مقالة منهجية

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64027

⸱

يوليو 22, 2022

 ,  , 
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول اضطرابا في 96 بئرا من Caenorhabditis elegans المستعمر بكتيريا فرديا بعد الشلل البارد وتبييض السطح لإزالة البكتيريا الخارجية. يتم طلاء التعليق الناتج على ألواح أجار للسماح بتحديد كمي دقيق ومتوسط الإنتاجية للحمل البكتيري في أعداد كبيرة من الديدان الفردية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي للتفاعلات بين الميكروب المضيف والميكروبيوم المضيف. تستخدم العديد من الدراسات حتى الآن هضمات الدفعات بدلا من عينات الدودة الفردية لتحديد الحمل البكتيري في هذا الكائن الحي. هنا يقال إن التباين الكبير بين الأفراد الذي شوهد في الاستعمار البكتيري لأمعاء C. elegans مفيد ، وأن طرق هضم الدفعات تتجاهل المعلومات المهمة للمقارنة الدقيقة عبر الظروف. نظرا لأن وصف التباين المتأصل في هذه العينات يتطلب أعدادا كبيرة من الأفراد ، فقد تم إنشاء بروتوكول مناسب للوحة 96 بئرا للتعطيل وطلاء المستعمرة للديدان الفردية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويلاحظ عدم التجانس في ارتباطات الميكروبات المضيفة في كل مكان، ويتزايد الاعتراف بالتباين بين الأفراد كعامل مساهم في العمليات على مستوى السكان من المنافسة والتعايش1 إلى انتقال الأمراض2،3،4. في C. elegans ، لوحظ "عدم التجانس الخفي" داخل المجموعات السكانية متساوية المنشأ مرارا وتكرارا ، حيث أظهرت المجموعات الفرعية للأفراد أنماطا ظاهرية متميزة في استجابة الصدمة الحرارية5,6 ، والشيخوخة ، والعمر 7,8,9,10,11 ، والعديد من الجوانب الأخرى لعلم وظائف الأعضاء والتنمية 12 . توفر معظم التحليلات التي تحاول تحديد بنية السكان الفرعية أدلة على مجموعتين فرعيتين في المجموعات التجريبية للديدان المتزامنة متساوية المنشأ 5,7,8 ، على الرغم من أن البيانات الأخرى تشير إلى إمكانية توزيع السمات داخل السكان بدلا من المجموعات المتميزة 7,12,13 . ومما له أهمية هنا ، لوحظ عدم تجانس كبير في المجموعات المعوية حتى داخل مجموعات متساوية المنشأ من الديدان المستعمرة من مصدر مشترك للميكروبات 13،14،15،16 ، ويمكن إخفاء هذا عدم التجانس من خلال قياسات هضم الدفعات التي تستخدم على نطاق واسع17،18،19،20 للقياس الكمي البكتيري في الدودة.

يقدم هذا العمل بيانات تشير إلى الحاجة إلى مزيد من الاعتماد على قياسات الدودة الواحدة في ارتباط الميكروب المضيف ، بالإضافة إلى بروتوكولات لزيادة الدقة والإنتاجية في اضطراب الدودة الواحدة. تم تصميم هذه البروتوكولات لتسهيل التعطيل الميكانيكي لأعداد كبيرة من C. elegans الفردية لتحديد كمية الحمل البكتيري القابل للحياة ، مع توفير قابلية تكرار أفضل وجهد أقل لكل عينة من التعطيل القائم على المدقة للديدان الفردية. يتم تضمين خطوة تطهير الأمعاء الموصى بها ، حيث يسمح للديدان بالتغذية على الإشريكية القولونية المقتولة بالحرارة قبل التحضير للاضطراب ، لتقليل المساهمات من البكتيريا التي تم تناولها مؤخرا وغيرها من البكتيريا العابرة (غير الملتزمة). وتشمل هذه البروتوكولات طريقة الشلل البارد لتنظيف البشرة باستخدام معالجة التبييض السطحي منخفض التركيز. يمكن استخدام التبييض السطحي كخطوة تحضيرية في اضطراب الدودة الواحدة أو كوسيلة لإعداد الديدان الحية الخالية من الجراثيم خارجيا. طريقة تبييض السطح هذه كافية لإزالة مجموعة واسعة من الميكروبات الخارجية ، وتوفر المعالجة الباردة بديلا للشلل التقليدي القائم على الليفاميزول. في حين أن الليفاميزول سيكون مفضلا للتجارب الحساسة للبرد ، فإن الشلل البارد يقلل من المساهمات في تيارات النفايات الخطرة ويسمح بالاستئناف السريع للنشاط الطبيعي. في حين أن البروتوكول الكامل يصف تجربة معملية حيث يتم استعمار الديدان بالبكتيريا المعروفة ، يمكن بسهولة تطبيق إجراءات تنظيف الديدان واضطراب الدودة الواحدة على الديدان المعزولة من العينات البرية أو المستعمرة في تجارب العالم المصغر. تنتج البروتوكولات الموصوفة هنا بكتيريا حية مستخرجة من أمعاء الدودة ، مناسبة للطلاء والقياس الكمي لوحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) في الديدان الفردية ؛ لتحليل المجتمع المعوي القائم على التسلسل ، يجب إضافة خطوات تحلل الخلايا اللاحقة واستخراج الحمض النووي إلى هذه البروتوكولات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الديدان المستخدمة في هذه التجارب من مركز Caenorhabditis الوراثي ، الذي يموله مكتب برامج البنية التحتية البحثية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (P40 OD010440). بريستول N2 هو النوع البري. تستخدم طفرات DAF-2 / IGF daf-16 (mu86) I (CGC CF1038) و daf-2 (e1370) III (CGC CB1370) لتوضيح الاختلافات في الحمل البكتيري المعوي.

HT115 (DE3) E. coli التي تحمل متجه POS-1 RNAi من مكتبة Ahringer21. تم الحصول على مجموعة MYb من بكتيريا الأمعاء الأصلية C. elegans 22 من مختبر Schulenburg. السالمونيلا المعوية LT2 (ATCC 700720) attB: GFP-KmR من هذا المختبر23. تم عزل Pseudomonas mosselii في هذا المختبر. المكورات العنقودية الذهبية تم الحصول على MSSA Newman pTRKH3-mGFP من مختبر LaRock في جامعة إيموري.

