مقالة منهجية

الزرع المجهري للأغشية المشبكية لإعادة تنشيط المستقبلات المشبكية البشرية للدراسات الوظيفية

DOI:

10.3791/64024

⸱

يوليو 20, 2022

 ,  ,  , 
1The Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, Department of Neurology, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول أنه من خلال إجراء الزرع المجهري للأغشية المشبكية في بويضات Xenopus laevis ، من الممكن تسجيل استجابات متسقة وموثوقة α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid ومستقبلات حمض γ-aminobutyric.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المستقبلات الأيونية المثيرة والمثبطة هي البوابات الرئيسية للتدفقات الأيونية التي تحدد نشاط نقاط الاشتباك العصبي أثناء التواصل العصبي الفسيولوجي. لذلك ، لوحظت تغيرات في وفرتها ووظيفتها وعلاقاتها مع العناصر المشبكية الأخرى كارتباط رئيسي للتغيرات في وظائف الدماغ والضعف المعرفي في الأمراض العصبية التنكسية والاضطرابات العقلية. إن فهم كيفية تغيير وظيفة المستقبلات المشبكية المثيرة والمثبطة بسبب المرض له أهمية حاسمة لتطوير علاجات فعالة. للحصول على معلومات ذات صلة بالمرض ، من المهم تسجيل النشاط الكهربائي لمستقبلات الناقل العصبي التي تظل تعمل في الدماغ البشري المريض. حتى الآن هذا هو النهج الأقرب لتقييم التغيرات المرضية في وظيفة المستقبلات. في هذا العمل ، يتم تقديم منهجية لإجراء الزرع المجهري للأغشية المشبكية ، والتي تتكون من إعادة تنشيط الأغشية المشبكية من أنسجة المخ البشرية المجمدة المفاجئة التي تحتوي على مستقبلات بشرية ، عن طريق حقنها ودمجها الخلفي في غشاء بويضات Xenopus laevis . ويوفر البروتوكول أيضا الاستراتيجية المنهجية للحصول على استجابات متسقة وموثوقة لمستقبلات α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) ومستقبلات حمض γ-aminobutyric (GABA)، فضلا عن طرق مفصلة جديدة تستخدم للتطبيع والتحليل الدقيق للبيانات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤثر الاضطرابات العصبية التنكسية على نسبة كبيرة من السكان. على الرغم من أن عواقبها المدمرة معروفة جيدا ، إلا أن العلاقة بين التغيرات الوظيفية لمستقبلات الناقل العصبي ، والتي تعتبر حاسمة لوظائف الدماغ ، وأعراضها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. التباين بين الأفراد ، والطبيعة المزمنة للمرض ، وظهور الأعراض الخبيثة ليست سوى بعض الأسباب التي أخرت فهم العديد من اضطرابات الدماغ حيث يتم توثيق الاختلالات الكيميائية بشكل جيد 1,2. وقد ولدت النماذج الحيوانية معلومات لا تقدر بثمن ووسعت معرفتنا حول الآليات الكامنة وراء علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية في النظم التطورية المحفوظة. ومع ذلك ، فإن العديد من الاختلافات بين الأنواع بين القوارض والبشر تمنع الاستقراء المباشر لوظيفة المستقبلات من النماذج الحيوانية إلى الدماغ البشري3. وهكذا ، تم تطوير الجهود الأولية لدراسة المستقبلات البشرية الأصلية من قبل مختبر ريكاردو ميليدي باستخدام الأنسجة التي تمت إزالتها جراحيا والعينات المجمدة. استخدمت هذه التجارب الأولية أغشية كاملة تشمل مستقبلات مشبكية عصبية ومستقبلات مشبكية إضافية بالإضافة إلى مستقبلات ناقل عصبي غير عصبي ، وعلى الرغم من أنها توفر معلومات مهمة حول الحالات المريضة ، إلا أن هناك قلقا من أن مزيج المستقبلات يعقد تفسير البيانات4،5،6،7. الأهم من ذلك ، نقاط الاشتباك العصبي هي الهدف الرئيسي في العديد من الاضطرابات العصبية التنكسية 8,9; لذلك ، تعد المقايسات لاختبار الخصائص الوظيفية للمشابك العصبية المصابة أساسية للحصول على معلومات حول التغيرات ذات الصلة بالمرض التي تؤثر على التواصل المشبكي. هنا ، يتم وصف تعديل الطريقة الأصلية: الزرع المجهري للأغشية المشبكية (MSM) ، والذي يركز على التوصيف الفسيولوجي لمستحضرات البروتين المشبكي المخصب وتم تطبيقه بنجاح لدراسة المشابك العصبية للفئران والبشر 10،11،12،13،14،15 . باستخدام هذه المنهجية ، من الممكن زرع مستقبلات متشابكة كانت تعمل ذات يوم في الدماغ البشري ، مدمجة في الدهون الأصلية الخاصة بها ومع مجموعتها الخاصة من البروتينات المرتبطة بها. علاوة على ذلك ، نظرا لأن بيانات MSM كمية ، فمن الممكن استخدام هذه البيانات للتكامل مع مجموعات بيانات البروتينية أو التسلسل الكبيرة10.

من المهم ملاحظة أن العديد من التحليلات الدوائية والفيزيائية الحيوية للمستقبلات المشبكية تتم على البروتينات المؤتلفة16,17. في حين أن هذا النهج يوفر رؤية أفضل للعلاقات بين البنية والوظيفة للمستقبلات ، إلا أنه لا يمكنه توفير معلومات حول مجمعات المستقبلات المعقدة متعددة المراوغات الموجودة في الخلايا العصبية وتغيراتها في المرض. لذلك ، يجب أن يوفر مزيج من البروتينات الأصلية والمؤتلفة تحليلا أكثر شمولا للمستقبلات المتشابكة.

هناك العديد من الطرق لإعداد المشابك العصبية10،11،12،13،14،15 والتي يمكن تعديلها لمتطلبات المختبر. يبدأ البروتوكول بافتراض أن المستحضرات المخصب المشبك العصبي قد تم عزلها وجاهزة للمعالجة لتجارب الزرع المجهري. في المختبر، يتم استخدام طريقة Syn-Per باتباع إرشادات الشركة المصنعة. يتم ذلك بسبب القابلية العالية للتكرار في التجارب الكهروفسيولوجية10,11. هناك أيضا أدبيات وفيرة تشرح كيفية عزل بويضات Xenopus 18,19 ، والتي يمكن شراؤها أيضا جاهزة للحقن20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء جميع الأبحاث وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والمعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة كاليفورنيا إيرفين (IACUC-1998-1388) والفرع الطبي لجامعة تكساس (IACUC-1803024). تم توفير القشرة الصدغية من دماغ غير مرض الزهايمر (AD) (أنثى ، 74 عاما ، فاصل ما بعد الوفاة 2.8 ساعة) ودماغ AD (أنثى ، 74 عاما ، فاصل ما بعد الوفاة 4.5 ساعة) من قبل مركز أبحاث مرض الزهايمر بجامعة كاليفورنيا إيرفين (UCI-ADRC). تم الحصول على الموافقة المستنيرة للتبرع بالدماغ من قبل UCI-ADRC.

ملاحظة: يجب التعامل مع أنسجة المخ البشرية غير الثابتة كمصدر لمسببات الأمراض المنقولة بالدم (BBP). وفقا لذلك ، هناك حاجة إلى تدريب BBP قبل بدء التجارب. يتم تنفيذ هذا البروتوكول في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL2) بموجب متطلبات BSL2. تشمل الإرشادات والاحتياطات داخل المختبر ما يلي: لا يسمح بدخول أي طعام أو مشروب في المختبر، ويجب اتباع الممارسات المختبرية الجيدة، ويلزم توفير معدات الحماية الشخصية (القفازات، والعباءات، وعدم وجود أحذية مفتوحة الأصابع)، ويجب إغلاق الباب في جميع الأوقات.

