يوفر البروتوكول طريقة مفصلة للتصوير العصبي في شريحة الدماغ باستخدام طريقة مسح الأنسجة ، ScaleSF. ويشمل البروتوكول إعداد أنسجة المخ، وتوضيح الأنسجة، والتعامل مع الشرائح التي تم تطهيرها، والتصوير المجهري بالليزر البؤري للهياكل العصبية من المستويات المجهرية إلى المجهرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة تطهير الأنسجة للتصوير العصبي من المقاييس المتوسطة إلى المجهرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لتصور الهياكل العصبية من المستويات المسكوبية إلى المجهرية في أنسجة المخ. يتم تصور الهياكل العصبية التي تتراوح من الدوائر العصبية إلى الهياكل العصبية دون الخلوية في شرائح دماغ الفئران التي تم تطهيرها بصريا باستخدام ScaleSF. طريقة التطهير هذه هي نسخة معدلة من ScaleS وهي طريقة إزالة الأنسجة المحبة للماء لشرائح الأنسجة التي تحقق قدرة تطهير قوية بالإضافة إلى مستوى عال من الحفاظ على إشارات التألق والسلامة الهيكلية. تم تصميم غرفة تصوير ثلاثية الأبعاد (3D) مطبوعة قابلة للتخصيص للتركيب الموثوق به لأنسجة المخ التي تم تطهيرها. تم إصلاح أدمغة الفئران التي تم حقنها بناقل فيروس مرتبط بالغدي يحمل جين بروتين فلورسنت أخضر محسن بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد ومقطعة إلى شرائح بسماكة 1 مم باستخدام قطاعة أنسجة مهتزة. تم تطهير شرائح الدماغ باتباع بروتوكول المقاصة، والذي يتضمن حضانات متسلسلة في ثلاثة حلول، وهي محلول Sca l eS0، ومحلول ملحي عازل للفوسفات (–)، ومحلول ScaleS4، بإجمالي 10.5-14.5 ساعة. تم تركيب شرائح الدماغ التي تم تطهيرها على غرفة التصوير وتضمينها في هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ المذاب في محلول ScaleS4D25 (0). تم الحصول على صورة 3D للشرائح باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤرة مجهز بعدسة موضوعية متعددة الغمر لمسافة عمل طويلة. بدءا من التصوير العصبي المنظاري ، نجحنا في تصور الهياكل العصبية الدقيقة تحت الخلوية ، مثل العمود الفقري التغصني والبوتونات المحورية ، في شرائح الدماغ التي تم تطهيرها بصريا. هذا البروتوكول من شأنه أن يسهل فهم الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات دون الخلوية.
المقدمة
وقد حسنت طرق إزالة الأنسجة التصوير المستقل عن العمق للعينات البيولوجية والسريرية باستخدام المجهر الضوئي، مما يسمح باستخراج المعلومات الهيكلية عن الأنسجة السليمة 1,2. يمكن لتقنيات المقاصة البصرية أيضا تسريع وتقليل تكلفة التحليل النسيجي. حاليا ، تتوفر ثلاثة طرق رئيسية للتطهير: الطرق المحبة للماء ، الكارهة للماء ، والهيدروجيل القائم على 1,2. النهج المحبة للماء تفوق في الحفاظ على إشارات التألق وسلامة الأنسجة وهي أقل سمية مقارنة بالنهجين الآخرين 3,4.
وتحتل طريقة المقاصة المحبة للماء، ScaleS، موقعا مميزا من خلال الحفاظ على السلامة الهيكلية والجزيئية فضلا عن قدرتها القوية على التطهير (طيف التطهير والحفظ)5. في دراسة سابقة ، طورنا بروتوكول تطهير سريع ومتساوي القياس ، Scal eSF ، لشرائح الأنسجة (سمك ~ 1 مم) عن طريق تعديل إجراء المقاصة في ScaleS6. يتطلب بروتوكول التطهير هذا حضانة متسلسلة لشرائح الدماغ في ثلاثة حلول لمدة 10.5-14.5 ساعة. تتميز هذه الطريقة بطيف عالي التطهير والحفظ ، وهو متوافق حتى مع تحليل المجهر الإلكتروني (EM) (الشكل التكميلي 1) ، مما يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد (3D) عالي الدقة متعدد النطاقات مع إعادة بناء إشارة دقيقة6. وبالتالي ، يجب أن يكون ScaleSF فعالا خاصة في الدماغ ، حيث تقوم الخلايا العصبية بوضع عمليات وفيرة ذات طول هائل ، وترتيب هياكل تحت الخلايا الدقيقة المتخصصة لنقل المعلومات واستقبالها. استخراج المعلومات الهيكلية مع المقاييس من الدائرة إلى المستويات دون الخلوية على الخلايا العصبية مفيد جدا نحو فهم أفضل لوظائف الدماغ.
