مقالة منهجية

تلطيخ ثلاثي الأبعاد للكلى بالكامل مع CUBIC

4.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/63986

⸱

يوليو 18, 2022

 , 
1Division of Nephrology and Endocrinology, The University of Tokyo

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي طريقة إزالة الأنسجة وتلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل لتصوير الكلى ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن أن تقدم هذه التقنية وجهات نظر عيانية في أمراض الكلى ، مما يؤدي إلى اكتشافات بيولوجية جديدة.

الملخص

على الرغم من أن علم الأمراض التقليدي قدم العديد من المعلومات حول البنية المجهرية للكلى ، إلا أنه كان من الصعب معرفة التركيب الدقيق للأوعية الدموية ، والأنابيب القريبة ، وقنوات التجميع ، والكبيبات ، والأعصاب الودية في الكلى بسبب نقص المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). المقاصة البصرية هي استراتيجية جيدة للتغلب على هذه العقبة الكبيرة. يمكن تحليل خلايا متعددة في عضو كامل بدقة خلية واحدة من خلال الجمع بين إزالة الأنسجة وتقنية التصوير 3D. ومع ذلك ، لا تزال طرق وضع العلامات الخلوية لتصوير الأعضاء بأكملها متخلفة. على وجه الخصوص ، يمثل تلطيخ الأعضاء بالكامل تحديا بسبب صعوبة اختراق الأجسام المضادة. طور البروتوكول الحالي تلطيخ كلى فأر كامل التركيب للتصوير 3D باستخدام طريقة إزالة الأنسجة CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة دون عائق والتحليل الحسابي). وقد مكن البروتوكول من تصور إزالة التعصيب الكلوي الودي بعد إصابة نقص التروية وتضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري من وجهة نظر شاملة. وبالتالي ، يمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى اكتشافات جديدة في أبحاث الكلى من خلال توفير منظور عياني.

المقدمة

تتكون الكلية من مجموعات خلايا مختلفة. على الرغم من أن علم الأمراض التقليدي يعطينا الكثير من المعلومات حول البيئة المكروية للكلى ، إلا أن هناك حاجة إلى التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) لفهم الحديث المتبادل بين الخلايا بدقة أثناء تطور مرض الكلى. في الماضي ، كان هناك حاجة إلى إجراء عدد كبير من التقسيم التسلسلي وإعادة بناء الصورة لتصوير 3D للجهاز بالكامل1. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تتطلب الكثير من الجهد ولديها مشاكل من حيث التكاثر.

المقاصة البصرية هي استراتيجية جيدة للتغلب على هذه العقبة 2,3. يرجع عتامة الأنسجة بشكل أساسي إلى تشتت الضوء وامتصاصه لأن كل عضو يتكون من مواد مختلفة ، بما في ذلك الماء والبروتين والدهون. وبالتالي ، فإن الاستراتيجية الأساسية لإزالة الأنسجة هي استبدال الماء والدهون في الأنسجة بكواشف مطابقة لمعامل الانكسار (RI) لها نفس الخصائص البصرية مثل البروتينات4. من أجل مراقبة عينة شفافة ، فإن الفحص المجهري الفلوري للورقة الضوئية مفيد5. تضيء صفائح الضوء العينة الشفافة من الجانب ، ويتم الحصول على إشارات الإثارة من خلال العدسة الموضوعية الموجودة في وضع رأسي6. يحصل هذا الفحص المجهري على معلومات المقطع العرضي في عملية مسح واحدة ، والتي تختلف عن الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر أو متعدد الفوتونات. وبالتالي ، يمكنه الحصول بسرعة على صور z-stack بمستوى منخفض من التبييض الضوئي.

تعد كوكتيلات التصوير الواضحة وغير المعوقة للدماغ / الجسم والتحليل الحسابي (CUBIC) إحدى طرق إزالة الأنسجة التي تتيح تصوير الأعضاء بالكامل بواسطة الفحص المجهري الفلوريللصفائح الضوئية 2،7،8. تم تحسين تلطيخ CUBIC و Cycl-mount المناعي بالكامل في الدراسة الحالية لتصور هياكل 3D لكلية الفأر9،10،11. باستخدام طريقة التلوين الكاملة هذه ، يتم تصور التغيير في الأعصاب الودية الكلوية بعد إصابة نقص التروية 9،10 وتضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري11 ، وكذلك الأوعية الدموية والأنابيب القريبة والقنوات المجمعة في الكلى الكاملة9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة طوكيو. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6NJcl ، البالغة من العمر 8 أسابيع ، للدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. إعداد الحيوانات وتثبيت الكلى