يتم إعداد جميع المخازن المؤقتة للديدان والوسائط وفقا للأدبيات المنشورة سابقا24 مع تعديلات طفيفة (انظر الملف التكميلي 1).

1. إعداد C. elegans المعقمة المتزامنة

ملاحظة: في هذا القسم، يتم وصف الإجراءات خطوة بخطوة لتوليد مجموعة متزامنة من الديدان البالغة المعقمة تكاثريا. يتم استخدام التغذية على ألواح الحمض النووي الريبي POS-1 هنا لمنع إنتاج النسل لأن هذا التداخل قاتل جنيني. تتطور يرقات L1 التي يتم رفعها إلى مرحلة البلوغ على POS-1 RNAi إلى خنثى وضع البيض ، ولكن هذه البيض غير قابلة للحياة25. بروتوكول تغذية RNAi هو كما هو الحال في فصل "علم الوراثة العكسي" من Wormbook26.

  1. قبل مزامنة الديدان ، تأكد من توفر لوحات NGM + pos-1 RNAi الطازجة مقاس 10 سم. يمكن تحضير الألواح طازجة من المستنبتة السائلة المركزة المستحثة (+Amp + IPTG) أو تلقيحها كمروج على NGM + 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين + 1 mM IPTG ويسمح لها بالنمو عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة يوم واحد27.
    ملاحظة: غالبا ما يستخدم الكاربينيسيلين (25 ميكروغرام / مل) بدلا من الأمبيسلين على ألواح RNAi. الأمبيسلين أقل تكلفة ولكنه أقل استقرارا. إذا كنت تستخدم الأمبيسلين ، فيجب أن تزرع الألواح على الفور بمجرد أن تجف وتستخدم في أقرب وقت ممكن (يمكن تخزينها لمدة <1 أسبوع عند 4 درجات مئوية)27. سيساعد تركيز المضادات الحيوية العالي الموصى به هنا على ضمان الاختيار الكافي.
  2. ابدأ بالعديد من لوحات NGM (عادة ما تكون من اثنين إلى أربعة) مع مجموعات كبيرة من الخنثى الود. عزل البيض باستخدام مزامنة التبييض-NaOH24.
    1. اغسل الديدان من ألواح الأجار باستخدام 2 مل من DDH2O المعقم لكل لوحة. قم بتوزيع السائل بالتساوي في أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل (أنبوب واحد لكل صفيحة أو خنثى).
    2. قم بالدوران لأسفل لمدة 5 ثوان تقريبا في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2000 × جم) لسحب البالغين إلى أسفل الأنابيب. ماصة قبالة supernatant والتخلص منها.
    3. يغسل مع 1 مل من DDH2O المعقمة ؛ تدور لأسفل كما كان من قبل وتجاهل supernatant.
    4. كرر الخطوة السابقة لتقليل الحطام البكتيري المتبقي.
    5. أعد تعليق محتويات كل أنبوب في 1 مل من DDH2O. أضف إلى كل أنبوب 130 ميكرولتر من المبيض التجاري (8.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم) و 130 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 5 N (NaOH ، التركيز النهائي 0.5 N).
    6. دوامة الأنابيب بقوة لمدة لا تقل عن 10-15 ثانية كل دقيقتين حتى تتفكك أجسام البالغين. لا تسمح لعلاج التبييض-NaOH أن يستمر لفترة أطول من 5 دقائق لتجنب قتل البيض.
    7. تدور في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30-60 ثانية عند 2000 × غرام لتكوير البيض. ماصة قبالة supernatant والتخلص منها. قد يكون هناك أو لا يكون هناك حبيبات مرئية ، وهذا أمر طبيعي.
    8. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 وقم بالدوران لمدة 30-60 ثانية عند 2000 × جم. تخلص من السوبرناتانت.
    9. كرر خطوة الشطف (1.2.8) 5x لإزالة خليط التبييض-NaOH تماما ، وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج حبيبات البيض.
    10. انقل البيض إلى 10 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 في أنبوب مخروطي 50 مل أو أنبوب زراعة 30 مل مع غطاء. إذا كنت تستخدم أنابيب مخروطية ، فاترك الغطاء غير مشدود قليلا واستخدم القليل من الشريط للحفاظ على أمانه. احتضان مع الاهتزاز بين عشية وضحاها (16 ساعة) عند 25 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة للسماح لليرقات بالفقس.
  3. انقل يرقات L1 المتزامنة إلى ألواح RNAi لتنمو إلى مرحلة البلوغ.
    1. أضف 2 مل من المخزن المؤقت M9 المعقم + 0.01٪ Triton X-100 (من الآن فصاعدا M9TX-01) إلى كل أنبوب L1 وانقل الحجم بالكامل (12 مل) إلى أنبوب مخروطي لولبي 15 مل.
    2. ضع أنابيب 15 مل مع ديدان L1 عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإبطاء حركة اليرقات.
    3. قم بتدوير أنابيب مخروطية سعة 15 مل في جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة (1500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق ؛ يجب ألا يزيد التسارع والتباطؤ عن 80٪ من الحد الأقصى).
    4. ماصة بعناية قبالة supernatant دون إزعاج بيليه L1. تخلص من السوبرناتانت.
    5. أضف 12 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب. كرر الطرد المركزي. ماصة بعناية قبالة والتخلص من supernatant. يجب أن يكون لكل أنبوب ~ 200 ميكرولتر متبقية.
    6. اشطف طرف ماصة 200 ميكرولتر في M9TX-01 لمنع الديدان من الالتصاق بالبلاستيك ، ثم استخدم هذا الطرف لإعادة تعليق حبيبات الدودة. انقل الديدان المعاد تعليقها إلى ألواح pos-1 المحضرة عن طريق سحب قطرات من السائل على العشب البكتيري.