1. إعداد الحقن المجهري لبويضة زينوبوس

  1. لصنع إبر الحقن ، اسحب أنابيب البورسليكات مقاس 3.5 بوصة باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. بمجرد سحب إبر الحقن المجهري ، استخدم المجهر وشفرة الحلاقة لقطع ما يكفي من طرف الإبرة بحيث يمكن إجراء الحقن المجهري (عادة بين 2-3 مم).
    ملاحظة: يمكن أن يختلف طول طرف الإبرة المراد قطعها.
  2. قم بإعداد محلول 1x Barth عن طريق إضافة 200 مل من محلول مخزون Barth (5x) إلى 800 مل من الماء المقطر. املأ لوحة زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح ذات 24 بئرا بمحلول 18 درجة مئوية 1x Barth.
    1. قم بإعداد حل مخزون 5x Barth على النحو التالي. في 1 لتر من الماء المقطر ، أضف 25.71 جم من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، 0.372 جم من KCl (كلوريد البوتاسيوم) ، 0.301 جم من CaCl 2 (ثنائي كلوريد الكالسيوم) ، 0.389 جم من Ca(NO 3) 2 (4H 2 O) (رباعي هيدرات نترات الكالسيوم) ، 1.01 جم من MgSO4 (7H 2 O) (هيبتاهيدرات كبريتات المغنيسيوم) ، 1.008 جم من NaHCO3 (بيكربونات الصوديوم) ، و 11.91 غرام HEPES (4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض).
  3. عزل بويضات Xenopus باستخدام البروتوكولات الموضحة في18,19 واستخدام 2x مجسمة مكبرة ، واختيار بويضات صحية المظهر ، المرحلة V-VI. ضع حوالي 10 بويضات لكل بئر واستخدم أحد الآبار لإيواء البويضات غير المحقونة لاستخدامها كخلايا تحكم عند إجراء التسجيلات.
  4. استرجع طبق بتري صغير، طوله 1 سم وقطره 6 سم، وضع شبكة نايلون بداخله بحيث تغطي الجزء السفلي من الطبق. ثم ، صب 15 مل من محلول 1x Barth لاستخدامه في إجراء الحقن المجهري للبويضات.
  5. ضع حاقن نانوي على طول خط الوسط لمنصة المجهر. أدر المغناطيس إلى وضع إيقاف التشغيل وحرك الحاقن النانوي ببطء إلى الموضع المطلوب مع دعمه بعناية. عندما يتم وضع الحاقن النانوي بشكل صحيح ، أدر المغناطيس مرة أخرى إلى وضع التشغيل الكامل وتأكد من أنه آمن.
  6. بالنسبة لحجم عينة يبلغ 50.6 نانولتر، استخدم الإعدادات التالية على جانب الحاقن النانوي: 1 هو D (لأسفل)، 2 هو D، 3 هو U (أعلى)، 4 هو D، و 5 هو U. ضع قطعة من البلاستيك الحراري ذاتي الختم، أو غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق، على حامل المجهر، محاذاة مع مسار الحاقن النانوي.
    ملاحظة: 50 نانولتر بالقرب من الحد الأقصى لكمية المواد المحقونة التي يمكن للسيتوبلازم تحملها21.
  7. املأ حقنة الأنسولين حوالي نصف حجمها بالزيوت المعدنية (حوالي 0.5 مل / سم مكعب). باستخدام هذه المحقنة ، املأ إبرة الحقن المجهري بالزيوت المعدنية. تأكد من رؤية حبة زيت مرئية عند طرف الإبرة.
  8. تعريض مكبس الحاقن النانوي إلى ما لا يقل عن 1-2 سم. قم بذلك عن طريق الضغط باستمرار على الزر EMPTY حتى يصبح المكبس مرئيا بالطول المطلوب. بمجرد تعرض المكبس ، ضع ببطء وبعناية إبرة زجاج الحقن المجهري المملوءة بالزيوت المعدنية على مكبس الحاقن النانوي ، وتأكد من أنها تتناسب بشكل جيد مع حلقة O المقاومة السوداء وتتوقف عند حلقة المقاومة البيضاء. تأكد من عدم ثني مكبس حاقن النانو في هذه العملية.
  9. بمجرد أن تصبح إبرة زجاج الحقن المجهري آمنة وفي مكانها ، اضغط على EMPTY لإفراغ أي فقاعات هواء محتملة. بلطف ، مع منديل ورقي ، قم بتنظيف الزيت المعدني الزائد.

2. تحميل العينة

  1. تحضير المستحضرات المخصبة بالمشابك (العينات) من منطقة الدماغ البشري ذات الأهمية كما هو موضح في 10،11،12،13،14،15 ، وتخزينها في أليكوتات من حوالي 5 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية حتى لحظة الحقن.
  2. قبل الحقن ، انقل aliquot إلى الثلج الرطب واحتفظ به على الجليد في جميع الأوقات باستثناء الصوتنة والاسترجاع. سيتم تحديد عدد وأنواع العينات من خلال التصميم التجريبي.
  3. سونيك العينات المختارة 3x في حمام مع الجليد الرطب العائم لتجنب تسخين العينة. استخدم دورات 5 ثانية في كل مرة ، وانتظر 1 دقيقة على الثلج الرطب بين الدورات.
  4. ضع 1 ميكرولتر من العينة على اللدائن الحرارية. قم بعمل كثافة في السطح ، إذا لزم الأمر ، قبل وضع العينة لمنع حركة العينة.
  5. استخدم مقابض المتلاعب الذي يمسك الحاقن النانوي لوضع الإبرة وتحريكها نحو العينة المراد ملؤها. بمجرد أن يكون طرف الإبرة في العينة، اضغط مع الاستمرار على زر التعبئة حتى يتم أخذ عينة كافية. مطلوب حوالي 0.5 ميكرولتر ل 10 بويضات. باستخدام المقابض ، حرك إبرة حاقن النانو مرة أخرى إلى أعلى موضع.

3. حقن البويضات

ملاحظة: يتم أيضا حقن الأغشية المشبكية الموحدة لقشرة الفئران في جميع التجارب في مجموعة من البويضات لقياس التغيرات في قدرة الاندماج بين دفعات مختلفة من البويضات.

  1. ضع البويضات المختارة على طبق بتري الصغير الذي يحتوي على شبكة النايلون المجهزة ومحلول بارث (حوالي 10 بويضات). ترتيب البويضات بحيث لا تكون فوق بعضها البعض ؛ سيكون هذا مفيدا أثناء عملية الحقن.
  2. باستخدام المقابض الموجودة على المناور الذي يحمل الحاقن النانوي ، حرك الإبرة نحو البويضات. بمجرد غمر الإبرة في محلول بارث ، استخدم دواسة القدم للحاقن النانوي للتأكد من أن إبرة الحقن المجهري تطلق العينة. إذا تم إطلاق العينة ، فستكون مرئية من عرض المجهر.
  3. بمجرد أن يثبت بثقة أن العينة يتم إطلاقها ، انتقل إلى الحقن الدقيق للبويضة. إذا لم يتم إطلاق العينة ، كرر عملية ملء الإبرة.
  4. اخترق البويضة أسفل السطح مباشرة بالإبرة ، وليس أعمق ، واستخدم دواسة القدم لحقن العينة. ستصدر دواسة القدم صوتا صفارة عند إطلاق العينة. انتظر حوالي 2-3 ثانية. إذا كان الحقن ناجحا ، فسوف تتوسع الخلية. بمجرد حدوث ذلك ، استخدم المقابض الموجودة على المتلاعب للخروج من الخلية.
    ملاحظة: اندماج الأغشية في البويضة هو عملية مستقطبة. لذلك ، يجب حقن البويضة في الجانب الحيواني من الخلية ، ويفضل أن يكون ذلك فوق خط الاستواء ، مع زاوية الإبرة نحو الجانب الحيواني لتحقيق أقصى قدر من الانصهار الغشائي.
  5. حرك طبق بتري بحيث يتم محاذاة البويضة التالية مع الإبرة وكرر العملية حتى يتم حقن جميع البويضات في الطبق. كرر هذه العملية حتى يتم حقن العدد المطلوب من البويضات. تأكد من ترك بئر واحد من البويضات دون حقن لاستخدامها كعنصر تحكم.
  6. بمجرد حقن جميع البويضات ، اسحب الحاقن النانوي إلى موضعه الأصلي وأزل الإبرة.

