مقالة منهجية

طريقة تطهير الأنسجة للتصوير العصبي من المقاييس المتوسطة إلى المجهرية

DOI:

10.3791/63941

⸱

مايو 10, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroanatomy, Juntendo University Graduate School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Juntendo University Graduate School of Medicine, 3Advanced Research Institute for Health Sciences, Juntendo University, 4Department of Neuroscience, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 5Japan Society for the Promotion of Science, 6Department of Oral Anatomy and Neurobiology, Graduate School of Dentistry, Osaka University, 7Department of Multi-Scale Brain Structure Imaging, Juntendo University Graduate School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول طريقة مفصلة للتصوير العصبي في شريحة الدماغ باستخدام طريقة مسح الأنسجة ، ScaleSF. ويشمل البروتوكول إعداد أنسجة المخ، وتوضيح الأنسجة، والتعامل مع الشرائح التي تم تطهيرها، والتصوير المجهري بالليزر البؤري للهياكل العصبية من المستويات المجهرية إلى المجهرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لتصور الهياكل العصبية من المستويات المسكوبية إلى المجهرية في أنسجة المخ. يتم تصور الهياكل العصبية التي تتراوح من الدوائر العصبية إلى الهياكل العصبية دون الخلوية في شرائح دماغ الفئران التي تم تطهيرها بصريا باستخدام ScaleSF. طريقة التطهير هذه هي نسخة معدلة من ScaleS وهي طريقة إزالة الأنسجة المحبة للماء لشرائح الأنسجة التي تحقق قدرة تطهير قوية بالإضافة إلى مستوى عال من الحفاظ على إشارات التألق والسلامة الهيكلية. تم تصميم غرفة تصوير ثلاثية الأبعاد (3D) مطبوعة قابلة للتخصيص للتركيب الموثوق به لأنسجة المخ التي تم تطهيرها. تم إصلاح أدمغة الفئران التي تم حقنها بناقل فيروس مرتبط بالغدي يحمل جين بروتين فلورسنت أخضر محسن بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد ومقطعة إلى شرائح بسماكة 1 مم باستخدام قطاعة أنسجة مهتزة. تم تطهير شرائح الدماغ باتباع بروتوكول المقاصة، والذي يتضمن حضانات متسلسلة في ثلاثة حلول، وهي محلول Sca l eS0، ومحلول ملحي عازل للفوسفات (–)، ومحلول ScaleS4، بإجمالي 10.5-14.5 ساعة. تم تركيب شرائح الدماغ التي تم تطهيرها على غرفة التصوير وتضمينها في هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ المذاب في محلول ScaleS4D25 (0). تم الحصول على صورة 3D للشرائح باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤرة مجهز بعدسة موضوعية متعددة الغمر لمسافة عمل طويلة. بدءا من التصوير العصبي المنظاري ، نجحنا في تصور الهياكل العصبية الدقيقة تحت الخلوية ، مثل العمود الفقري التغصني والبوتونات المحورية ، في شرائح الدماغ التي تم تطهيرها بصريا. هذا البروتوكول من شأنه أن يسهل فهم الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات دون الخلوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حسنت طرق إزالة الأنسجة التصوير المستقل عن العمق للعينات البيولوجية والسريرية باستخدام المجهر الضوئي، مما يسمح باستخراج المعلومات الهيكلية عن الأنسجة السليمة 1,2. يمكن لتقنيات المقاصة البصرية أيضا تسريع وتقليل تكلفة التحليل النسيجي. حاليا ، تتوفر ثلاثة طرق رئيسية للتطهير: الطرق المحبة للماء ، الكارهة للماء ، والهيدروجيل القائم على 1,2. النهج المحبة للماء تفوق في الحفاظ على إشارات التألق وسلامة الأنسجة وهي أقل سمية مقارنة بالنهجين الآخرين 3,4.