    7. احتضن الألواح عند 25 درجة مئوية حتى اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
      ملاحظة: إذا كانت الديدان تنمو على ألواح الحمض النووي الريبي POS-1 ، فيجب على الديدان أن تتغذى على بكتيريا الحمض النووي الريبي حتى تنتقل بالكامل إلى مرحلة البلوغ لضمان اختراق عال للنمط الظاهري الجنيني القاتل. تحقق من اللوحات في 24 و 48 ساعة. إذا بدت الصفائح جائعة أو شبه جائعة ، فستحتاج الديدان إلى نقلها إلى أطباق جديدة لإنهاء النمو إلى بالغين كاملي الحجم. لتجنب استنزاف الألواح قبل زراعة الديدان ، تهدف إلى إضافة 250-500 يرقات L1 إلى كل لوحة RNAi 10 سم.
  4. حصاد البالغين ومسح الإشريكية القولونية المعوية لإنشاء ديدان خالية من الجراثيم.
    1. شطف الديدان البالغة من الألواح باستخدام 5 مل من M9TX-01 لكل لوحة. انقل المخزن المؤقت + الديدان إلى أنبوب مخروطي 15 مل واسمح للبالغين بالاستقرار في قاع الأنبوب.
    2. شطف البالغين في تغييرات من 10 مل من المخزن المؤقت M9TX-01 الطازج حتى لا يبقى أي تعكر بكتيري مرئي (عادة 1-2x). يمكن طرد الأنابيب مركزيا بسرعة 700 × جم لمدة 30 ثانية إلى ديدان الكريات ، أو يمكن السماح للبالغين بالاستقرار عن طريق الجاذبية.
    3. قم بإجراء غسل إضافي واحد مع 10 مل من M9TX-01 لتقليل البكتيريا الخارجية.
    4. نقل الديدان إلى أنابيب مخروطية 50 مل أو أنابيب زراعة 30 مل تحتوي على 5 مل S متوسطة + 2x E. coli OP50 (~ 5 × 109 خلايا مقتولة / مل) + 200 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين + 50 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول. إذا كنت تستخدم أنابيب مخروطية ، فاترك الغطاء غير مشدود قليلا واستخدم القليل من الشريط للحفاظ على أمانه. استخدم الماصات الزجاجية أو اشطف الماصات البلاستيكية في M9TX-01 لمنع الديدان من الالتصاق.
    5. احتضان البالغين عند 25 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة لإنتاج بالغين خاليين من الجراثيم.
      ملاحظة: إذا كان للديدان أن تبقى في المضادات الحيوية لمدة >24 ساعة، فقد يلزم إضافة المزيد من OP50 المقتول بالحرارة للتأكد من أن الديدان لديها مصدر غذائي كاف. تحقق من الأنابيب في 24 ساعة واستكملها ب OP50 المقتول بالحرارة إذا تم تقليل التعكر بشكل واضح.
  5. يغسل السكروز البالغين وفقا لبروتوكولات Wormbook24 للحصول على مخزون نظيف ومعقم ومتزامن للبالغين فقط للاستعمار البكتيري.
    1. تأكد من أن الأحجام الباردة من السكروز بنسبة 60٪ ، والمخزن المؤقت للدودة M9 ، و M9TX-01 جاهزة للاستخدام. للبساطة ، يمكن تركها عند 4 درجات مئوية في الليلة السابقة.
    2. لغسل كل عينة ، قم بإنشاء أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 8 مل من M9TX-01 ووضعه جانبا على الجليد. ستكون هناك حاجة إليها في الخطوة 1.5.10.
    3. أضف 5 مل من M9TX-01 إلى كل أنبوب 50 مل يحتوي على يرقات L1. انقل الحجم بالكامل (الآن 10 مل) إلى أنبوب مخروطي فارغ بطول 15 مل واسمح للبالغين بالاستقرار في قاع الأنبوب.
    4. ماصة بعناية قبالة supernatant والتخلص منها.
    5. أضف 10 مل M9TX-01 إلى كل أنبوب وانقل الأنابيب إلى دلو ثلج لمدة 5-10 دقائق.
      ملاحظة: بدءا من هذه المرحلة ، يجب أن تبقى الديدان وجميع المخازن المؤقتة على الجليد.
    6. استخدم إعداد "درجة الحرارة السريعة" لتبريد جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة إلى 4 درجات مئوية.
    7. أضف 10 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب لشطف أي حطام متبقي. دع الديدان تستقر على الجليد ؛ إزالة supernatant والتخلص منها.
    8. تعويم السكروز: أضف 5 مل من المخزن المؤقت M9 البارد و 5 مل من محلول السكروز البارد بنسبة 60٪ إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا. ثم ، قم بتعويم 1 مل من المخزن المؤقت M9 البارد بعناية فوق خليط السكروز العازل في كل أنبوب. لا تخلط بعد إضافة العوامة.
      تحذير: تحرك بسرعة للخطوات القليلة التالية - يمكن للديدان أن تجف إذا تعرضت لتركيزات عالية من السكروز لفترة طويلة جدا!
    9. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. ستكون الديدان البالغة الحية في واجهة M9 والسكروز ، على بعد حوالي 1 مل من أعلى الأنبوب.
    10. استخدم ماصة مصلية زجاجية سعة 5 مل لنقل طبقة الدودة إلى أنابيب مخروطية مخروطية سعة 15 مل مع M9TX-01 باردة (من الخطوة 1.5.2). كن حريصا جدا على الحصول على طبقة من الديدان الحية دون سحب الكثير من السكروز.
    11. إذا لزم الأمر ، أضف M9TX-01 للحصول على أحجام متساوية من 10-12 مل / أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة ، ثم ماصة قبالة supernatant. يمكن إرجاع الديدان إلى درجة حرارة الغرفة في هذه المرحلة.
    12. كرر خطوة الغسيل 1.5.11 مرتين ، مما يقلل من السرعة إلى 700 × g عند 4 درجات مئوية والوقت إلى 30 ثانية.