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور الهياكل العصبية بمقاييس من الميزوسكوبيك / الدائرة إلى المستوى المجهري / دون الخلوي باستخدام ScaleSF. ويشمل البروتوكول إعداد الأنسجة، وتوضيح الأنسجة، والتعامل مع الأنسجة التي تم تطهيرها، والتصوير المجهري بالليزر البؤري (CLSM) للأنسجة التي تم تطهيرها. يركز بروتوكولنا على استجواب الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات دون الخلوية. للحصول على إجراء مفصل لإعداد المحاليل والحقن المجسمة لناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAV) في أدمغة الفئران ، راجع Miyawaki et al. 20167 و Okamoto et al. 20218 ، على التوالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة جونتيندو (الموافقة رقم 2021245 ، 2021246) وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية الأساسية للسير السليم للتجارب على الحيوانات من قبل مجلس العلوم الياباني (2006). هنا ، تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J التي تم حقنها بناقل AAV الذي يحمل جين بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) والبارفالبومين (PV) / myristoylation-EGFP-منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني C-terminal الكروموسوم الاصطناعي البكتيري الاصطناعي (BAC) الفئران المعدلة وراثيا (الفئران PV-FGL)9 . تم الحفاظ على الفئران PV-FGL في خلفية C57BL/6J. لم يتم العثور على اختلافات قائمة على الجنس فيما يتعلق بهذه الدراسة.
1. إعداد الأنسجة
- تثبيت التروية
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات من 1.1.1 إلى 1.1.3 في غطاء الدخان للحد من التعرض لبارافورمالدهيد (PFA).- تخدير الفئران الذكور البالغة (8-16 أسبوعا) عن طريق الحقن داخل الصفاق من جرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم (200 ملغ / كغ). تأكد من كفاية التخدير من خلال عدم وجود انسحاب قرصة إصبع القدم وردود الفعل طرفة العين.
- افتح التجويف الصدري واقطع الزائدة الأذينية اليمنى بالمقص الجراحي. قم بدمج الفئران مع 20 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات البارد (PBS) باستخدام إبرة 23 جم متصلة بحقنة سعة 20 مل ، تليها تروية 20 مل من PFA البارد المثلج بنسبة 4٪ في مخزن فوسفات مؤقت 0.1 م (PB) باستخدام حقنة أخرى سعة 20 مل.
تحذير: PFA سامة ومسخية. تجنب الاستنشاق أو ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية. - إزالة أنسجة المخ من الجمجمة باستخدام ملاقط. انقل أنسجة المخ إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 4٪ PFA في 0.1 M PB ، وقم بحماية العينات من الضوء ، واهتز بلطف بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على شاكر عند 50-100 دورة في الدقيقة.
- ملاحظة: يمكن تخزين أنسجة المخ التي تم حصادها لعدة أسابيع في 0.02٪ من أزيد الصوديوم (NaN3) في PBS عند 4 درجات مئوية.
تحذير: NaN3 سام. تجنب الاستنشاق أو ملامسة الجلد والعينين والأغشية المخاطية. تعامل معها داخل غطاء الدخان.
- تحضير شرائح الدماغ
- تحضير 4٪ أجار في PBS عن طريق إضافة 2 غرام من أجار إلى 50 مل من PBS. ضعي الخليط في الميكروويف حتى يذوب الآجار بالكامل. دع المحلول يبرد إلى 40-45 درجة مئوية.