وتحتل طريقة المقاصة ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة جونتيندو (الموافقة رقم 2021245 ، 2021246) وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية الأساسية للسير السليم للتجارب على الحيوانات من قبل مجلس العلوم الياباني (2006). هنا ، تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J التي تم حقنها بناقل AAV الذي يحمل جين بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) والبارفالبومين (PV) / myristoylation-EGFP-منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني C-terminal الكروموسوم الاصطناعي البكتيري الاصطناعي (BAC) الفئران المعدلة وراثيا (الفئران PV-FGL)9 . تم الحفاظ على الفئران PV-FGL في خلفية C57BL/6J. لم يتم العثور على اختلافات قائمة على الجنس فيما يتعلق بهذه ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحقيق التطهير البصري لشريحة دماغ الماوس بسماكة 1 مم باستخدام هذا البروتوكول. يمثل الشكل 1B صور انتقال شريحة دماغ الفأر قبل وبعد العلاج المقاصة. جعلت طريقة تطهير الأنسجة شريحة دماغ فأر بسماكة 1 مم شفافة. تم العثور على توسع طفيف في الأحجام النهائية لشرائح الدماغ بعد الحضانة في محلول المقاصة لمدة 12 ساعة (التوسع الخطي: 102.5٪ ± 1.3٪). تم تقييم الحفاظ على التألق والسلامة الهيكلية للأنسجة باستخدام تعبير EGFP المستهدف في غشاء البلازما في الفئران PV-FGL (الشكل 1C). في هذه الفئرا.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي ينبغي إجراؤها بأقصى درجات الحذر للحصول على نتائج ذات مغزى. التثبيت الموحد للعينات أمر حتمي للتصوير 3D داخل الأنسجة واسعة النطاق. يجب أن تحتوي العدسة الموضوعية والعينة وسيولة الغمر على مثيل محجوز مطابق. سيؤدي عدم تطابق RI فيما بينها إلى تصوير مضطرب للغاية للخلايا المعبرة عن EGFP داخل شرائح الدماغ التي تم تطهيرها (الشكل 3). إن ضبط طوق التصحيح للعدسة الموضوعية على سائل الغمر يقلل من الانحرافات الكروية الناجمة .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفان يوكو إيشيدا (جامعة جونتيندو) على إنتاج نواقل فيروس AAV وكيسارا هوشينو (جامعة جونتيندو) على المساعدة التقنية. تم دعم هذه الدراسة من قبل JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 إلى T.F. ؛ JP20K07743 إلى M.K. ؛ JP21H02592 إلى H.H.) والبحث العلمي في مجال الابتكار "الرنين الحيوي" (JP18H04743 إلى H.H.). تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) (JP21dm0207112 إلى T.F. و H.H.) ، و Moonshot R & D من الوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JST) (JPMJMS2024 إلى H.H.) ، والبحوث الموجهة نحو الانصهار للعلوم والتكنولوجيا المدمرة (FOREST) من JST (JPMJFR204D إلى H.H.) ، والمنح المقدمة من معهد أبحاث أمراض الشيخوخة في كلية الطب بجام....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
16x عدسة موضوعية متعددة الغمرLeica MicrosystemsHC FLUOTAR 16x / 0.60 IMM CORR VISIR
AGARNacalai Tesque01028-85
AgaroseTaKaRa BioL03
ثنائي ميثيل سلفوكسيدNacalai Tesque13407-45
D-SorbitolNacalai Tesque06286-55
& - سيكلودكسترينواكو للصناعات الكيميائية النقية037-10643
الجلسرينسيجما-ألدريتشG9012
Huygens EssentialScientific Volume Imagingالإصدار 18.10.0p8 / 21.10.1p0 64b
ImarisBitplaneالإصدار 9.0.0
مجموعة تطبيقات Leica XLeica MicrosystemsLAS X ، الإصدار 3.5.5.19976
ميثيل بيتا سيكلودكسترينطوكيو للصناعة الكيميائيةM1356
بارافورمالدهايدميرك ميليبور1.04005.1000
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x ؛ درجة الحموضة 7.4)Nacalai Tesque27575-3110x PBS (–)
أزيد الصوديومNacalai Tesque31233-55
الصوديوم بنتوباربيتالKyoritsu SeiyakuN / A
TCS SP8Leica MicrosystemsN / A
Triton X-100Nacalai Tesque35501-15
UreaNacalai Tesque35940-65
قطاعة الأنسجة الاهتزازيةDosaka EMPRO7N

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة