يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصنيع وتوصيف مصفوفة نانو قاعدة جانوس طبقة تلو الأخرى لتعزيز تجديد الغضروف

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/63984

⸱

يوليو 6, 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تجميع سقالة مصفوفة نانو قاعدة جانوس (JBNm) طبقة تلو الأخرى عن طريق إضافة أنابيب جانوس النانوية الأساسية (JBNts) ، و matrilin-3 ، وتحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-β1) بالتتابع. تم تصنيع JBNm وتمييزه. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر نشاطا حيويا ممتازا ، مما شجع وظائف الخلايا مثل الالتصاق والانتشار والتمايز.

الملخص

تم تطوير سقالات مختلفة من المواد الحيوية لتوجيه التصاق الخلايا وانتشارها على أمل تعزيز وظائف محددة للاستخدامات في المختبر وفي الجسم الحي . تتم إضافة عوامل النمو إلى سقالات المواد الحيوية هذه بشكل عام لتوفير بيئة مثالية لزراعة الخلايا ، ووساطة تمايز الخلايا ووظائفها اللاحقة. ومع ذلك ، فإن عوامل النمو في سقالة المواد الحيوية التقليدية عادة ما يتم تصميمها ليتم إطلاقها عند الزرع ، مما قد يؤدي إلى آثار جانبية غير مقصودة على الأنسجة أو الخلايا المحيطة. هنا ، نجحت مصفوفة النانو الأساسية المستوحاة من الحمض النووي Janus (JBNm) في تحقيق بيئة مجهرية محلية للغاية مع بنية طبقة تلو الأخرى لهياكل أنسجة الغضروف المستدامة ذاتيا. يتم تجميع JBNms ذاتيا من الأنابيب النانوية الأساسية Janus (JBNts) ، و matrilin-3 ، وتحويل عامل النمو beta-1 (TGF-β1) عبر التقارب الحيوي. تم تجميع JBNm بنسبة TGF-β1:matrilin-3:JBNt من 1:4:10 ، حيث كانت هذه هي النسبة المحددة التي يمكن أن يحدث فيها التجميع المناسب في بنية طبقة تلو الأخرى. أولا ، تمت إضافة حل TGF-β1 إلى حل matrilin-3. بعد ذلك ، تم ماصة هذا الخليط عدة مرات لضمان التجانس الكافي قبل إضافة محلول JBNt. شكل هذا JBNm طبقة تلو الأخرى ، بعد السحب عدة مرات مرة أخرى. تم إجراء مجموعة متنوعة من التجارب لتوصيف بنية JBNm طبقة تلو الأخرى ، JBNts وحدها ، matrilin-3 وحدها ، و TGF-β1 وحدها. تمت دراسة تكوين JBNm باستخدام أطياف امتصاص UV-Vis ، ولوحظ هيكل JBNm باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM). نظرا لأن سقالة JBNm المبتكرة طبقة تلو الأخرى تتشكل على نطاق جزيئي ، يمكن ملاحظة JBNm المسمى بصبغة الفلورسنت. يقتصر TGF-β1 داخل الطبقة الداخلية من JBNm القابل للحقن ، والذي يمكن أن يمنع إطلاق عوامل النمو إلى المناطق المحيطة ، ويعزز تكوين الغضروف الموضعي ، ويعزز بيئة دقيقة مضادة للضخامة.

المقدمة

تلعب السقالات في هندسة الأنسجة دورا حيويا في توفير الدعم الهيكلي لربط الخلايا وتطوير الأنسجة اللاحق1. عادة ، تعتمد هياكل الأنسجة التقليدية دون أي سقالات على بيئة زراعة الخلايا وعوامل النمو المضافة للتوسط في تمايز الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن هذه الإضافة للجزيئات النشطة بيولوجيا إلى السقالات غالبا ما تكون النهج المفضل في توجيه تمايز الخلايا ووظيفتها 2,3. يمكن لبعض السقالات محاكاة البيئة الدقيقة الكيميائية الحيوية للأنسجة الأصلية بشكل مستقل ، في حين أن البعض الآخر يمكن أن يؤثر بشكل مباشر على وظائف الخلايا عبر عوامل النمو. ومع ذلك ، غالبا ما يواجه الباحثون تحديات في اختيار السقالات التي يمكن أن تؤثر بشكل إيجابي على التصاق الخلايا ونموها وتمايزها ، مع توفير الدعم الهيكلي الأمثل والاستقرار على مدى فترة طويلة 4,5. غالبا ما ترتبط الجزيئات النشطة بيولوجيا بشكل فضفاض بالسقالة مما يؤدي إلى إطلاق سريع لهذه البروتينات عند الزرع ، مما يؤدي إلى إطلاقها في مواقع غير مرغوب فيها. هذا يبلغ ذروته في الآثار الجانبية على الأنسجة أو الخلايا التي لم يتم استهدافها عمدا 6,7.

عادة ما تكون السقالات مصنوعة من مواد بوليمرية. مصفوفة النانو الأساسية Janus (JBNm) هي منصة سقالة محاكاة حيوية تم إنشاؤها باستخدام طريقة جديدة طبقة تلو الأخرى لبناء أنسجة الغضروف المستدامة ذاتيا8. وقد سميت هذه الأنابيب النانوية الجديدة المستوحاة من الحمض النووي باسم الأنابيب النانوية الأساسية Janus (JBNts) ، لأنها تحاكي بشكل صحيح بنية وكيمياء سطح الكولاجين الموجودة في المصفوفة خارج الخلية (ECM). مع إضافة جزيئات نشطة بيولوجيا ، مثل matrilin-3 وتحويل عامل النمو Beta-1 (TGF-β1) ، يمكن ل JBNm إنشاء بيئة دقيقة مثالية يمكنها بعد ذلك تحفيز وظائف الخلايا والأنسجة المطلوبة9.

JBNts هي أنابيب نانوية جديدة مشتقة من إصدارات اصطناعية من الأدينين والثيمين. يتم تشكيل JBNts من خلال التجميع الذاتي10 ؛ ترتبط ست قواعد نووية اصطناعية لتشكيل حلقة ، وتخضع هذه الحلقات لتفاعلات تكديس π π لإنشاء أنبوب نانوي بطول 200-300 ميكرومتر11. هذه الأنابيب النانوية تشبه هيكليا بروتينات الكولاجين. من خلال محاكاة جانب من البيئة الدقيقة للغضروف الأصلي ، ثبت أن JBNts يوفر موقعا مواتيا للخلايا الغضروفية والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) 11،12،13،14. نظرا لأن الأنابيب النانوية تخضع للتجميع الذاتي ولا تتطلب أي نوع من البادئ (مثل الأشعة فوق البنفسجية) ، فإنها تظهر إمكانات مثيرة كسقالة قابلة للحقن لمناطق العيوب التي يصعب الوصول إليها15.

Matrilin-3 هو بروتين مصفوفة هيكلي خارج الخلية موجود في الغضروف. يلعب هذا البروتين دورا مهما في تكوين الغضروف ووظيفة الغضروف المناسبة16,17. في الآونة الأخيرة ، تم تضمينه في سقالات المواد الحيوية ، مما شجع على تكوين الغضروف دون تضخم9،18،19. من خلال تضمين هذا البروتين في JBNm ، تنجذب خلايا الغضروف إلى سقالة تحتوي على مكونات مماثلة لتلك الموجودة في بيئتها الدقيقة الأصلية. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أن هناك حاجة إلى matrilin-3 لإشارات TGF-β1 المناسبة داخل الخلايا الغضروفية20. تعمل عوامل النمو كجزيئات إشارة ، مما يسبب نموا محددا لخلية أو نسيج معين. وبالتالي ، لتحقيق التجديد الأمثل للغضروف ، فإن matrilin-3 و TGF-β1 هي مكونات أساسية داخل JBNm. يمكن أن تؤدي إضافة TGF-β1 إلى السقالة طبقة تلو الأخرى إلى زيادة تعزيز تجديد الغضروف في بناء الأنسجة. TGF-β1 هو عامل نمو يستخدم لتشجيع عملية الشفاء من العيوب العظمية الغضروفية ، وتشجيع انتشار الخلايا الغضروفية و hMSC والتمايز21,22. وبالتالي ، يلعب TGF-β1 دورا رئيسيا في تجديد الغضروف JBNm (J / T / M JBNm)23 ، مما يشجع على النمو السليم خاصة عندما يتم توطينه داخل طبقات JBNm.

كما ذكرنا سابقا ، يتم تجميع عوامل النمو عادة على السطح الخارجي للسقالات دون طرق محددة للدمج. هنا ، مع البنية النانوية المصممة بدقة للمواد الحيوية ، تم تطوير JBNm لاستهداف محدد للخلايا والأنسجة المقصودة. يتكون JBNm من TGF-β1 ملتصقة على أسطح JBNt في الطبقة الداخلية و matrilin-3 ملتصقة على أسطح JBNt في الطبقة الخارجية24,25. يسمح دمج TGF-β1 في الطبقة الداخلية لهيكل الطبقة تلو الأخرى ببيئة دقيقة موضعية للغاية على طول ألياف JBNm ، مما يخلق بنية أنسجة استتبابية مع إطلاق أبطأ بكثير للبروتين12. إن قابلية حقن JBNm تجعله بنية مثالية لأنسجة الغضروف لمختلف تطبيقات المواد الحيوية المستقبلية26.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. توليف JBNts

  1. تحضير مونومر JBNt باستخدام الطرق المنشورة سابقا ، والتي تنطوي على توليف مجموعة متنوعة من المركبات12.
  2. تنقية مونومر JBNt الخام بعد تصنيعه باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) باستخدام عمود الطور العكسي. استخدم المذيب A: 100٪ ماء ، والمذيب B: 100٪ acetonitrile ، والمذيب C: محلول ماء HCl مع درجة الحموضة = 1. استخدم معدل تدفق 3 مل / دقيقة. جمع أكبر قمة تم الحصول عليها في HPLC في 7.2 دقيقة.

2. تصنيع JBNt / Matn1 / TGF-β1 (فيديو 1)

ملاحظة: يظهر الفيديو 1 أن JBNm عبارة عن مادة صلبة قابلة للحقن تشكلت في بيئة فسيولوجية (محلول مائي ، بدون ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، لا إضافات كيميائية ، ولا تدفئة) ، وهي أيضا مستوحاة بيولوجيا.

  1. أضف 8 ميكرولتر من 1 ملغم / مل TGF-β1 معلقة في H 2 O إلى32 ميكرولتر من 1 ملغ / مل ماتريلين-3 معلقة في H2O. مابيت لضمان الخلط السليم لهذه البروتينات.
  2. أضف 80 ميكرولتر من 1 ملغم/مل من JBNts معلقة في H2O إلى محلول TGF-β1/matrilin-3. ماصة بشكل متكرر لضمان المزج السليم. يمكن ملاحظة وجود اللبد الأبيض مباشرة بعد إضافة JBNts ، مما يشير إلى تكوين JBNm (فيديو 1).

3. مراقبة العينات مع امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المرئية (UV-Vis)

ملاحظة: تمت دراسة أطياف امتصاص UV-Vis لتوصيف تجميع JBNm. تم تحليل هذا القياس لأربع فئات: JBNts وحدها ، و matrilin-3 وحدها ، و TGF-β1 وحدها ، و JBNm الكامل طبقة تلو الأخرى ، والتي تتكون من جميع الأجزاء الثلاثة. يتم تعليق جميع التركيزات الأولية في H2O.

  1. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف 5 ميكرولتر من 1 مجم / مل JBNts إلى 50 ميكرولتر من H2O لصنع محلول 90.9 ميكروغرام / مل.
  2. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 15 ميكرولتر من H2O لصنع محلول 7.3 ميكروغرام / مل.
  3. بالنسبة لمجموعة TGF-β1 ، أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 إلى 45 ميكرولتر من H2O لصنع محلول 1.8 ميكروغرام / مل.
  4. بالنسبة لمجموعة JBNm ، أضف 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1. قم بالتحريض لضمان الخلط السليم ، ثم أضف 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts إلى المحلول ، وسحب السحب بشكل متكرر لخلط العينة.
  5. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس طيف الامتصاص لكل مجموعة.

4. قياس زيتا المحتملة للعينات

ملاحظة: تم تحليل إمكانات زيتا للتنبؤ بشكل أفضل بكيفية تفاعل JBNm مع الأنسجة الحية . تم قياس ثلاث مجموعات: matrilin-3 وحدها ، matrilin-3 مع TGF-β1 ، و JBNm الكامل طبقة تلو الأخرى.

  1. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 160 ميكرولتر من 10 mg / mL matrilin-3 إلى 640 μL من H2O لصنع محلول 800 μL.
  2. بالنسبة لمركب matrilin-3/TGF-β1، أضف 160 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل ماتريلين-3 إلى 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل TGF-β1. ماصة مرارا وتكرارا لضمان التجانس السليم. ثم أضفه إلى 600 ميكرولتر من H2O مما أدى إلى محلول 800 ميكرولتر.
  3. بالنسبة لمجموعة JBNm ، أضف 160 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1. ماصة عدة مرات لخلط البروتينات. ثم أضف 20 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى المحلول وماصة لضمان التجانس. أخيرا ، أضف محلول JBNm إلى 580 ميكرولتر من H2O لإنتاج محلول 800 ميكرولتر.
  4. قم بقياس قيم زيتا المحتملة للمجموعات الثلاث.

5. تحضير مصفوفة نانو JBNt/matrilin-3 للمجهر الإلكتروني الناقل (TEM)

ملاحظة: يتم إجراء توصيف TEM لتوصيف مورفولوجيا JBNts و JBNm.

  1. أدخل شبكتين في منظف البلازما لتنظيف الشبكات بشكل صحيح قبل التلطيخ السلبي ل JBNts و JBNm وفقا للبروتوكولات المنشورة وبروتوكولات الشركة المصنعة12.
  2. قم بإنشاء محلول JBNt 200 ميكروغرام / مل عن طريق خلط 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts مع 40 ميكرولتر من الماء المقطر.
  3. امزج 30 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 مع 20 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل TGF-β1 وماصة عدة مرات. أضف 10 ميكرولتر من 1 ملغم/مل من JBNts إلى خليط matrilin-3/TGF-β1 لإعداد عينة JBNm. مرة أخرى ، ماصة مرارا وتكرارا.
  4. أضف 3 ميكرولتر من محلول JBNt (200 ميكروغرام / مل) و 3 ميكرولتر من محلول JBNm على شبكات منفصلة ، واتركها لمدة 2 دقيقة.
  5. شطف كل شبكة مع 100 ميكرولتر من محلول خلات اليورانيل (0.5 ٪). استخدم أوراق الترشيح لإزالة المحلول الزائد والسماح للشبكات بالجفاف في الهواء.
  6. تشغيل المجهر الإلكتروني الناقل لمراقبة العينات وتوصيفها بشكل صحيح ، كما هو منشور سابقا11,12.

6. قياس أطياف الامتصاص للبروتينات ذات العلامات الفلورية

ملاحظة: يتم التحقق من بنية JBNm من خلال مراقبة هياكل JBNm مع التحليل الطيفي للامتصاص.

  1. قم بتسمية TGF-β1 باستخدام مجموعة ملصقات البروتين باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أضف 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل تحمل علامة TGF-β1 إلى 25 ميكرولتر من H2O لإنشاء حل اختبار 8.9 ميكروغرام / مل.
  2. قم بتسمية matrilin-3 باستخدام مجموعة ملصقات منفصلة. أضف 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام / مل من ماتريلين-3 إلى 25 ميكرولتر من H2O لصنع محلول اختبار 36 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: أدى وسم صبغة الفلورسنت ل TGF-β1 إلى تركيز نهائي قدره 20 ميكروغرام/مل، في حين أدى وسم الماتريلين-3 إلى تركيز نهائي قدره 80 ميكروغرام/مل.
  3. امزج 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام / مل من ماتريلين-3 مع 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل تحمل علامة TGF-β1 و 5 ميكرولتر من H2O ، مما أدى إلى مركب TGF-β1 / matrilin-3 المسمى . ماصة الخليط عدة مرات للخلط.
  4. أضف 5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى 40 ميكرولتر من H2O ، مما أدى إلى محلول 111 ميكروغرام / مل.
  5. أضف 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل تحمل علامة TGF-β1 إلى 20 ميكرولتر من 80 ميكروغرام / مل تحمل علامة matrilin-3 وماصة عدة مرات. أضف 5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى محلول TGF-β1 / matrilin-3 المسمى ، وماصة بشكل متكرر لخلط المركب بشكل صحيح.
    ملاحظة: كانت التركيزات النهائية لعينات JBNt، المسماة TGF-β1، وعينات matrilin-3 المسماة 111 ميكروغرام/مل، و8.9 ميكروغرام/مل، و36 ميكروغرام/مل، على التوالي.
  6. انقل كل مجموعة عينة (أي TGF-β1 (الخطوة 6.1) ، و matrilin-3 (الخطوة 6.2) ، ووصفت TGF-β1 / matrilin-3 (الخطوة 6.3) ، و JBNts (الخطوة 6.4) ، و JBNm (الخطوة 6.5)) إلى بئرها الخاص من لوحة سوداء ذات 384 بئرا.
  7. قم بتحميل اللوحة السوداء ذات ال 384 بئرا في قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الأوضاع وخذ قياسات بأطوال موجية مثيرة تبلغ 488 نانومتر و 555 نانومتر وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

7. في المختبر اختبار الوظيفة البيولوجية

  1. اختبار التصاق الخلايا على الغطاءغرف الزجاجية المطلية مسبقا
    1. قم بإعداد نظارتين من الأغطية مع خمس مجموعات من العينات ، حيث يتم استخدام غطاء واحد لكل نوع من أنواع الخلايا.
    2. أضف 1.25 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts إلى 198.75 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول 6.25 ميكروغرام / مل.
    3. أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 190 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما يؤدي إلى 0.5 ميكروغرام / مل.
    4. أضف 2.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل TGF-β1 إلى 197.5 ميكروغرام/مل من الماء المقطر، مما يؤدي إلى محلول 0.125 ميكروغرام/مل.
    5. بالنسبة لمجموعة JBNm ، أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 2.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / mLTGF-β1 وماصة مرارا وتكرارا. أضف 1.25 ميكرولتر من JBNts بتركيز 1 ملغم/مل إلى محلول الخليط والماصة. وأخيرا، أضف 186.25 ميكرولتر من الماء المقطر لينتج عنه محلول JBNm سعة 200 ميكرولتر.
      1. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، استخدم 200 ميكرولتر من الماء المقطر.
    6. أضف كل مجموعة عينة إلى بئرها الخاص من زجاج الغلاف رقم 1.5 ذو الحجرات. ضع الغطاء الزجاجي في ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم قم بتجميده وتجفيفه باستخدام أداة lyophilizer.
    7. زرع الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (hMSCs) والخلايا الغضروفية البشرية (10000 خلية لكل بئر) في كل بئر من نظارات الغلاف المحضرة.
    8. احتضن نظارتي الغطاء لمدة 4 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية. ثم ، استطلع وسط زراعة الخلايا وشطفه مرتين باستخدام PBS.
    9. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 5 دقائق، ومن ثم إزالة وشطف العينات مع PBS. شطف العينة مرة ثانية لإزالة 4٪ بارافورمالديهايد تماما.
    10. احتضان الخلايا مع 100 ميكرولتر من 0.1 ٪ Triton-X لمدة 10 دقائق وغسلها مع PBS. أضف 100 ميكرولتر من 0.165 ميكرومتر من الرودامين-فالويدين إلى كل بئر. انتظر لمدة 30 دقيقة ثم اغسلها باستخدام PBS مرة أخرى.
    11. أضف 0.1 ميكروغرام / مل DAPI إلى كل بئر لتلطيخ النوى. انتظر لمدة 5 دقائق وشطف الآبار باستخدام PBS مرتين.
    12. استخدم المجهر الطيفي البؤري لمراقبة مورفولوجيا الخلية والتقاط الصور الفلورية.
    13. علاوة على ذلك ، قم بتحليل رقم الخلية والمورفولوجيا باستخدام برنامج معالجة الصور. افتح البرنامج وقم بتحميل الصور. أضف شريط مقياس وقم بمعايرة البرنامج. احسب عدد الخلايا في منطقة معينة لكل عينة. ثم استخدم أداة القياس لجمع البيانات حول مورفولوجيا الخلية لكل عينة.
  2. تكاثر الخلايا
    1. قم بإعداد ثلاث صفائح غير معالجة من 96 بئرا ، مع إضافة خمس مجموعات من العينات إلى كل منها.
      1. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف 3.75 ميكرولتر من 1 mg / mL JBNts إلى 596.25 μL من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول JBNt 600 ميكرولتر بتركيز 6.25 ميكروغرام / مل.
      2. بالنسبة لمجموعة TGF-β1 ، أضف 7.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 إلى 592.5 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول اختبار 0.125 ميكروغرام / مل.
      3. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 30 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 570 ميكرولتر من الماء المقطر ، مما أدى إلى محلول اختبار 0.5 ميكروغرام / مل.
      4. بالنسبة لمجموعة JBNm ، امزج 7.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 مع 30 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 وماصة عدة مرات ، تليها إضافة 3.75 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts إلى المحلول.
      5. قم بتخفيف محلول JBNm باستخدام 558.75 ميكرولتر من الماء المقطر للحصول على التركيزات النهائية البالغة 6.25 ميكروغرام / مل ، و 0.125 ميكروغرام / مل ، و 0.5 ميكروغرام / مل ، على التوالي ، لعينات JBNt و TGF-β1 و matrilin-3.
      6. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، استخدم 600 ميكرولتر من الماء المقطر.
    2. قسم كل مجموعة عينة إلى ستة آبار (عينة 100 ميكرولتر لكل بئر).
    3. ضع الألواح الثلاثة التي تحتوي على جميع العينات في ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم جففها بالتجميد باستخدام أداة التجفيد.
    4. بذور hMSCs على هذه الصفائح ، يتلقى كل منها تعليق خلية 100 ميكرولتر (لكل بئر) يحتوي على 5000 خلية. احتضن اللوحات الثلاث عند 37 درجة مئوية لمدة 1 يوم أو 3 أيام أو 5 أيام عند 5٪ CO2.
    5. أضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر مع الخلايا واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أخرى.
    6. قم بقياس قيم الامتصاص لكل بئر باستخدام قارئات الصفائح الدقيقة متعددة الأوضاع عند 450 نانومتر.
    7. زرع تدرج معروف من hMSCs على صفيحة 96 بئر وحضانة لمدة 4 ساعات. استخدم فحص CCK-8 لقياس قيم امتصاص العدد المعروف من الخلايا وإنشاء منحنى قياسي.
    8. احسب تكاثر الخلايا باستخدام منحنى معيار الامتصاص.
  3. اختبار الثبات
    ملاحظة: تم استخدام مجموعة ELISA البشرية المستهدفة TGF-β1 لتحديد النسبة المئوية لإطلاق TGF-β1 من JBNm في هيدروجيل الأغاروز.
    1. تحضير 2٪ من الأغاروز عن طريق إضافة 400 ملغ من مسحوق الأغاروز إلى 20 مل من PBS وتسخينه حتى 100 درجة مئوية لإذابة مسحوق الأغاروز تماما.
    2. تحضير JBNm داخل هيدروجيل الأغاروز المبرد بنسبة 2٪.
      1. الجمع بين 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 ، 40 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 ، 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل JBNts ، و 195 ميكرولتر من PBS. امزج هذا المحلول مع 250 ميكرولتر من 2٪ من الأغاروز ، مما يخلق هيدروجيل JBNm.
    3. أضف 500 ميكرولتر من PBS ، واستخدمه كحل للإصدار ، وتأكد من تغييره كل 3 أيام. احتفظ بكل حل تم إصداره ، واترك العينة تجلس لمدة 15 يوما.
    4. استخدم مجموعة ELISA لاختبار كل حل من حلول الإصدار التي تم التقاطها ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: بطرح كمية TGF-β1 الصادرة في PBS من قيمة التحميل النظرية البالغة 100٪، يمكن تحديد الكمية المتبقية من TGF-β1.
  4. تحليل تمايز الخلايا باستخدام PCR26.
    1. قم بإعداد سبع مجموعات من العينات مع كل عينة تحتوي على 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا (4 × 104 خلايا) ، و 30 ميكرولتر من المحلول المحدد (أو PBS ، اعتمادا على مجموعة العينة) ، و 50 ميكرولتر من 2 وزن ٪ من الأغاروس.
      1. بالنسبة لمجموعة TGF-β1 ، أضف 5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 إلى 25 ميكرولتر من PBS ، مما أدى إلى حل 1.6 ميكروغرام / مل.
      2. بالنسبة لمجموعة matrilin-3 ، أضف 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 10 ميكرولتر من PBS ، مما أدى إلى محلول 6.7 ميكروغرام / مل.
      3. بالنسبة لمجموعة JBNt ، أضف 2.5 ميكرولتر من 1 mg / mL JBNts إلى 27.5 μL من PBS ، مما أدى إلى محلول 83.3 ميكروغرام / مل.
      4. بالنسبة لمجموعة J / T / M JBNm ، أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ماتريلين-3 إلى 5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل TGF-β1 وماصة لأعلى ولأسفل لخلط المحلول. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من 1 ملغم / مل JBNts وماصة مرة أخرى. أخيرا ، تمييع مع 2.5 ميكرولتر من PBS.
      5. لكل مجموعة تحكم ، استخدم 30 ميكرولتر من PBS كعينة.
    2. أضف 0.5 مل من وسط زراعة الخلايا إلى كل بئر ، مع التأكد من استبداله كل 3 أيام.
      1. بالنسبة لمجموعة التحكم الإيجابية ، استخدم وسيطا غضروفيا hMSC متاحا تجاريا يحتوي على TGF-β1 مضاف. هذا TGF-β1 الإضافي يساوي المبلغ في كل من مجموعات TGF-β1 و J / T / M JBNm.
      2. بالنسبة لإحدى مجموعات التحكم السلبية، استخدم وسيطا غضروفيا تجاريا hMSC لا يحتوي على TGF-β1. بالنسبة لمجموعة التحكم السلبية الأخرى ، استخدم وسيط زراعة خلايا DMEM يحتوي على 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS).
      3. لكل مجموعة أخرى ، استخدم وسيطا تجاريا لزراعة الخلايا الغضروفية hMSC بدون TGF-β1.
    3. استزرع العينات لمدة 15 يوما.
    4. استخراج الحمض النووي الريبي للعينات وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لدراسة تمايز العينات كما هو موضح سابقا26.
  5. التلطيخ المناعي لفحص تعبير الكولاجين من النوع X
    1. قم بإعداد سبع عينات قائمة على الأغاروز بنفس طريقة تمايز الخلايا مع قسم طريقة PCR (الخطوة 7.4).
    2. استزرع العينات لمدة 15 يوما.
    3. إصلاح العينات مع 4 ٪ الفورمالديهايد لمدة 1 يوم ، نقع في محلول السكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها ، ثم تجميد بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية مع النيتروجين السائل. قم بإصلاح العينات باستخدام كاشف مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) ، وهو مزيج من الجليكولات والراتنجات القابلة للذوبان في الماء ، عند -10 درجة مئوية.
    4. قم بتشغيل ميكروتوم كريوستات للحصول على أقسام مجمدة بسماكة 20 ميكرومتر من كل عينة.
    5. قم بتلطيخ كل قسم بجسم مضاد مضاد للكولاجين X مع تخفيف 1:800 وجسم مضاد ثانوي يحمل علامة الفلورسنت المخفف باستخدام PBS ، وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
    6. راقب كل قسم باستخدام مجهر بؤري ، باستخدام إثارة 488 نانومتر وتكبير 40x على العين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد البروتوكول ، تم تصنيع JBNts بنجاح وتميزت بامتصاص UV-Vis و TEM. JBNm هي سقالة صلبة قابلة للحقن تخضع لعملية محاكاة حيوية سريعة. بعد إضافة JBNts إلى خليط من محلول TGF-β1 / matrilin-3 في بيئة فسيولوجية ، تم تشكيل سقالة شبكية بيضاء صلبة تشير إلى التجميع الناجح ل JBNm ، كما هو موضح في الشكل 1. وقد تجلى ذلك في أساليب التوصيف.

في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الأمتريلين-3 سالبة الشحنة بسبب النقطة الكهربية المتساوية27 (الشكل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الهدف من هذه الدراسة هو تطوير منصة سقالة محاكاة حيوية ، JBNm ، للتغلب على قيود هياكل الأنسجة التقليدية التي تعتمد على بيئات زراعة الخلايا للتوسط في تمايز الخلايا. JBNm عبارة عن سقالة بنية طبقة تلو الأخرى لبناء أنسجة غضروفية مستدامة ذاتيا. ويستند التصميم المبتكر إلى مواد نانوية جديدة مستوحاة من الحمض النووي، وهي JBNts. يتم تجميع JBNm ، المكون من JBNts30 و TGF-β1 و matrilin-3 ، من خلال تقنية جديدة طبقة تلو الأخرى حيث تم التحكم في التجميع الذاتي للسقالة على المستوى الجزيئي. وقد لوحظ تجميع JBNm وتميز ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الدكتور يوبينغ تشن هو المؤسس المشارك لشركة Eascra Biotech, Inc. و NanoDe Therapeutics, Inc.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 7R01AR072027 و 7R03AR069383 ، وجائزة NSF المهنية 1905785 ، و NSF 2025362 ، وجامعة كونيتيكت. يتم دعم هذا العمل أيضا جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD016435.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ مصل الماعز العاديThermo Fisher50062Zيستخدم لمنع إجراءات ربط الأجسام المضادة غير المحددة أثناء التلوين.
لوحة 24 بئرCorning07-200-740صفيحة 24 بئرا تستخدم لزراعة الخلايا المقارنة.
384 بئر لوحة سوداء غير معالجةThermo Fisher262260384 بئر لوحة تستخدم لقياسات الامتصاص.
غطاء زجاجي ذو 8 آبارThermo Fisher155409PK8 آبار يستخدم لزراعة الخلايا المقارنة.
96 بئر مسطحةالقاع Corning07-200-91لوحة 96 بئر تستخدم لزراعة الخلايا المقارنة.
96-Well Plate غير المعالجةThermo Fisher260895صفيحة 96 بئرا تستخدم لزراعة الخلايا المقارنة والتحليل.
Agarose GelSigma-AldrichA9539Hydrogel يستخدم لزراعة الخلايا.
Agarose GelSigma AldrichA9539Hydrogel كبيئة لزراعة الخلايا.
طقم وضع العلامات على البروتين المجهري Alexa FluorThermo FisherA30006 (488) و A30007 (555)صبغة الفلورسنت المستخدمة لتسمية البروتينات.
الأجسام المضادة للكولاجين Xالمضادة Thermo Fisher41-9771-82الجسم المضاد المستخدم في تلطيخ الكولاجين X.
Bio-Rad PCR MachineBio-Radتستخدم لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على العينات.
C28 / I2 خلايا خطالمستخدمة لتحليل القدرات التكاثرية للعينات المختلفة.
مجموعة عد الخلايا 8Milipore Sigma96992مقايسة تكاثر الخلايا.
برنامج Cell ProfilerBroadInstitute لتحليل صور الخلايا.
Cryostat Microtomeلإنتاج شرائح رقيقة من العينات لاستخدامها في التلوين والفحص المجهري.
DAPIInvitrogenD1306صبغة فلورية زرقاء ترتبط بمناطق الحمض النووي للأدينين والثايمين.
كوفيت يمكن التخلص منهFISHER Scientific14-955-128حاوية تستخدم في قياس الطيف الضوئي.
DMEM Cell Culture MediumThermo Fisher10566032Media تستخدم لدعم النمو الخلوي.
مصل الأبقار الجنينيجيبكوA4766801مصل يستخدم في وسط زراعة الخلايا لدعم نمو الخلايا.
محلول Fluoromount-G Mounting Thermo Fisher00-4958-02يستخدم لتركيب الشرائح للتلوين المناعي.
الفورمالديهايديستخدم لإصلاح العينات قبل الميكروتومين.
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاصالحراري فيشرA16110الجسم المضاد المستخدمة في تلطيخ البروتين.