4. تسجيل التيارات الأيونية باستخدام مشبك جهد قطبين كهربائيين

  1. لصنع اثنين من إبر قطب الجهد الكهربائي (TEVC) ، اسحب أنابيب زجاجية من البورسليكات المصقولة بالنار بطول 15 سم باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة. بمجرد اكتمال السحب ، املأ 3M KCl باستخدام إبر شعرية طويلة ، أو بدلا من ذلك ، قم بغمر الإبر وغليها في محلول 3 M KCl لمدة 15 دقيقة تحت فراغ مستمر. تساعد درجة الحرارة العالية في ملء الأقطاب الكهربائية وإزالة فقاعات الهواء.
    1. قم بإعداد محلول تعبئة قطب كهربائي 3M KCl باستخدام KCl في الشكل البلوري والماء منزوع الأيونات ، واتبع هذه الخطوات بعناية حتى لا يتم تغيير الجهد المرجعي للأقطاب الكهربائية. جفف KCl بعناية في فرن لمدة 2-3 ساعات. باستخدام ميزان تحليلي ، يزن بعناية 223.68 جم من KCl. انقل KCl إلى زجاجة زجاجية سعة 1 لتر. استخدم هذا المحلول لكلورة أسلاك القطب الفضي.
      ملاحظة: لسحب الأقطاب الكهربائية الزجاجية ، يمكن تنزيل كتاب طبخ الماصة هنا: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf.
  2. قم بتشغيل جميع المعدات المستخدمة لتسجيل التيارات الأيونية: الأنظمة الرئيسية ، صمامات الحل ، ضوء المجهر ، أنظمة الصمامات ، مشبك البويضة ، ونظام التفريغ. قم بتشغيل كمبيوتر سطح المكتب ، وقم بتسجيل الدخول إلى WinEDR V3.9.1. ، وتأكد من تشغيل البرنامج وأن قيم الإعداد صحيحة كما يلي: التسجيل على القرص ، وتعيين مدة التسجيل ، ومسح خيار المحاكاة.
    1. قم بتوفير قيم الإعداد الأولية التالية لمكبر الصوت: بالنسبة لقسم قطب الجهد الكهربائي (Vm) ، قم بإيقاف تشغيل تعويض السعة السالبة (-C) ؛ بالنسبة لقسم أقطاب الاستحمام (Im)، اضبط مفتاح محدد الكسب (النطاق من 0.1 إلى 10) على 10، ومفتاح التبديل ثلاثي المواضع الذي يحدد مضاعف الكسب (x0.1 وx1.0 وx10)، عند x1.0. ستشير مصابيح LED إلى اختيار مضاعف الكسب ؛ بالنسبة لقسم المشبك ، قم بإيقاف تشغيل محدد وضع المشبك ، واضبط التحكم في كسب التيار المستمر على IN، والتحكم في التحكم في الحلقة المفتوحة لعرض النطاق الترددي الكامل (النطاق من 0 إلى 2000) إلى حوالي 1200 ؛ بالنسبة للأوامر ، قم بتعيينها على 40mV واضبط عناصر التحكم في الاحتفاظ بمضاعف سالب ومقياس لتكون في x2 ؛ بالنسبة للقطب الكهربائي الحالي ، استخدم إزاحة Ve لإنشاء مرجع صفري قبل اختراق البويضة.
    2. للتسجيل، افتح برنامج WinEDR V3.9.1، وانتقل إلى القائمة العلوية، وحدد ملف > فتح ملف جديد. قم بإنشاء المجلد الخاص بك واحفظ الملف.
    3. بعد ذلك ، في القائمة الرئيسية ، حدد تسجيل > سجل على القرص. عندما يكون القطبان داخل الأوكتيت، قم بتشغيل الرنين في وحدة تحكم صمام VC-8، وقم بتشغيل المشبك إلى بطيء في مكبر الصوت OC-725C. ثم ارجع إلى برنامج WinEDR وحدد تسجيل في أعلى يسار الشاشة.
    4. في مخطط العلامات في أسفل اليمين، اكتب إمكانات الغشاء الأولية واضغط على مفتاح الإدخال Enter. مع استمرار التجربة ، يمكنك كتابة اسم الأدوية المستخدمة. بمجرد انتهاء التجربة، حدد إيقاف في أعلى يمين الشاشة.
      ملاحظة: نحن نستخدم برنامج WinEDR أو WinWCP لأداء TEVC لأن هذه البرامج مجانية ومناسبة تماما للتجارب ، ولكن يمكن استخدام أي برامج أخرى متاحة.
  3. قم بتكوين جميع الحلول الدوائية اللازمة لإجراء التجربة (على سبيل المثال ، GABA ، Kainate) وتأكد من أن صمامات المحلول تعمل بشكل صحيح عن طريق تشغيلها وإيقاف تشغيلها ومراقبة إزاحة صمامات القرصة.
  4. املأ الأنابيب عن طريق صب المحلول المقابل على وعاء المحقنة المتصل بالأنبوب وقم بتسمية وحدة التحكم في الصمام لربطها بأنابيب المحلول. تأكد من أن تدفق المحلول ثابت ، ولا توجد فقاعات وأن نظام التفريغ يعمل بشكل صحيح.
  5. قم بإعداد المجهر ومنطقة غرفة التسجيل. ضع جسور الأجار (انظر أدناه) في الثقوب الدائرية المعنية خلف غرفة التسجيل (بعيدة عن منطقة المناولة) ، وربط الآبار بالأقطاب الكهربائية المستخدمة كمرجع أرضي وغرفة التسجيل. أضف حل عمل Ringer (1x) إلى غرفة التسجيل وآبار القطب المرجعي الأرضي.
    1. جسور Agar عبارة عن أنابيب بورسليكات على شكل حرف U ، بطول 2-3 سم ، مليئة ب 3٪ من الأجار في محلول Ringer. اصنع أنابيب على شكل حرف U عن طريق قطع أنابيب طولها 15 سم ، وثنيها على اللهب المكشوف ، ثم ملئها بأجار ساخن بنسبة 3٪ باستخدام حقنة الأنسولين. قم بتخزين جسور الأجار المملوءة في محلول رينجر في الثلاجة حتى الاستخدام.
    2. اصنع محلول مخزون 20x Ringer على النحو التالي: في 1 لتر من الماء المقطر ، أضف 134.4 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2.982 جم من KCl ، و 5.29 جم من CaCl 2 ، و 23.83 جم من HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid). للحصول على حل عمل 1x Ringer ، في قارورة حجمية ، أضف 200 مل من محلول مخزون Ringer (20x) إلى 3800 مل من الماء المقطر.
  6. قم بإعداد أقطاب الفضة المكلورة قبل كل تجربة عن طريق التحليل الكهربائي عن طريق وضع أسلاك فضية في محلول 3 M KCl وتوصيل القطب الفضي بالطرف الموجب لبطارية 9 فولت. بعد حوالي 3 دقائق يتم ترسيب طبقة بنية صلبة من AgCl في القطب الكهربائي. ضع أسلاك القطب الكهربائي الفضي المكلور في غلاف القطب الكهربائي.
    ملاحظة: الأقطاب الكهربائية المرجعية الأرضية وتسجيل المكلورة هي أقطاب كلوريد الفضة / الفضة (Ag / AgCl).
  7. إزالة إبر البورسليكات من محلول KCl. استخدم حقنة لاستخراج كمية صغيرة من محلول KCl من الطرف المفتوح لإبرة القطب الكهربائي واستبدل محلول KCl بالزيوت المعدنية ؛ هذا سوف يتجنب تبخر الماء والتغيرات في تركيز KCl داخل الإبرة. حرك الإبرة الزجاجية فوق سلك القطب الفضي المكلور وشدها في مكانها.
  8. باستخدام المتلاعبين اليمنى واليسرى التي تحمل الأقطاب الكهربائية ، قم بتوجيه إبر القطب الكهربائي إلى غرفة التسجيل المليئة بمحلول Ringer.
  9. تحقق من مقاومة كل قطب كهربائي عن طريق تصفير مقابض إزاحة Vm و Ve ثم الضغط على أزرار اختبار القطب الكهربائي . يجب أن تكون المقاومة بين 0.5-3 MΩ (تقرأ مباشرة على أنها 5-30 mV في الشاشة). إذا كانت المقاومة خارج النطاق ، فاستبدل باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة جديدة.
  10. املأ غرفة التسجيل بمحلول Ringer الجديد. باستخدام ماصة زجاجية ، ضع بويضة غير محقونة أو مزروعة في وسط غرفة التسجيل. تأكد من أن البويضة مرئية بوضوح تحت المجهر ، مع وجود جانب الحيوان لأعلى (انظر الملاحظة في الخطوة 3.4).
  11. قم بتوجيه القطب الكهربائي إلى محلول Ringer حتى يلمس غشاء البويضة. اخترق الغشاء البويضي بلطف في الجانب الحيواني (انظر NOTE في الخطوة 3.4) باستخدام كل من الأقطاب الكهربائية وسجل إمكانات الغشاء المريح. قم بتشغيل تدفق حلول Ringer.
  12. باستخدام مضخم مشبك البويضة ، قم بتغيير الوضع إلى Voltage Clamp واضبط الجهد القابض على -80 mV. يجب أن يكون التيار الموجود على الشاشة سلبيا ، وعادة ما يتراوح بين 0 و 0.4 ميكروأمبير.
  13. قم بإنشاء ملف جديد لحفظ التسجيل كملف > > جديد حفظ التسجيل على البرنامج. ابدأ التسجيل، واضغط على تسجيل > تسجيل على القرص. أضف المعلومات ذات الصلة إلى الملف باستخدام مربع حوار مربع العلامة (اسم الاختبار ، الأدوية المستخدمة ، إلخ).
  14. قم بتطبيق المنبهات (على سبيل المثال ، GABA أو الغلوتامات أو الكاينات) للتحفيز الكيميائي عن طريق فتح الصمامات ودمجها في غرفة التسجيل لمدة 15 ثانية. عادة ، استخدم مكاسب قدرها 10x لرسم الحد الأقصى لعدد النقاط وإعادة بناء الاستجابة. إذا كانت التيارات صغيرة جدا ، فقم بزيادة التضخيم ، أو الكسب ، من أجل تقييمها ورؤيتها. لاحظ دائما هذه التغييرات.
    ملاحظة: تعتمد مدة التروية على النموذج التجريبي. إذا كان الهدف الرئيسي هو قياس السعة القصوى ، فسيكون 15 ثانية كافيا للوصول إلى ذروة GABA أو هضبة kainate.
  15. راقب دائما مستويات الحلول. سيحتاج حل Ringer إلى إعادة تعبئته بشكل متكرر حيث يتم استخدامه بين جميع استخدامات الحل. بمجرد اكتمال التسجيل ، قم بتشغيل مشبك الجهد إلى وضع OFF وقم بإيقاف تشغيل صمام حل Ringer. إزالة البويضة. أوقف التسجيل واحفظ الملف. كرر هذه الخطوات لجميع البويضات المحقونة.

