مقالة منهجية

تقييم غير مدمر لكثافة الخلايا الإقليمية داخل مجاميع الورم بعد العلاج بالعقاقير

DOI:

10.3791/64030

⸱

يونيو 21, 2022

 ,  ,  , 
1Rensselaer Polytechnic Institute, 2Albany Medical College

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يطور البروتوكول الحالي تقنية قائمة على الصور لقياس كثافة الخلايا الإقليمية السريعة وغير المدمرة والخالية من الملصقات وقابلية البقاء داخل مجاميع الأورام 3D. كشفت النتائج عن تدرج كثافة الخلايا، مع كثافات خلايا أعلى في المناطق الأساسية من الطبقات الخارجية في المجاميع النامية وموت الخلايا الطرفية في الغالب في مجاميع HER2+ المعالجة باستخدام Trastuzumab.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت نماذج الورم الكروي متعدد الخلايا (MCTSs) فائدة متزايدة للدراسة في المختبر لتطور السرطان واكتشاف الأدوية. هذه التركيبات اللاوعائية البسيطة نسبيا تحاكي الجوانب الرئيسية للأورام في الجسم الحي ، مثل بنية 3D والتدرجات الفسيولوجية المرضية. يمكن أن توفر نماذج MCTSs رؤى ثاقبة حول سلوك الخلايا السرطانية أثناء التطور الكروي واستجابة للعقاقير. ومع ذلك ، فإن حجمها المطلوب يحد بشكل كبير من الأدوات المستخدمة في التقييم غير المدمر. يتم استكشاف التصوير الهيكلي للتصوير المقطعي بالتماسك البصري وبرنامج تحليل Imaris 3D لقياس سريع وغير مدمر وخالي من الملصقات لكثافة الخلايا الإقليمية داخل MCTSs. يستخدم هذا النهج لتقييم MCTSs على مدى فترة نضج مدتها 4 أيام وطوال فترة علاج ممتدة لمدة 5 أيام باستخدام Trastuzumab ، وهو دواء مضاد ل HER2 ذي صلة سريريا. باختصار ، تم إنشاء AU565 HER2 + سرطان الثدي MCTSs عن طريق تراكب السائل مع أو بدون إضافة Matrigel (مصفوفة غشاء قبوي) لاستكشاف مجاميع من مورفولوجيات مختلفة (أكثر سمكا ، مثل القرص 2.5D المجاميع أو المجاميع 2D مسطحة ، على التوالي). تميزت كثافة الخلايا داخل المنطقة الخارجية والمنطقة الانتقالية والنواة الداخلية في MCTSs الناضجة ، مما كشف عن تدرج كثافة الخلايا مع كثافات خلوية أعلى في المناطق الأساسية مقارنة بالطبقات الخارجية. أعادت إضافة المصفوفة توزيع كثافة الخلايا وعززت هذا التدرج ، مما قلل من كثافة المنطقة الخارجية وزاد من ضغط الخلايا في النوى. تم قياس كثافة الخلايا كميا بعد العلاج من تعاطي المخدرات (0 ساعة ، 24 ساعة ، 5 أيام) داخل مناطق أعمق تدريجيا 100 ميكرومتر لتقييم الاختلافات الإقليمية المحتملة في الاستجابة للعقاقير. وبحلول النقطة الزمنية الأخيرة، بدا أن جميع وفيات الخلايا تقريبا مقيدة ب 200 ميكرومتر من كل مجموعة، في حين بدت الخلايا الأعمق في المجموع غير متأثرة إلى حد كبير، مما يوضح الاختلافات الإقليمية في الاستجابة للدواء، ربما بسبب القيود المفروضة على تغلغل المخدرات. يوفر البروتوكول الحالي تقنية فريدة من نوعها لتحديد كثافة الخلايا الإقليمية داخل الأنسجة الخلوية الكثيفة بشكل غير مدمر وقياسها طوليا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحول الباحثون إلى حد كبير إلى ثقافة 3D على مقاعد البدلاء في الأنظمة المختبرية لدراسة بعض السمات الرئيسية لتطور الورم. وقد قاد الكثير من هذا البحث من خلال عودة ظهور الأورام الكروية متعددة الخلايا (MCTSs) والمواد العضوية الأكثر تعقيدا 1,2. على الرغم من أن هذه النماذج هي الأوعية الدموية ، إلا أنها توفر أداة قوية لتلخيص العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تحدث في الجسم الحي3،4،5. على وجه الخصوص ، يمكن للنماذج متوسطة الحجم (قطرها 300-500 ميكرومتر) محاكاة ميزات الورم الرئيسية مثل بنية 3D ، والتدرجات الفسيولوجية المرضية ، والإشارات النقيلية بسبب نقص الأكسجة داخل القلب. من الموثق جيدا أن هذه النماذج تعرض الطبقات متحدة المركز المميزة التي شوهدت في أورام الأوعية الدموية في الجسم الحي ، وهي طبقة خارجية من الخلايا التكاثرية ، وطبقة انتقالية من الخلايا الشائخة / الهادئة ، والخلايا التي تعاني من نقص الأكسجة في القلب3،6،7،8،9 . يمكن الحصول على رؤية فريدة من نوعها من هذه النماذج من خلال توصيف سلوك الخلايا داخل هذه الطبقات ، أثناء التطوير والاستجابة للدواء. ومع ذلك ، فإن حجم MCTS المطلوب ، الضروري لتطوير التدرجات التي تجعلها قوية في النماذج المختبرية ، يحد بشكل كبير من الأدوات المستخدمة في التقييم غير المدمر. والواقع أن أحد أكبر التحديات التي تواجه التحليل غير المدمر للمركبات المتوسطة الأجل يتمثل في تحديد التفاصيل على نطاق الخلايا. يتم استخدام المجهر الساطع المجال وتباين الطور بشكل روتيني لتقييم نمو وتطوير 3D MCTSs بشكل غير مدمر. ومع ذلك ، تقتصر هذه الطرائق على إسقاطات ثنائية الأبعاد ، تفتقر إلى القدرة على تصور الهيكل ثلاثي الأبعاد الحاسم لهذه النماذج10،11،12،13. عادة ما يتم جمع المعلومات حول السمية الخلوية وتكاثر الخلايا من خلال التصوير الفلوري (أي المجهر الضوئي ، المجهر البؤري) أو التلطيخ المناعي خارج الجسم الحي 14،15،16. في حين أن هذه الأساليب توفر معلومات قيمة وعالية الدقة عن بنية الأنسجة والكثافة الخلوية والوظيفة الخلوية ، فإنها غالبا ما تتطلب إعداد عينات مثل التطهير البصري أو التثبيت / التلطيخ أو التضمين الذي يمنع التحليلات الطولية.

التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) هو طريقة تصوير هيكلي غير مدمرة لديها القدرة على التغلب على بعض التحديات المذكورة أعلاه. إنه يتميز بدقة خلوية ومجال رؤية واسع بما فيه الكفاية (يصل إلى 10 مم × 10 مم) قادر على تصور المجاميع متعددة الخلايا بالكامل17،18،19. الأهم من ذلك ، نظرا للطبيعة المرئية للضوء المستخدم ، فإن هذه التقنية غير مدمرة تماما وخالية من الملصقات17. أيضا ، يمكن تصوير العينات في الموقع دون الحاجة إلى إعداد العينات ، بحيث يمكن أخذ العينات مباشرة من الحاضنة ، ومسحها ضوئيا بسرعة باستخدام OCT (مدة المسح ~ 5-10 دقائق) ، ثم إعادتها إلى الحاضنة ، مما يتيح التوصيف الطولي. ظهرت مؤخرا العديد من الدراسات التي تسعى إلى استخدام OCT لتحليل السلوك الكروي للورم. في واحدة من أكثر العروض إثارة ، استخدم هوانغ وآخرون OCT للكشف عن النوى الميتة بشكل غير مدمر داخل النماذج الكروية الكبيرة للورم ، مع ملاحظة أن مناطق الخلايا الحية والميتة تمتلك اختلافات ملحوظة في التوهين البصري ، والتي يمكن استخدامها لمراقبة الجدوى الخالية من الملصقات20. وبالمثل ، أجرى هاري وآخرون قياسات معامل الانكسار (RI) لسرطان القولون البشري (HCT116) الكروية التي تم تصويرها باستخدام OCT لدراسة وجود نقص الأكسجة داخل العينات21. لم تكن قياساتهم كافية للاستدلالات المباشرة ، على الرغم من أنهم لاحظوا انخفاض المثيل المحجوز في المواقع التي ترتبط بالموقع ، وإن لم يكن الحجم ، للنوى الميتة ، والتي تم تحديدها لاحقا عن طريق المجهر البؤري. استخدم عبد الصادق وآخرون OCT لتصور وقياس جدوى الأنسجة الإقليمية لنماذج أورام سرطان الثدي22. أبلغوا عن طريقتين قائمتين على OCT لتصور ديناميكيات الأنسجة وأظهروا علاقة معتدلة بين الاختلافات في هذه المقاييس والمناطق المحددة بالفحص المجهري للخلايا الحية / الميتة.