ملاحظة: الخاصية اللزجة التي يوفرها agaropectin ، وهو مكون رئيسي من agar ، يحسن سهولة قطع شرائح الأنسجة. - أضف 10 مل من محلول الأجار إلى لوحة استزراع من 6 آبار. غمر أنسجة المخ في محلول أجار باستخدام الملقط. دع الأجار يتصلب على الجليد.
- قم بإزالة أنسجة المخ المدمجة من البئر وقم بتقليم الأجار بشفرة حلاقة. قم بتثبيت كتلة الأجار في الجزء السفلي من حمام الاهتزاز باستخدام الغراء الفائق واسكب 0.1 M PB في صينية التخزين المؤقت.
- نظف شفرة حلاقة أخرى باستخدام ورق مناديل خالية من الوبر غارق في الإيثانول وقم بتوصيل الشفرة بحامل شفرة قطاعة الأنسجة المهتزة.
- اضبط سرعة التقسيم على 0.14 مم / ثانية بسعة 1.4 مم والتردد إلى 75-77 هرتز.
ملاحظة: يمكن تخزين شرائح الدماغ لعدة أسابيع في 0.02٪ NaN3 في PBS عند 4 درجات مئوية.
- تحضير 4٪ أجار في PBS عن طريق إضافة 2 غرام من أجار إلى 50 مل من PBS. ضعي الخليط في الميكروويف حتى يذوب الآجار بالكامل. دع المحلول يبرد إلى 40-45 درجة مئوية.
2. توضيح الأنسجة
ملاحظة: يتم سرد تركيبات حلول ScaleS المستخدمة في الجدول 1. يجب حماية العينات من الضوء عن طريق تغطيتها بورق معدني. وترد خطوات المقاصة في الشكل 1 ألف.
- أضف 8 مل من محلول Sca leS0 إلى بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 6 آبار وأضف 8 مل من محلول ScaleS4 إلى بئر آخر من اللوحة وقم بتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة.
- انقل شرائح الدماغ إلى محلول ScaleS0 الذي تم تسخينه مسبقا باستخدام ملعقة واحتضنها لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز عند 90 دورة في الدقيقة.
- انقل شرائح الدماغ المتخلل في 8 مل من PBS (-) في صفيحة زراعة خلايا من 6 آبار مع ملعقة واغسلها لمدة 15 دقيقة عن طريق الاحتفاظ بها في شاكر مداري عند 40-60 دورة في الدقيقة. كرر هذا مرتين.
- انقل شرائح الدماغ في محلول ScaleS4 الذي تم تسخينه مسبقا بمقدار 8 مل باستخدام ملعقة وقم بمسحها عن طريق احتضانها في حاضنة اهتزاز عند 90 دورة في الدقيقة لمدة 8-12 ساعة عند 37 درجة مئوية. يمكن رؤية شرائح دماغية واضحة في الشكل 1.
3. تركيب شريحة الدماغ
ملاحظة: يتم استخدام غرفة تصوير قابلة للتخصيص للتركيب الموثوق به لشرائح الدماغ التي تم تطهيرها (الشكل 2)6. تتكون الغرفة من إطار الغرفة والغطاء السفلي. تم تصميم محولات مرحلة المجهر أيضا لتركيب غرفة التصوير على مراحل المجهر مباشرة (الشكل 2A ، B). يمكن طباعة إطار الغرفة ومحولات مرحلة المجهر 3D باستخدام خدمات الطباعة ثلاثية الأبعاد الداخلية أو الخارجية. يتم توفير بيانات التصميم 3D بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لغرفة التصوير في Furuta et al. 20226.
- لإعداد الغرفة ، قم بتوصيل إطار الغرفة بغطاء باستخدام مادة لاصقة حساسة للضغط.
- تحضير 1.5٪ من الأغاروز في محلولSca l eS4D25 (0) (ScaleS4 gel) عن طريق إضافة 1.5 غرام من الأغاروز إلى 100 مل من المحلول في زجاجة. اخلطي المحلول جيدا عن طريق تحريك المحلول ووضعه في الميكروويف حتى يذوب الأغاروز بالكامل. بمجرد الانتهاء من ذلك ، اترك المحلول يبرد إلى 37 درجة مئوية.
- قم بتركيب شريحة الدماغ التي تم تطهيرها على الغطاء السفلي لغرفة التصوير باستخدام ملعقة. امسح المحلول الزائد من الشريحة التي تم مسحها باستخدام ورق مناديل نظيف خال من الوبر.