5. تحليل تسجيلات TEVC

  1. احفظ نسخة من التسجيلات على محرك أقراص USB. من هناك ، افتح الملف المطلوب لتحليله. في الملف الذي يفتح، يمكن عرض التسجيل ووضع علامة عليه وقياسه. يتضمن التحليل الأكثر شيوعا قياس الحد الأقصى للسعة ووقت التنشيط وإزالة الحساسية وانهيار التطبيقات المتكررة.
  2. قم بقياس استجابة AMPA القصوى واستجابة ذروة GABA. للحصول على هذه القياسات، قم أولا بإنشاء مستوى صفر أو خط أساس عن طريق إيجاد الخط الأحمر مع المؤشر وسحبه إلى التيار الناتج عن تطبيق Ringer أو خط الأساس.
  3. بمجرد تحديد مستوى الصفر، حدد قياسات الاستجابة باستخدام الماوس لسحب مؤشر القراءة العمودي الأخضر إلى الجزء المطلوب من مقتفي الرسم البياني. إذا رغبت في ذلك ، قم بتصدير الآثار ليتم تحليلها في أي برنامج مفضل آخر
    ملاحظة: إذا تعذر تعريف المستوى الصفري أو كان هناك الكثير من الضوضاء المشار إليها على المقتفي، فقم بتصدير ملف WinEDR إلى برنامج تحليلي غير متصل بالإنترنت، مما سيسمح بإجراء تعديلات لتوفير خط أساس للمستوى وإضافة عوامل تصفية لتقليل الضوضاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في غضون ساعات قليلة بعد الحقن ، تبدأ الأغشية المشبكية ، التي تحمل مستقبلات الناقل العصبي والقنوات الأيونية ، في الاندماج مع غشاء البلازما البويضة. يوضح الشكل 1 تسجيلات مستقبلات AMPA و GABAA المزروعة في بويضات Xenopus. بالنسبة لمعظم التحليل، تم قياس الاستجابات من اثنين أو ثلاثة بويضات لكل عينة، باستخدام دفعتين أو ثلاث دفعات من البويضات من ضفادع مختلفة، ليصبح المجموع من ست إلى تسع بويضات لكل عينة. يتم ذلك لمجموعة كبيرة من الأشخاص البشريين لمراقبة الاختلافات الجماعية. التحلي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك حاجة إلى تحليل مجمعات البروتين الأصلية من أدمغة البشر لفهم العمليات التماثلية والمرضية في اضطرابات الدماغ وتطوير استراتيجيات علاجية للوقاية من الأمراض أو علاجها. وبالتالي ، فإن بنوك الدماغ التي تحتوي على عينات مجمدة مفاجئة هي مصدر لا يقدر بثمن لثروة كبيرة وغير مستغلة في الغالب من المعلومات الفسيولوجية29,30. أحد الشواغل الأولية لاستخدام أنسجة ما بعد الوفاة هو الاحتمال الواضح لتدهور الحمض النووي الريبوزي المرسال أو البروتين الذي قد يربك تفسير البيانات. على سبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح NIA / NIH R01AG070255 و R01AG073133 إلى AL. كما نشكر مركز أبحاث مرض الزهايمر بجامعة كاليفورنيا إيرفين (UCI-ADRC) على توفير الأنسجة البشرية الموضحة في هذه المخطوطة. يتم تمويل UCI-ADRC من خلال منحة NIH / NIA P30 AG066519.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> للحقن المجهري< / قوي>
3.5" الشعيرات الدموية الزجاجيةDrummond3-000-203-G / X
24 جيدا ، لوحة ثقافة الأنسجة ذات القاعالمسطح ThermofisherFB012929
مشتعل / بني مجتذب ماصة دقيقةSutterP-1000
طبق حقنThermofisher08-772B
أنابيب الطرد المركزيThermofisher02-682-002
الزيوت المعدنيةThermofisherO121-1
Nanoject IIDrummond3-000-204
شبكة نايلونالمعاوضة الصناعيةWN0800
ParafilmThermofisherS37440
StereoscopeFisher Scientific03-000-037
حقنةثيرموفيشر14-841-31
حمام تنظيف بالموجات فوق الصوتيةثيرموفيشرFS20D
Xenopus laevis الضفادعXenopus 14217
لمشبك جهد كهربائي < / قوي >
15 سم طويل طويل مصقول النار البورسليكات الشعيرات الدمويةالزجاجية SutterB200-116-15
أي كمبيوتر شخصي أو كمبيوتر محمول
تمرير منخفض بيسيل فلتروارنر إنسترومنتسLPF-8
ستيريسكوبفيشر ساينتفيك03-000-037
محطة عمل مشبك جهداثنين من وارنر إنسترومنتزTEV-700
ValveLink 8.2 وحدة تحكم الترويةأتمتة ScientificSKU:01-18
WInEDR البرمجيات الحرةجامعة ستراثكلايد غلاسكوhttps://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm
X سلسلة متعددة الوظائف DAQالوطنية للأدواتNI USB-6341
<قوية > الكواشف < / قوي >
ثاني كلوريد الكالسيومثيرموفيشرC79
الكالسيوم نترات رابع هيدراتثيرموفيشرC109
كولاجينازسيجما-ألدريتشC0130
GABAسيجما-ألدريتشA2129
HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض الحراري:BP310
حمض كينيكتوكرس0222
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتثيرموفيشرM63
كلوريد البوتاسيومثيرموفيشرP217
بيكربونات الصوديومثيرموفيشرS233
كلوريد الصوديومثيرموفيشرS271-1
Ultrafree-0.1 & micro ؛ م مرشح MC ،Amicon
الدقيقة كهربائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer's disease patients. Journal of Alzheimer's Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
  2. Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
  3. Hodge, R. vD., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  4. Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
  5. Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
  6. Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
  7. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
  8. Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
  9. Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138(2018).
  10. Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
  11. Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer's disease. Nature Communications. 12 (1), 2603(2021).
  12. Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
  13. Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
  14. Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
  15. Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
  16. Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
  17. Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
  18. Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
  19. Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
  20. Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  22. Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
  23. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  24. Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
  25. Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
  26. Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
  27. Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
  28. Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
  29. C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
  30. Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
  31. Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
  32. Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
  33. Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
  34. Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
  35. Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  36. Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
  37. Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
  38. Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
  39. Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
  40. Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
  41. Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Xenopus AMPA GABA

مقالات ذات صلة