  1. قم بإجراء تثبيت التروية باتباع الخطوات أدناه.
    1. تخدير الفأر عن طريق استنشاق إيزوفلوران (3٪، 2.0 لتر/دقيقة) وإعطاء هيدروكلوريد ميديتوميدين داخل الصفاق (0.3 ملغ/كغ)، طرطرات بوتورفانول (5 ملغ/كغ)، وميدازولام (4 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد).
    2. قم بتخلل الحيوان مع 20 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) و 30 مل من 4٪ PFA في الفوسفات العازلة (PB) من خلال البطين الأيسر للقلب12.
  2. قم بإجراء تثبيت الغمر بعد تثبيت التروية وأخذ عينات الكلى9.
    1. اغمر الكلى في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة إضافية ، ثم اغسلها باستخدام PBS لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) 9 (الشكل 1).
      تنبيه: الفورمالديهايد والبارافورمالدهيد مهيجات سامة. تعامل مع الكواشف في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

2. إزالة اللون وإزالة الدهون

  1. تحضير CUBIC-L لإزالة اللون وإزالة الدهون التي تتكون من 10٪ بالوزن من Triton X-100 و 10٪ بالوزن من N-buthyldiethanolamine (انظر جدول المواد) ، بعد التقارير المنشورة سابقا4،8،9.
  2. قم بإجراء إزالة اللون وإزالة الدهون بواسطة CUBIC-L باتباع الخطوات أدناه.
    1. اغمر الكلية الثابتة في 7 مل من 50٪ (v / v) CUBIC-L (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-L) في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل (انظر جدول المواد) مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات (الشكل 2 أ). ثم اغمره في 7 مل من CUBIC-L في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
    2. قم بتحديث CUBIC-L كل يوم خلال هذه العملية. بعد عملية إزالة اللون وإزالة الدهون ، اغسل الكلى باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات)9 (الشكل 1). استخدم ملعقة توزيع لمعالجة العينات (الشكل 2 ب).

3. تلطيخ مناعي كامل

  1. تحضير مخازن تلطيخ.
    1. تحضير المخزن المؤقت للتلطيخ للأجسام المضادة الأولية عن طريق خلط 0.5٪ (v / v) Triton X-100 ، 0.5٪ الكازين في PBS ، و 0.05٪ أزيد الصوديوم9.
    2. قم بإعداد المخزن المؤقت للتلطيخ للأجسام المضادة الثانوية عن طريق خلط 0.5٪ (v / v) Triton X-100 ، و 0.1٪ الكازين في PBS ، و 0.05٪ أزيد الصوديوم9.
  2. أداء تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية.
    1. صبغ الكلى منزوعة الدهون بالأجسام المضادة الأولية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 7 أيام.
      ملاحظة: كمية المخزن المؤقت للتلطيخ اللازم لكلية واحدة هي 500-600 ميكرولتر (الشكل 2C).
    2. اغسل الكلى بنسبة 0.5٪ (v / v) Triton X-100 في PBS (PBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد9 (الشكل 1).
  3. أداء تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية.
    1. صبغ الكلى المناعي بالأجسام المضادة الثانوية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في مخزن تلطيخ عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 7 أيام. اغسل الكلى باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد9 (الشكل 1).
    2. بعد التثبيت9 ، اغمر الكلى في 1٪ فورمالديهايد في PB (خليط 1:36 من 37٪ فورمالديهايد و PB) لمدة 3 ساعات ، واغسله باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات (الشكل 1).

4. مطابقة معامل الانكسار (RI)

  1. تحضير CUBIC-R +.
    1. تحضير CUBIC-R عن طريق خلط 45٪ بالوزن من 2،3-ثنائي ميثيل-1-فينيل-5-بيرازولون / أنتيبيرين و 30٪ بالوزن من نيكوتيناميد (انظر جدول المواد).
    2. قم بإعداد CUBIC-R + لمطابقة معامل الانكسار (RI) بإضافة 0.5٪ من N-buthyldiethanolamine إلى CUBIC-R بعد التقارير المنشورة سابقا4،8،9.
  2. قم بإجراء مطابقة RI.
    1. اغمر الكلى في 7 مل من 50٪ (v / v) CUBIC-R + (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-R +) في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد. بعد ذلك ، اغمرها في 7 مل من CUBIC-R + في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين9 (الشكل 1).
      ملاحظة: على الرغم من أن الكلى تطفو في 50٪ CUBIC-R + في بداية مطابقة RI ، إلا أنها تغرق وتصبح شفافة في CUBIC-R + في نهاية العملية (الشكل 2D).