الخلايا الجذعية الوسيطة البشريةLONZAPT-2501الخلايا المستخدمة لتحليل القدرات التفاضلية للعينات المختلفة.
الوسيطة الجذعية الوسيطةالبشرية LONZAPT-3003وسيط الخلية يستخدم لتعزيز التمايز الغضروفي المنشأ.
في المعاهد الوطنية للصحةImageJ جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري.
طقم 1725150 بخطوة واحدة من مجموعة أدوات iTaq Universal SYBR الخضراءBioRadالمستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
الأنابيب النانوية ذات قاعدة Janus (JBNts)أنابيب نانوية مصنوعة من قواعد نووية اصطناعية لتكون بمثابة أداة سقالات الخلية.
LaB6 20-120 كيلو فولت نقل المجهر الإلكترونيمعدات Tecnaiتستخدم لإجراء الفحص المجهري الإلكتروني على عينة.
MATLABMathWorksالإحصائي البرمجيات المستخدمة للنمذجة وتحليل البيانات.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050بروتين هيكلي يستخدم كمواقع التصاق للخلايا الغضروفية.
الطيف الضوئي NanoDropمعدات Thermo Fisherالمستخدمة لقياس قيم امتصاص العينة.
مجهر متحد البؤر الطيفي نيكون A1RنيكونA1R HD25يستخدم لتحليل العينات.
رقم 1.5 غطاء الغرفةThermo Fisher152250بيئة لزراعة الخلايا المعقمة والتصوير.
مركب درجة حرارة القطع الأمثليستخدم لتضمين الخلايا قبل الميكروتومين.
AAJ19943K2بارافورمالديهايدالحرارييستخدم لإصلاح الخلايا.
PDC-32G منظف البلازماهاريكمنظف البلازما يستخدم لإعداد الشبكات قبل الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال.
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15-140-148عامل مضاد حيوي يستخدم لتثبيط نمو البكتيريا أثناء زراعة الخلايا.
10010023Fisherالمخزن بالفوسفاتيستخدم لغسل وسط الخلية ويعمل كمخزن مؤقت أثناء التجريب.
صبغة الفلورسنت الحمراء Rhodamine-phalloidinInvitrogenR415F-Actin.
Rneasy Plant MiniQIAGEN74904تستخدم لتصفية العينات وتجانسها أثناء استخراج الحمض النووي الريبي.
السكروزيستخدم لمعالجة العينات قبل الميكروتومين.
طقم فحص TGF beta-1 Human ELISAKit InvitrogenBMS249-4المستخدمة لتحديد وجود TGF- & بيتا ؛ 1 في عينة.
TGF- & بيتا ؛ 1PEPROTECH100-21Cعامل النمو المستخدم لتحفيز التمايز والانتشار الغضروراوي.
Triton-XInvitrogenHFH10يستخدم لتحلل الخلايا غير الثابتة أثناء عملية التلوين.
كاشف TRIzolThermo Fisher15596026كاشف يستخدم لعزل الحمض النووي الريبي.
Zetasizer Nano ZSMalvern التحليليةلقياس قيم زيتا المحتملة للعينة.
يستخدم الخلايا الغضروفية يستخدم تستخدم معدات مركب وسيط الخلية يستخدم برنامج تحليل الصور مقياس المجهر متحد البؤر مركب كاشف مركب العلمي محلول Sory Thermal مجموعة Kit محلول مركب تستخدم معدات

المراجع

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106(2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317(2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590(2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823(2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676(2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670(2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147(2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

3 1
تصنيع وتوصيف مصفوفة نانو قاعدة جانوس طبقة تلو الأخرى لتعزيز تجديد الغضروف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.