2. تغذية الديدان على البكتيريا الحية في الثقافة السائلة

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول لاستعمار الديدان بالبكتيريا المزروعة في المختبر في ظروف مختلطة جيدا في المستنبتة السائلة (الشكل التكميلي 1). يمكن استعمار الديدان بعزلات فردية من الثقافة النقية (على سبيل المثال ، مسببات الأمراض مثل Enterococcus faecium28,29) أو مخاليط من العزلات (على سبيل المثال ، الحد الأدنى من مجتمعات الميكروبيوم14).

  1. ابدأ بالديدان البالغة المتزامنة المغسولة بالسكروز من خطوة البروتوكول 1.5 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الديدان مرة واحدة في 12 مل من المخزن المؤقت S وتخلص من السوبرناتانت.
  2. أعد تعليق الديدان المغسولة في حجم الوسط S اللازم للتجربة. ضع في اعتبارك حجم الظروف التجريبية ، وعدد الظروف التي سيتم تقسيم الديدان عليها ، والتركيزات النهائية للديدان والبكتيريا.
    ملاحظة: تختلف التغذية في الديدان باختلاف توافر البكتيريا30 ويمكن التأكيد على الديدان عن طريق الازدحام31. بالنسبة للاستعمار في الثقافة السائلة ، يوصى <1000 ديدان / مل و >107 CFU / mL ؛ 1011 تعتبر CFU/mL كثافة تغذية "ad libitum" على الإشريكية القولونية32.
  3. قم بتدوير الثقافات البكتيرية. صب قبالة supernatant. يمكن استخدام الشفط أو السحب لإزالة supernatant للبكتيريا التي تشكل كريات فضفاضة.
    ملاحظة: بالنسبة للثقافات >5 مل ، انقل إلى أنابيب 15 مل وقم بالدوران عند ~ 2800 × g في جهاز طرد مركزي كبير على الطاولة لمدة 8-10 دقائق. يمكن نقل الثقافات <5 مل إلى أنابيب 1.5 مل والطرد المركزي عند 9000 × g لمدة 1-2 دقيقة في جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة. قد تحتاج البكتيريا شديدة الحركة (على سبيل المثال ، العديد من أنواع Pseudomonas) إلى التبريد عند 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة لتسهيل تكوين حبيبات مستقرة ، وقد يكون من الأفضل جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية.
  4. أعد تعليق المزارع البكتيرية في حجم واحد من المخزن المؤقت S وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إلى الكريات. قم بإزالة وتجاهل supernatant كما كان من قبل.
  5. أعد تعليق المزارع البكتيرية في وسط S بالكثافة المطلوبة للتجربة ، بالإضافة إلى أي مضادات حيوية للاختيار. تعتمد المضادات الحيوية التي سيتم استخدامها ، إن وجدت ، على ملف تعريف مقاومة البكتيريا المستخدمة في الاستعمار.
  6. باستخدام طرف ماصة مطلي ب M9TX-01 ، تقوم ديدان الماصة بلطف لأعلى ولأسفل حتى يتم إعادة تعليق الديدان تماما في وسط S ، ثم نقلها إلى أنابيب أو آبار صفيحة للاستعمار البكتيري.
  7. أضف التعليق البكتيري إلى كل مزرعة دودة للوصول إلى التركيز البكتيري المطلوب والحجم النهائي.
  8. في حالة استخدام صفيحة متعددة الآبار للاستعمار ، قم بتغطية اللوحة بغشاء مانع للتسرب من الغاز معقم يبلغ 96 بئرا.
  9. احتضان مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمنع البكتيريا من الاستقرار أثناء الحضانة.

3. الاضطراب الميكانيكي للديدان الفردية في شكل 96 بئرا

ملاحظة: يصف هذا القسم بروتوكول تنسيق لوحة 96 بئرا للتعطيل الميكانيكي ل C. elegans المستعمرة بكتيريا. تصف الخطوات الأولى في البروتوكول (3.1-3.8) طريقة لتطهير البكتيريا غير الملتصقة من أمعاء الدودة وتنظيف الجزء الخارجي من الديدان باستخدام الشلل البارد وتبييض السطح. ستنتج هذه الخطوات ديدان بالغة نظيفة وحية يمكن تعطيلها ميكانيكيا لتحديد كمية المحتويات البكتيرية (3.8 نهاية) أو استخدامها لإجراء المزيد من التجارب (الشكل التكميلي 1). يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحديد كمية البكتيريا في الديدان المستعمرة في الثقافة السائلة (القسم 2) ، أو على ألواح الأجار ، أو من التربة الطبيعية أو المصغرة.