- أضف جل ScaleS4 على شريحة الدماغ باستخدام ماصة دقيقة لملء غرفة التصوير. ضع غطاء آخر في الأعلى باستخدام ملقط وضع قطعة من المناديل الورقية الخالية من الوبر وشريحة زجاجية على الغطاء بهذا الترتيب.
- انقل غرفة التصوير إلى الثلاجة عند 4 درجات مئوية. ضع أوزانا معدنية على الشريحة الزجاجية واتركها لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة الأوزان المعدنية والانزلاق الزجاجي وورق المناديل الخالية من الوبر والغطاء من غرفة التصوير ، وامسح الجل الزائد بعيدا (الشكل 2A ، B).
- ضع غرفة التصوير في طبق بتري زجاجي مقاس 60 مم وقم بتوصيل حافة غرفة التصوير بالطبق باستخدام مادة لاصقة حساسة للضغط تشبه المعجون. نعلق الغرفة في نقاط متعددة على طبق بيتري.
- صب محلول ScaleS4 في الطبق ورجه بلطف لمدة 1 ساعة عند 20-25 درجة مئوية على شاكر مداري عند 40-60 دورة في الدقيقة. استبدله بمحلول منعش وأزل فقاعات الهواء على سطح الجل عن طريق كشط السطح بلطف باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر. قم بتركيب غرفة التصوير المغمورة على مرحلة المجهر (الشكل 2C).
4. تصوير CLSM
- احصل على صور باستخدام CLSM مزود بعدسة موضوعية متعددة الغمر لمسافة عمل طويلة (WD) (فتحة عدسة رقمية 16x/0.60 [NA]، WD = 2.5 مم).
ملاحظة: يمكن أن توفر العدسات عالية الدقة عالية الدقة المحدودة للحيود (NA) عالية القدر. - قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة (محطة العمل والمجهر والماسح الضوئي والليزر ومصباح الزئبق) وقم بتشغيل برنامج تصوير CLSM.
- اضبط طوق التصحيح للعدسة الموضوعية متعددة الغمر على 1.47. يحتوي حل ScaleS4 على معامل انكسار (RI) يبلغ حوالي 1.47 5,7. يمكن أن تزعج الانحرافات الناجمة عن عدم تطابق RI تكوين الصورة (الشكل 3).
- اغمر العدسة الموضوعية في المحلول ، واتركها تقترب من الشريحة ببطء. قم بإزالة أي فقاعات هواء عالقة على طرف العدسة الموضوعية. ابحث عن مناطق الاهتمام (ROIs) في الأنسجة التي تم تطهيرها باستخدام التألق اللاإرادي.
- قم بتعيين معلمات الحصول على الصور عن طريق اختبار الإعدادات المناسبة.
- تحديد عمق البت للحصول على الصورة. يزداد حجم بيانات الصورة مع عمق البت.
- اضبط الطول الموجي للكشف. اضبط البوابة المناسبة للكاشف وفقا لطيف الانبعاثات. تأكد من أن الطول الموجي للكشف لا يغطي أي خطوط ليزر.
- اضبط دقة xy . توفر التنسيقات الأكبر حجما دقة xy أفضل ، ولكن الأمر يستغرق وقتا أطول لجمع الصور.
- اضبط سرعة المسح الضوئي. توفر سرعة المسح الضوئي الأبطأ نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. ومع ذلك ، فإنه يزيد أيضا من وقت سكن البكسل وخطر التبييض الضوئي. اختر وفقا لذلك.
- اضبط حجم الثقب. يتحكم حجم الثقب في سمك المقطع البصري. يخلق حجم الثقب الأصغر قسما بصريا أرق ، وبالتالي دقة z أفضل ، ولكنه يقلل من إشارة التألق. إن تكبير حجم الثقب يوفر قسما بصريا أكثر سمكا مع إشارة تألق أقوى.
- اضبط طاقة الليزر ، وكسب الكاشف / مكبر الصوت ، والإزاحة. قم بزيادة طاقة الليزر تدريجيا واكتساب الكاشف / مكبر الصوت حتى يتم الحصول على صورة مناسبة. تحمل قوة الليزر العالية خطر التبييض الضوئي. اضبط الإزاحة (التباين) بشكل مناسب للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية.
