبي هو تحسين معالجة البيانات باستخدام FlyNet 2.027. واصل المختبر تطوير هذا البرنامج لتحسين كل من الكفاءة الحسابية ودقة خوارزمية تجزئة قلب الذبابة الآلية. تستخدم أقنعة المقطع العرضي التي ينتجها هذا البرنامج لاشتقاق البيانات الفسيولوجية ذبابة الفاكهة مثل التقصير الجزئي وسرعة جدار القلب. وقد مكن هذا النهج من تحليل البيانات بكفاءة مع الحد الأدنى من الإشراف البشري، مما يجعل من الأسرع والأكثر موثوقية توصيف وظائف القلب لمجموعات بيانات تصوير القلب الذبابة الكبيرة.

لا يزال احتشاء عضلة القلب هو السبب الرئيسي للوفاة، ويساهم نقص تروية عضلة القلب في ثلثي جميع حالات قصور القلب، الذي يظهر بسرعة بين الأسباب الرئيسية للوفيات والمراضة في الولايات المتحدة30. يتطلب تطوير علاجات وأجهزة طبية جديدة معرفة عميقة بآليات اضطرابات القلب على المستويين الفسيولوجي والكيميائي الحيوي. يمكن تحقيق هذه الأهداف بمساعدة الكائنات الحية النموذجية. D. melanogaster أثبتت نفسها باعتبارها واحدة من النماذج الأكثر موثوقية وكفاءة 31،32،33،34،35. وقد ولد هذا العمل نماذج محاكاة اضطرابات القلب ذبابة الفاكهة الناجمة عن نهج البصريات الوراثية غير الغازية. يوفر تطوير تقنيات سرعة القلب البصرية غير الغازية أساسا لتطوير بديل لأجهزة سرعة القلب الكهربائية التقليدية. يسمح استخدام OCT لمراقبة وظيفة القلب في الوقت الفعلي للدراسات بتوصيف فسيولوجيا القلب ذات الصلة بدقة في نماذج ذبابة الفاكهة للتحقيقات المتقدمة ، بما في ذلك فحص مرشح الدواء. يحتوي تصوير OCT على عمق اختراق يبلغ ~ 1 مم ، والذي يعمل بشكل جيد لدراسات القلب ذبابة الفاكهة ولكنه يحد من استخدامه لتوصيف وظيفة القلب في النماذج الحيوانية الأكبر. وعلاوة على ذلك، فإن ترجمة أبحاث ذبابة الفاكهة مباشرة إلى نماذج الثدييات يمثل تحديا. هناك حاجة إلى تطوير أدوات بصرية وراثية جديدة لتحسين حساسية الأوبسينات وترجمتها إلى أنظمة نموذجية مختلفة ، بما في ذلك أسماك الزرد والفئران والجرذان والمواد العضوية في القلب البشري ، لأبحاث القلب والأوعية الدموية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون أندريه كوماروف ويوشوان وانغ وجيانتاو تشو على مساعدتهم في تحليل البيانات ويشكرون أعضاء مختبر تشو على مناقشاتهم القيمة. تم دعم العمل في مختبر الدكتور تشو من قبل صندوق بدء التشغيل من جامعة واشنطن في سانت لويس ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01-EB025209 و R01-HL156265 ، وجائزة مؤسسة كلايكو للبحوث المبتكرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كيماويات كايمانالمتحولةبالكامل 18449
باكتو بيبتونجيبكو02-10-2025
وحدة التحكم في مصدر الضوء BioLED ،أنظمة MigtexBLS-SA04-USجزء من وحدة التحفيز البصري الوراثي
وحدة مصدر الضوء عريضSuperlumcBLMD-T-850-HPجزء من نظام التصوير SD-OCT
Cobra-S 800 مطياف OCT  Wasatch PhotonicsCS800-840 / 180-80-OC2K-U3جزء من نظام التصوير SD-OCT
المهام الدقيقةKimberly-Clark Professtional34155الأنسجة
ذبابة الفاكهة أجارجينيسي Scientific66-103
زجاجات ثقافة ذبابة الفاكهةGenesee Scientific32-131
FlyNet 2.0 SoftwareZ-Labتم تطوير برنامج مخصص لتجزئة قلب الذبابة وتحليل وظائف القلب في مختبر Zhou
موازاة LED عالية الطاقةMigtex SystemsBLS-LCS-0617-03-22جزء من وحدة التحفيز البصري الوراثي
الخميرة الجافة غير النشطةGenesee Scientific62-106
شرائح المجهرAmScopeBS-72P
المقابس الضيقة لثقافة ذبابة الفاكهةGenesee علمي59-200
قوارير ضيقة لثقافة ذبابة الفاكهةGenesee Scientific32-116SB
سكوتششريطية دائمة على الوجهين
لزجاجات ذبابة الفاكهةGenesee Scientific59-194
Propionic AcidSigmaP1386-1L
SD-OCT برنامج التحكمZ-Labتم تطوير برنامج مخصص للحصول على الصور والتحكم في السرعة في مختبر Zhou
SD-OCT للتصوير ونظام الإيقاع البصري الوراثيZ-LabImaging ونظام الإيقاع البصري الوراثي الذي تم تطويره في مختبر Zhou (~ 50 ألف دولار BOM)
السكروزCarolina89-2871
ث [*] ؛ P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2مركز ذبابة الفاكهة في بلومنجتون (BDSC)مخزون # 41752eNpHR2.0 خط معدل وراثيا
ث [*]; P {y [+ t7.7] w [+ mC] = UAS-ReaChR}su (Hw) attP5 / CyOBloomington Drosophila Stock Center (BDSC)stock # 53748ReaChR خط معدل وراثيا
ث [1118] ؛ P {y [+ t7.7] w [+ mC] = GMR88D05-GAL4} attP2 / TM3 Sb [1]مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (BDSC)الأسهم # 48396سائق GAL4 الخاص بالقلب يحتوي على جزء تنظيمي لجين اليد
y [*] w [*] ؛ P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP}AH3مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة (BDSC)الأسهم # 6658خط مراسل GFP
مستخلص الخميرةمختبر علمي bioKEMIX978-907-4243
الشبكية ذات 4 قنوات النطاق مساحات مصادر سدادات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nature Methods. Method of the Year 2010. Nature Methods. 8, 1(2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Tsai, H. -C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  5. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
  6. Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
  7. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  8. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  9. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
  10. Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
  11. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  12. Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  13. Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969(2010).
  14. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596(2009).
  15. Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
  16. Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695(2016).
  17. Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
  18. Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002(2016).
  19. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
  20. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
  21. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  22. Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
  23. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Science Advances. 1 (9), 1500639(2015).
  24. Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73(2019).
  25. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila melanogaster. , Elsevier. (1992).
  26. Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022).
  27. Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
  28. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  29. Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56(2019).
  31. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
  34. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  35. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15(2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Heart ModelsOCT ImagingHeart PacingRed Light StimulationChannelrhodopsin ActivationHalorhodopsin ExpressionUAS GAL4 SystemCardiac Arrhythmia Models

مقالات ذات صلة