  1. ضع أليكوت من M9TX-01 على الجليد لتبرد (4-5 أضعاف عدد العينات بالمل).
  2. تحضير أليكوت من M9TX-01 + التبييض (6 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم ، 1: 1000 أو 1: 2000 v / v ، 1 مل لكل عينة + 1 مل إضافي) ووضعها على الجليد لتبرد. سيتم استخدام هذا aliquot في الخطوة 3.8.
  3. قم بإعداد لوحات 96 بئرا للتخفيف التسلسلي لعينات الدودة المعطلة.
    1. الحصول على لوحات معقمة بسعة 300 ميكرولتر بسعة 96 بئرا مع أغطية ؛ يستخدم هذا البروتوكول لوحة تخفيف واحدة لكل 12 دودة مهضومة.
    2. استخدم ماصة متعددة القنوات بسعة 96 بئرا لملء الصفوف B-D لكل لوحة بئر 96 (سعة 300 ميكرولتر) مع 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1x PBS. اترك الصف العلوي فارغا. ستصبح الصفوف B-D 10x تخفيفا تسلسليا لهضمات الدودة [0.1x ، 0.01x ، 0.01x].
    3. ضع الأطباق جانبا. سيتم استخدام لوحات التخفيف في الخطوة 3.13.
  4. أعد تعليق كل عينة دودة في 1 مل من M9TX-01 في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
  5. تدور الأنابيب لفترة وجيزة (2-3 ثانية) في جهاز طرد مركزي صغير منخفض السرعة (2000 × جم) عند 25 درجة مئوية للبالغين الكريات. ماصة قبالة supernatant والتخلص منها ، والتأكد من عدم إزعاج بيليه الدودة.
  6. باستخدام إعدادات الطرد المركزي في الخطوة 3.5 ، اشطف الديدان مرتين باستخدام 1 مل من M9TX-01 ، ثم مرة واحدة باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 ، لتقليل البكتيريا الخارجية.
  7. تطهير البكتيريا غير الملتصقة من الأمعاء الدودة.
    1. أعد تعليق كل عينة من الديدان في 1 مل من S متوسطة + 2x OP50 المقتولة بالحرارة في أنبوب استزراع.
    2. تحضن في 25 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة للسماح بمرور أي بكتيريا غير ملتصقة من الأمعاء.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك أيضا إلى تطهير أي بروتين فلورسنت خارج الخلية من التجويف ويسمح بتصور أوضح للبكتيريا الملصقة الملتصقة بالظهارة المعوية ، خاصة عند استخدام الفلوروفورات سريعة الحمض (على سبيل المثال ، mCherry ، dsRed).
  8. ديدان التبييض السطحية لإزالة البكتيريا الخارجية.
    1. شطف الديدان المطهرة مرتين مع 1 مل من M9TX-01 الباردة والتخلص من supernatant.
    2. اترك الأنابيب لتبرد لمدة 10 دقائق على الجليد (المفضل) أو عند 4 درجات مئوية. هذا سوف يشل الديدان ويمنع ابتلاع التبييض.
      ملاحظة: تستخدم بروتوكولات أخرى عامل شلل كيميائي مثل الليفاميزول. هذا هو النهج الراسخ33 الذي يتطلب إضافة تيار النفايات الخطرة.
    3. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للدودة M9 الباردة + المبيض غير المعطر (8.25٪ هيدروكسيد الصوديوم ، 1: 1000 أو 1: 2000 v / v) إلى كل أنبوب. اسمح للأنابيب بالجلوس على الجليد (المفضل) أو عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل لقتل البكتيريا الخارجية.
      ملاحظة: لا تتجاوز تركيز التبييض 1:1000. حتى في الديدان المشلولة ، يمكن أن ينتج عن الوفيات.
    4. ماصة قبالة المخزن المؤقت المبيض والتخلص منها. أعد الأنابيب إلى الجليد لضمان عدم استئناف الديدان للضخ حتى يتم إزالة المبيض.
    5. أضف 1 مل من M9TX-01 البارد إلى كل أنبوب. تدور لمدة ~ 5 ثانية في جهاز طرد مركزي صغير (2000 × جم عند 25 درجة مئوية) ؛ إعادة الأنابيب إلى الجليد. قم بإزالة supernatant وتخلص منه.
    6. كرر خطوة الشطف هذه مع 1 مل آخر من M9TX-01 البارد ، مع التخلص من أكبر قدر ممكن من supernatant.
      ملاحظة: في حالة استخدام الديدان لإجراء مزيد من التجارب، تخطى خطوة النفاذية (البروتوكول 3.9) وبدلا من ذلك انقل البالغين المبيضين حديثا إلى المخزن المؤقت المثلج في طبق بتري بطول 6 سم وافصل الديدان إلى ظروف تجريبية كما هو الحال في البروتوكول 3.10. حافظ على برودة الديدان لمنع الحركة من الاستئناف ولكن العمل بسرعة - يمكن أن يؤدي الاحتفاظ بالديدان لمدة >30 دقيقة على الجليد إلى استئناف النشاط الطبيعي بنسبة <100٪34.
  9. النفاذية الكيميائية لبشرة الدودة مع كبريتات دوديسيل الصوديوم وثنائي ثيوثريتول (0.25٪ SDS + 300 mM DTT) (على أساس35)
    تنبيه: DTT هو عامل اختزال ومهيج. ارتد معدات الوقاية الشخصية واعمل في غطاء دخان عند التعامل مع المخزون الجاف أو المحاليل. مطلوب تيار النفايات الخطرة.
    1. في غطاء الدخان ، قم بإعداد ما يكفي من محلول SDS / DTT للسماح ب 100 ميكرولتر لكل عينة. بالنسبة إلى 1 مل ، إلى 965 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M9 أو M9TX-01 في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، أضف 5 ميكرولتر من 5٪ (ث / v) SDS و 30 ميكرولتر من 1M DTT.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول DTT 1 M (مائي) طازجا أو تخزينه في الأليكوتات عند -20 درجة مئوية لضمان الفعالية. يجب أن يكون حجم Aliquots ليتم استخدامه في تجربتين إلى ثلاث تجارب لتجنب الإفراط في ركوب الدراجات في التجمد والذوبان.
    2. انقل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على ديدان مبيضة على السطح إلى رف أنبوب بدرجة حرارة الغرفة. يجب أن يحتوي كل أنبوب على ديدان في ~ 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول SDS/DTT إلى كل عينة دودة. تخلص من أي حل متبقي من حلول SDS/DTT في تيار النفايات الخطرة المناسب.
    4. اسمح للعلاج بالمضي قدما لمدة تصل إلى 8 دقائق على المقعد لتحطيم البشرة المقاومة للديدان البالغة جزئيا. سوف تموت الديدان وتستقر في قاع الأنبوب خلال هذا الوقت.
    5. بعد انتهاء وقت النفاذية ، قم بسحب الماصة بعناية من السوبرناتانت SDS / DTT والتخلص منها في تيار نفايات خطرة SDS / DTT مناسب.
    6. أضف 1 مل من M9TX-01 إلى كل أنبوب. تدور لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي على الطاولة لتكسير الديدان أو السماح للديدان بالاستقرار عن طريق الجاذبية إلى أسفل الأنابيب ، ثم سحب supernatant والتخلص منها في تيار النفايات الخطرة SDS / DTT.