- حدد منطقة الحراثة اللازمة بناء على حجم عائد الاستثمار. تأكد من التقاط كامل طول وعرض عائد الاستثمار.
- تنقل بين الأنسجة التي تم مسحها في جميع الطائرات، واضبط نقطتي البداية والنهاية للمكدس. اضبط حجم الخطوة z وفقا لدقة z المطلوبة.
- اجمع الصور عندما تكون راضيا عن إعدادات الحصول على الصور، وسجل الصور الملتقطة معالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تحقيق التطهير البصري لشريحة دماغ الماوس بسماكة 1 مم باستخدام هذا البروتوكول. يمثل الشكل 1B صور انتقال شريحة دماغ الفأر قبل وبعد العلاج المقاصة. جعلت طريقة تطهير الأنسجة شريحة دماغ فأر بسماكة 1 مم شفافة. تم العثور على توسع طفيف في الأحجام النهائية لشرائح الدماغ بعد الحضانة في محلول المقاصة لمدة 12 ساعة (التوسع الخطي: 102.5٪ ± 1.3٪). تم تقييم الحفاظ على التألق والسلامة الهيكلية للأنسجة باستخدام تعبير EGFP المستهدف في غشاء البلازما في الفئران PV-FGL (الشكل 1C). في هذه الفئرا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي ينبغي إجراؤها بأقصى درجات الحذر للحصول على نتائج ذات مغزى. التثبيت الموحد للعينات أمر حتمي للتصوير 3D داخل الأنسجة واسعة النطاق. يجب أن تحتوي العدسة الموضوعية والعينة وسيولة الغمر على مثيل محجوز مطابق. سيؤدي عدم تطابق RI فيما بينها إلى تصوير مضطرب للغاية للخلايا المعبرة عن EGFP داخل شرائح الدماغ التي تم تطهيرها (الشكل 3). إن ضبط طوق التصحيح للعدسة الموضوعية على سائل الغمر يقلل من الانحرافات الكروية الناجمة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويشكر المؤلفان يوكو إيشيدا (جامعة جونتيندو) على إنتاج نواقل فيروس AAV وكيسارا هوشينو (جامعة جونتيندو) على المساعدة التقنية. تم دعم هذه الدراسة من قبل JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 إلى T.F. ؛ JP20K07743 إلى M.K. ؛ JP21H02592 إلى H.H.) والبحث العلمي في مجال الابتكار "الرنين الحيوي" (JP18H04743 إلى H.H.). تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) (JP21dm0207112 إلى T.F. و H.H.) ، و Moonshot R & D من الوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JST) (JPMJMS2024 إلى H.H.) ، والبحوث الموجهة نحو الانصهار للعلوم والتكنولوجيا المدمرة (FOREST) من JST (JPMJFR204D إلى H.H.) ، والمنح المقدمة من معهد أبحاث أمراض الشيخوخة في كلية الطب بجامعة جونتيندو (X2016 إلى K.Y. ؛ X2001 إلى H.H.)، ومشروع العلامة التجارية للمدارس الخاصة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 16x عدسة موضوعية متعددة الغمر | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x / 0.60 IMM CORR VISIR | |
| AGAR | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| & - سيكلودكسترين | واكو للصناعات الكيميائية النقية | 037-10643 | |
| الجلسرين | سيجما-ألدريتش | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | الإصدار 18.10.0p8 / 21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | الإصدار 9.0.0 | |
| مجموعة تطبيقات Leica X | Leica Microsystems | LAS X ، الإصدار 3.5.5.19976 | |
| ميثيل بيتا سيكلودكسترين | طوكيو للصناعة الكيميائية | M1356 | |
| بارافورمالدهايد | ميرك ميليبور | 1.04005.1000 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x ؛ درجة الحموضة 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS (–) |
| أزيد الصوديوم | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| الصوديوم بنتوباربيتال | Kyoritsu Seiyaku | N / A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N / A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| قطاعة الأنسجة الاهتزازية | Dosaka EM | PRO7N |
المراجع
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601(2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230(2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611(2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), New York, N.Y. 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331(2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