5. الحصول على الصور وإعادة الإعمار

  1. اغمر الكلى المتطابقة مع RI في خليط من زيت السيليكون (RI = 1.555) والزيت المعدني (RI = 1.467) (55:45) أثناء الحصول على الصورة (RI = 1.51) 5 (الشكل 3).
  2. الحصول على صور 3D من الكلى بأكملها مع المجهر الفلورسنت9 ورقة ضوء مصممة خصيصا (انظر جدول المواد). اجمع كل بيانات الصور الأولية بتنسيق TIFF 16 بت. تصور والتقاط الصور المقدمة 3D مع برنامج تحليل التصوير (Imaris ، انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام طريقة التلوين هذه ، تم تصور الأعصاب الودية [الجسم المضاد لهيدروكسيلاز التيروزين (TH)] والشرايين [الجسم المضاد للأكتين العضلي α الملساء (αSMA)] في كلية كاملة (الشكل 4 أ ، ب والفيديو 1)9. كما تم تصوير الأعصاب الكلوية الودية غير الطبيعية بعد إصابة نقص التروية / التروية (IRI)9،10 (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، تم تحقيق تصور الأعصاب المتعاطفة في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

سمح البروتوكول الحالي بتصوير 3D للكلى بالكامل لهياكل مختلفة مثل الأعصاب الودية ، وجمع القنوات ، والشرايين ، والأنابيب القريبة ، والكبيبات9،10،11. قدمت طريقة التلوين هذه ملاحظة عيانية وأدت إلى اكتشافات بيولوجية جديدة ، من خلال تصور التغيير في الأعصاب الودية الكلوية بعد إصابة نقص التروية 9,10 وتضخم الكبيبات في المرحلة الأولى من مرض الكلى السكري 11.<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تنفيذ جزء من هذا العمل من خلال التعاون مع البروفيسور هيروكي ر. أويدا (جامعة طوكيو) ، والبروفيسور إيتسو أ. سوساكي (جامعة جونتيندو) ، والبروفيسور تيتسوهيرو تاناكا (جامعة توهوكو) ، والبروفيسور ماسافومي فوكاغاوا ، والدكتور تاكيهيكو وادا ، والدكتور هيروتاكا كومابا (جامعة توكاي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
14 مل جولة القاع عالية الوضوح PP أنبوب اختبارفالكون352059تنظيف الأنسجة ، تلطيخ ، غسل
2،3-ثنائي ميثيل -1-فينيل -5-بيرازولون / مضاد للبيرينطوكيو الصناعة الكيميائيةD1876CUBIC-R +
37٪ - محلول الفورمالديهايدNacalai Tesque16223-55بعد التثبيت
4٪ - محلول عازلة الفوسفات بارافورمالديهايدNacalai Tesque09154-85تثبيت الكلى
Alexa Flour 555 الحمار المترافق المضاد للأغنام الجسم المضاد IgGInvitrogenA-21436الجسم المضاد الثانوي (1: 100)
Alexa Flour 647 الحمار المترافق المضاد للأرانب الجسم المضاد IgGInvitrogenA-31573الجسم المضاد الثانوي (1: 200)
الجسم المضاد المضاد للأكوابورين 2 (AQP2)Abcamab199975الجسم المضاد الأساسي (1: 100)
الجسم المضاد المضاد للبودوسينسيجما ألدريتشP0372الجسم المضاد الأولي (1: 100) الناقل
المشترك للجلوكوز المضاد للصوديوم 2 (SGLT2) الجسم المضادAbcamab85626الجسم المضاد الأساسي (1: 100) الجسم المضاد
لهيدروكسيلاز التيروزين (TH)Abcamab113الجسم المضاد الأساسي (1: 100)
الجسم المضاد المضاد للعضلات الملساء الأكتين (ألفا ؛ -SMA)Abcamab5694المضاد الأساسي (1: 200)
مانع الكازين في PBSThermo Fisher Scientific37528تلطيخ العازلة
بوتورفانول طرطراتميجي005526التخدير
C57BL / 6NJclNippon Bio-Supp.CenterN / Aسلالة الفأر
ImarisBitplaneN / Aبرنامج تحليل التصوير
مجهر التكبير الكبيرOLYMPUSMVX10وحدة المراقبة من المجهر المصمم خصيصا
Medetomidine HydrochlorideKyoritsu-Seiyaku008656التخدير
MidazolamSANDOZ27803229التخدير
زيت معدنيSigma-AldrichM8410الغمر
N-buthyldiethanolamineطوكيو الصناعة الكيميائيةB0725CUBIC-L ، CUBIC-R +
نيكوتيناميدطوكيو الصناعة الكيميائيةN0078CUBIC-R +
البولي إيثيلين جلايكول أحادي p-isooctylphenyl الأثير / Triton X-100Nacalai Tesque12967-45CUBIC-L ، PBST
زيت السيليكون HIVAC-F4Shin-Etsu زيت الغمر الكيميائي50449832
الصوديومأزيد واكو195-11092عازلة تلطيخ
الجسم المضاد الجسم زيت

المراجع

  1. Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  4. Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
  5. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  6. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  7. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  8. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  9. Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
  10. Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
  11. Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
  12. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  13. Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
  14. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  15. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
  17. Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CUBIC

مقالات ذات صلة