    7. أعد تعليق الديدان في مخزن مؤقت للديدان M9 سعة 1 مل + 0.1٪ Triton X-100 حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  10. افصل الديدان في صفيحة عميقة من 96 بئرا مع حصى كربيد السيليكون للتعطيل الميكانيكي. قم بإعداد لوحة التعطيل المكونة من 96 بئرا على النحو التالي.
    1. احصل على صفيحة معقمة بعمق 2 مل بعمق 96 بئرا وغطاء لوحة سيليكون مطابق من 96 بئرا.
      ملاحظة: من المهم استخدام لوحات متوافقة مع محولات 96 بئرا لتعطيل الأنسجة. الاختلافات الصغيرة في الأبعاد الخارجية تحدث فرقا بين لوحة يمكن إزالتها من المحولات وأخرى لا يمكن إزالتها.
    2. باستخدام ملعقة مغرفة معقمة ، أضف كمية صغيرة من كربيد السيليكون المعقم 36 حصى إلى كل بئر من الطبق الذي سيتلقى دودة. استخدم ما يكفي من الحصى لتغطية قاع البئر بالكاد (حوالي 0.2 جم لكل بئر). المواد الزائدة ستجعل من الصعب الحصول على طرف ماصة إلى أسفل البئر عند استرداد المحتويات.
    3. أضف 180 ميكرولتر من المخزن المؤقت للدودة M9 إلى كل بئر.
    4. قم بتسمية الأعمدة أو الصفوف للإشارة إلى المكان الذي ستذهب إليه كل عينة ، ثم قم بتغطية اللوحة بشكل فضفاض بغطاء لوحة السيليكون المكون من 96 بئرا.
  11. نقل الديدان الفردية إلى لوحة 96 بئر للتعطيل.
    1. انقل الديدان المتخلل بعناية إلى طبق بتري صغير (35 أو 60 مم) يحتوي على ما يكفي من M9TX-01 لملء الطبق على عمق ~ 1 سم.
      ملاحظة: في حالة وجود عدد كبير من الديدان ، فقد لا يكون من الممكن نقل العينة بأكملها لأن السائل سيصبح مزدحما وسيكون من الصعب ماصة الديدان الفردية.
    2. باستخدام مجهر تشريح أو أي جهاز آخر منخفض التكبير ، قم بإخراج الديدان الفردية في أحجام 20 ميكرولتر ، ونقل هذه الديدان إلى آبار فردية من صفيحة 96 بئرا.
      ملاحظة: من الأفضل حصاد الديدان المقتولة حديثا فقط. تجنب الديدان ذات الشكل الخطي الصلب ، لأن هذه الديدان قد تكون ميتة لبعض الوقت. حاول أن تأخذ الديدان المنحنية أو على شكل حرف S ، مع فسيولوجيا إجمالية طبيعية وأمعاء سليمة.
    3. بعد نقل كل وحدة تخزين ، تأكد من أن الدودة المحددة قد تم إخراجها بالفعل إلى البئر. للقيام بذلك ، ماصة تصل إلى 20 ميكرولتر من M9TX-01 من منطقة واضحة من طبق بتري وإطلاق الحجم الكامل مرة أخرى في الطبق ؛ سيؤدي ذلك عادة إلى إخراج الدودة إذا كانت عالقة في الماصة. إذا كانت الدودة عالقة ، فقم بإزالة 20 ميكرولتر من البئر وحاول النقل مرة أخرى.
    4. بمجرد نقل جميع الديدان ، قم بتغطية لوحة البئر 96 بورقة من فيلم الختم المرن المدعوم بالورق (2 × 2 مربع) ، مع التأكد من أن الجانب المدعوم بالورق من فيلم الختم مواجه لأسفل على آبار العينة. احرص على عدم تمديد فيلم الختم الرقيق جدا ، أو سيكون من الصعب جدا إزالته لاحقا.
    5. ضع حصيرة ختم السيليكون برفق فوق فيلم الختم المرن ؛ لا تضغط على الغطاء لأسفل في الآبار في هذا الوقت.
    6. حرك اللوحة إلى 4 درجات مئوية لتبرد لمدة 30-60 دقيقة. هذا سيمنع ارتفاع درجة الحرارة أثناء الاضطراب ، مما قد يؤدي إلى تلف العينات.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف في البروتوكول. في معظم الحالات ، يمكن ترك اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 ساعات قبل الطحن. لا تترك الديدان بين عشية وضحاها ، لأن هذا سيغير عدد البكتيريا.
  12. قم بتحميل لوحات 96 بئرا على جهاز تعطيل الأنسجة لتفتيت أنسجة الدودة وإطلاق البكتيريا المعوية.
    ملاحظة: (اختياري) في حالة استخدام عدد فردي من لوحات 96-well للهضم، فمن الضروري إعداد ثقل موازنة قبل المتابعة. استخدم صفيحة فارغة عميقة من 96 بئرا واملأ الآبار بالماء حتى يزن نفس وزن اللوحة الأولى.
    1. اضغط على حصيرة ختم السيليكون لأسفل بقوة في الآبار لإنشاء ختم ، مع التأكد من أن الغطاء يقع مسطحا عبر سطح اللوحة بالكامل.
      ملاحظة: إذا كان فيلم الختم المرن سميكا جدا بعد التمدد ، فسيكون من الصعب تأمين غطاء السيليكون بحيث يكون مستلقيا بشكل مسطح في جميع الآبار. سيؤدي ذلك إلى عدم كفاية الختم والتلوث من البئر إلى البئر أثناء الاهتزاز.
    2. قم بتأمين الألواح في معطل الأنسجة باستخدام محولات الألواح ذات ال 96 بئرا. رج الألواح لمدة 1 دقيقة عند 30 هرتز، ثم قم بتدوير الألواح 180 درجة ورجها مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة. هذا سوف يساعد على ضمان حتى الاضطراب في جميع آبار اللوحة.
    3. اضغط على الألواح بإحكام على المقعد مرتين أو ثلاث مرات لإزاحة أي حصى من فيلم الختم المرن.
    4. باستخدام جهاز طرد مركزي كبير مع اثنين من محولات لوحة 96 بئرا ، قم بتدوير الألواح لأسفل عند 2400 × g لمدة 2 دقيقة لجمع جميع المواد في قاع الآبار.
    5. قم بإزالة غطاء السيليكون واسحب بعناية فيلم الختم المرن.
      ملاحظة: إذا التزم فيلم الختم المرن في أي من الآبار ، فاستخدم طرف ماصة 200 ميكرولتر لإزالته. هذا أمر شائع عندما تم تمديد فيلم الختم المرن رقيقة جدا.
  13. عينات هضم الدودة المخففة بشكل متسلسل في 300 ميكرولتر في لوحات 96 بئرا.
    1. باستخدام ماصة متعددة الآبار مضبوطة على 200 ميكرولتر ، قم بماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات ببطء وبعناية لإعادة خلط محتويات الآبار ، ثم اسحب أكبر قدر ممكن من السائل. انقل هذا السائل إلى الصفوف العليا من ألواح البئر 96 المعدة في الخطوة 3.3.
    2. باستخدام ماصة 96 بئر مضبوطة على 20 ميكرولتر ، قم بإزالة هذا الحجم من السائل من الصف العلوي وقم بتوزيعه في الصف B. ماصة لأعلى ولأسفل 8-10x للخلط. تجاهل النصائح.
    3. كرر الخطوة 3.13.2، بدءا من عينات 0.1x في الصف B لإنشاء عينات تخفيف 0.01x في الصف C.
    4. كرر الخطوة 3.13.2 مرة أخرى، الانتقال من الصف C إلى الصف D.
    5. طبق على أجار صلب لتحديد كمية البكتيريا. بالنسبة للديدان أحادية الاستعمار ، يكفي عموما وضع قطرات 10-20 ميكرولتر من كل تخفيف [1x-0.001x] على ألواح أجار. بالنسبة للاستعمار متعدد الأنواع ، قم بلوحة كل تخفيف على حدة عن طريق سحب 100 ميكرولتر على صفيحة أجار 10 سم ؛ ينتشر على الفور باستخدام خرز طلاء الزجاج.

4. تنظيف الحصى كربيد السيليكون لإعادة استخدامها

ملاحظة: يستخدم هذا الإجراء لتنظيف وتعقيم مواد الطحن ، حصى كربيد السيليكون ، لإعادة استخدامها بعد التجارب. يجب اتباع هذا البروتوكول بالكامل قبل الاستخدام الأول ، حيث أن حصى كربيد السيليكون هو منتج صناعي ولا يأتي معقما مسبقا. حصى Si-carbide (3.2 جم / سم مكعب) هي مادة كثيفة ذات حواف خشنة تعمل بكفاءة لتعطيل العينات الصعبة. ومع ذلك ، يمكن أن تتآكل الجسيمات على الاستخدام المتكرر ويجب استبدالها عندما يصبح التآكل واضحا. لحسن الحظ ، فإن المادة غير مكلفة ، والأحجام التي تباع عادة (~ 1 رطل) كافية للعديد من التجارب.

  1. بعد إزالة العينات للطلاء ، أضف محلول تبييض بنسبة 10٪ إلى جميع آبار اللوحة المكونة من 96 بئرا واتركها لمدة 10 دقائق على الأقل.
  2. قم بإزالة الجزء الأكبر من الحصى عن طريق عكس اللوحة المكونة من 96 بئرا بسرعة فوق صينية صغيرة عالية الجانب أو حاوية طرف ماصة P1000 فارغة كبيرة بما يكفي لالتقاط جميع المحتويات. سوف تغرق الحصى على الفور في الجزء السفلي من الدرج. صب محلول التبييض في الحوض.
  3. أعد ملء الصفيحة المكونة من 96 بئرا بماء الصنبور وانقلبها في نفس الدرج لشطف الحصى المتبقي. صب الماء في الحوض.
  4. كرر مرة إلى ثلاث مرات أخرى مع ماء الصنبور حتى يصبح الطبق خاليا تماما من الحصى.
  5. شطف الحصى 2x في ماء الصنبور ، وملء الدرج في كل مرة.
    ملاحظة: يمكن غسل لوحة البئر العميقة المكونة من 96 بئرا في غسالة الصحون المختبرية ، وتغطيتها بشكل آمن بورق القصدير ، وتعقيمها بمواد بلاستيكية أخرى قابلة لإعادة الاستخدام. لا تحتاج الحصى إلى غسلها على الفور ويمكن وضعها جانبا في هذه المرحلة. عادة ما تتراكم الحصى المستخدمة من تجارب متعددة قبل الغسيل والتعقيم.
  6. اغسل الحصى في محلول من المنظفات المختبرية لمدة 30 دقيقة ، مع الإثارة من حين لآخر عن طريق الدوران أو الخلط مع ملعقة معدنية.
  7. شطف جميع آثار المنظفات في عدة تغييرات (8-10) من ماء الصنبور ، ثم شطف 2x بالماء المقطر.
  8. انشر الحصى في صينية مفتوحة ، مثل صينية الأوتوكلاف الضحلة المصنوعة من البولي بروبيلين ، وجففها عند 40-70 درجة مئوية لعدة ساعات.
    ملاحظة: إذا كانت الحصى متكتلة عندما تجف ، فلم يتم تنظيفها أو شطفها بشكل كاف. كرر بروتوكول التنظيف بدءا من الخطوة 4.6 ، مع إضافة شطف إضافي في الخطوة 4.7.
  9. قم بتوزيع الحصى النظيف والجاف في زجاجات زجاجية قابلة للتعقيم على سطح لولبي على عمق أقصى يتراوح بين 5 و 6 سم. الأوتوكلاف في دورة ما قبل الفراغ لمدة 30 دقيقة للتعقيم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعقيم التبييض للديدان الحية
الديدان المبيضة على السطح خالية بشكل فعال من البكتيريا الخارجية حتى تعود الحركة وتستأنف الإفراز. في ظل الظروف المستخدمة هنا ، لوحظ الانقراض السريع للبكتيريا في المخزن المؤقت (الشكل 1A-C ، الشكل التكميلي 2 ، الفيديو 1) دون إزعاج البكتيريا المرتبطة بالأمعاء في الديدان المشلولة بالبرد (الشكل 1D-F ، الفيديو 2). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يتم تقديم البيانات حول مزايا القياس الكمي للدودة المفردة للحمل البكتيري في C. elegans ، إلى جانب بروتوكول تعطيل 96 بئرا للسماح بالحصول السريع والمتسق على مجموعات البيانات الكبيرة من هذا النوع. بالمقارنة مع الطرق الحالية33 ، تسمح هذه البروتوكولات بقياس إنتاجية أعلى للمجتمعات الميكروبية المعوية في الدودة.

هذا النهج لديه الطلاء كخطوة للحد من معدل الفائدة وليس حقا "الإنتاجية العالية". يعد قياس التدفق الخلوي للأجسام الكبيرة (الشكل 3C

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم ل H. Schulenberg و C. LaRock لمشاركتهم السخية للسلالات البكتيرية المستخدمة في هذه التجارب. تم دعم هذا العمل بتمويل من جامعة إيموري و NSF (PHY2014173).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألواح البولي بروبلين ذات القاع المسطح 96 بئر ، 300 ميكرولترمن أدوات المختبر دائمة الخضرة290-8350-03F
حصيرة مانعة للتسرب من الألواح 96 بئر ، سيليكون ، آبار مربعة (AxyMat)AxygenAM-2ML-SQ
96 بئر ، 2 مل ، آبار مربعةAxygenP-2ML-SQ-C-S
96 بئر أغطية ألواح البولي بروبلينEvergreen Labware290-8020-03L
Agar
Bead لألواح 96 بئرا لوحاتمحول QIAGEN119900للاستخدام مع لوحين 96 بئرا على TissueLyser II
الخالط (TissueLyser II)QIAGEN85300الخالط الميكانيكي لتعطيل العينة المتوسطة إلى العالية
BioSorterUnion Biometricaحسب الاقتباسفارز الأشياء الكبيرة مجهز بتركيز 250 ميكرون ل C. elegans< / em>
التبييض ، تجاري ، 8.25٪ هيبوكلوريت الصوديومكلوركس
Breathe-Easy غشاء مانع للتسرب للغاز 96 بئرمتنوع BiotechBEM-1أغشية البولي يوريثين متعددة الآبار قابلة للنفاذية للغاز فيلم الختم الرقيق قابل للاختراق ل O2 و CO2 وأبخرة الماء وهو شفاف للأشعة فوق البنفسجية حتى 300 نانومتر. معقم ، 100 / صندوق.
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدراتفيشر AC423525000
الكوليسترولVWRAAA11470-30
حامض الستريك أحادي الهيدراتفيشر AC124910010
النحاس العلمي (II) كبريتات خماسي الهيدراتفيشر ScientificAC197722500
Corning 6765 LSE Mini MicrocentrifugeCorning  COR-6765
ثنائي الصوديوم EDTAفيشرScientific 409971000
DL 1،4 Dithiothreitol ، 99 + ٪ ، لبيولوجيا mol ، DNAse ، RNAse و Protease ، ACROS OrganicsFisher Scientific327190010
Eppendorf 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ،Eppendorf
5424REppendorf5406000640جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على الطاولة
24 مكانا جهاز طرد مركزي Eppendorf 5810R مع الدوار S-4-104Eppendorf226270403L مع محولات لأنابيب وألواح 15-50 مل دلو
لوحة Eppendorf (x2) ، للدوار S-4-104Eppendorf22638930
الإيثانول 100٪خرزBP2818500
Scientific ، منتجات علوم الحياة 2.7 ممLS-79127
خرز زجاجي ، مغسول بالحمض ، 425-600 ومايكرو ؛ مسيجماG877-500G
حبات طلاء زجاجيةVWR76005-124
حمض الهيدروكلوريكVWRBDH7204-1
كبريتات الحديد (II) هيبتاهيدراتفيشر Scientific423731000
Kimble Kontes بيليه مدقة محركDWK علوم الحياة749540-0000
Kimble Kontes بيليه المدقات و الأنابيب الدقيقة ، 0.5 ملDWK Life Sciences749520-0590
Leica DMi8 مجهر مقلوب بمحرك مع مرحلة آليةLeica11889113
Leica LAS X Premium softwareLeica11640687
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتفيشر ScientificAC124900010
المنغنيز (II) كلوريد رباعي الهيدراتVWR470301-706
بارافيلم M فيلم مانع للتسرب المختبري مرنAmcorPM996
PeptoneFisher ScientificBP1420-500
أطباق بتري ، دائري ، 10 سمVWR25384-094
أطباق بتري ، دائري ، 6 سمVWR25384-092
أطباق بتري ، مربعة ، 10 × 10 سمVWR10799-140
فوسفو مخزن محلول ملحي (1X PBS)علبة أوتوكلاف من مادة البوليP-271-200
، ضحلةفيشر Scientific13-361-10
هيدروكسيد البوتاسيومفيشر ScientificAC134062500
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةفيشر ScientificBP363-1
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةفيشر ScientificBP362-1
R 4.1.3 / RStudio 2022.02.0 بناء 443R Foundationn / a
ملعقة مختبر من نوع Scoop ، معدنVWR470149-438
كربيد السيليكون 36 حصىMJR Tumblersn / aحبيبات كربيد السيليكون الخشنة الإضافية. متوفر بأحجام 0.5-5 رطل من هذا البائع.
كبريتات دوديسيل الصوديومفيشر ScientificBP166-100
هيدروكسيد الصوديومVWRBDH7247-1
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائيفيشر ScientificBP332-500
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-1
السكروزفيشر العلميAC419760010
ثلاثي البوتاسيوم سيترات أحادي الهيدراتفيشر AC611755000
تريتون X-100فيشر ScientificBP151-100
كبريتات الزنك سباعي هيبتاهيدراتفيشر AC205982500
ألواح مجموعة محول مطحنة Fisher Scientific 443570050 مطحنة الخرزة الخالط الإنتاجية العلمي جهاز الطرد المركزي الدقيق الطبيعي جهاز طرد مركزي زجاجي فيشر بروبلين Gold Bio العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093(2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652(2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53(2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090(2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604(2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113(2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38(2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327(2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068(2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701(2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263(2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505(2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921(2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633(2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338(2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037(2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Caenorhabditis ElegansBacterial ColonizationHost Microbe InteractionsSingle Worm Quantification96 Well PlateMechanical DisruptionColony PlatingSurface BleachingSerial DilutionIntestinal Bacterial Load

مقالات ذات صلة