عملنا المنشور باستخدام OCT مبني على هذه الأدبيات السابقة لإنشاء نهج كمي وغير مدمر لقياس مورفولوجيا 3D وعدد الخلايا داخل نماذج سرطان الثدي MCTSs أثناء التطوير10,23. باستخدام برنامج تحليل الصور Imaris 3D لحساب عدد الكائنات بحجم الخلية (أي البقع) التي تم تصويرها ضمن عمليات مسح حجم OCT ، تم قياس عدد الخلايا بشكل غير مدمر في MCTSs التي كانت مشابهة إحصائيا لتلك التي تم تحديدها عبر مقياس الدم عند الانفصال الكلي. ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الهيكلية ل OCT ، فإن أغشية الخلايا التي لا تزال موجودة بعد موت الخلايا عن طريق النخر قد تحسب خطأ على أنها خلايا حية. وعلاوة على ذلك، تم توسيع نطاق هذا التوصيف ليشمل بقاء الخلايا غير المدمرة داخل المجاميع الفردية الخاضعة لنظام دوائي مع نجاح واعد10. الأهم من ذلك ، لوحظ أنه تم الإبلاغ عن صلاحية خلية مماثلة من نهجنا OCT-Imaris مع ما تم قياسه داخل هذه العينات عند الانفصال. يتيح نهج الخلايا غير المدمر والخالي من الملصقات حساب الخلايا داخل هياكل 3D والمجاميع الكثيفة طوليا دون التضحية ببنية البناء / الركام.

يشير هذا العمل إلى نهج محسن لتحديد كثافة الخلايا الإقليمية مباشرة داخل المجاميع الكثيفة من خلال الاستفادة من قدرة OCT-Imaris على قياس كل من مورفولوجيا المجموع 3D وعدد الخلايا. يوفر هذا التقدم المنهجي صورة أكثر تفصيلا للتوزيع المكاني للخلايا وانتشارها داخل الطبقات متحدة المركز المميزة لنماذج MCTSs. بدلا من مجرد حساب المتوسط الكلي لكثافة الخلايا الكلية ، يمكن أن تكشف قياسات الكثافة المحلية هذه عن تدرجات كثافة الخلية ، مثل تلك المرتبطة بالضغط. ويطبق هذا التقييم الإقليمي أيضا على المجاميع المعالجة بالعلاج الكيميائي لتقييم الاستجابة الإقليمية للأدوية، كما تقاس بالتغيرات في كثافة الخلايا المحلية. يوفر هذا المزيج من OCT وطرق تحليل التصوير المتقدمة تقديرا كميا لصلاحية الخلايا الإقليمية ، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف تغلغل الدواء بناء على المناطق التي تشهد انخفاضا في كثافة الخلايا. هذا هو التقرير الأول الذي يحدد بشكل غير مدمر كثافة الخلايا الإقليمية وقابليتها للحياة استجابة للدواء داخل الأنسجة الخلوية الكثيفة وقياسه طوليا. مثل هذا التوصيف لكثافة الخلايا ثلاثية الأبعاد والتوزيع المكاني في جميع أنحاء MCTSs بأكملها قد يساعد في تحسين توصيل الأدوية في علاج السرطان وتحسين فهم تطور نموذج السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام خطوط خلايا سرطان الثدي AU565 (HER2+) و MDA-MB-231 لهذه الدراسة (انظر جدول المواد).

1. إعداد مجاميع الورم

  1. تحضير وسائط نمو خلايا سرطان الثدي AU565 (HER2+) باستخدام معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط قاعدي (+) في L-glutamine مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (v / v) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (انظر جدول المواد).
  2. تحضير وسائط نمو خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية MDA-MB-231 باستخدام وسيط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (v / v) (FBS) ، و 100 U / مل من البنسلين / الستربتومايسين ، و 2 mM من L-glutamine (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد 70٪ -90٪ من مزارع الخلايا المتقاربة من كلا الخطين الخلويين (~ 3-4 أيام من التحضير) في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة نسبية). افصل الطبقات الأحادية للخلايا عن قوارير ثقافتها باتباع طريقة التربسين القياسية.
    ملاحظة: منع التعرض المفرط للخلايا للتريبسين ، مما يؤثر على قدرتها على البقاء.
    1. بالنسبة لخلايا AU565 ، قم بشفط وسائط الخلايا من القارورة باستخدام ماصة (أو ، إذا كان ذلك متاحا ، باستخدام مضخة تفريغ متصلة عبر أنابيب بطرف ماصة زجاجي معقم) واستبدلها ب 2 مل من Trypsin-EDTA. اترك القارورة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم انتقل إلى الحاضنة لمدة 4 دقائق إضافية. بعد ذلك ، أضف 6 مل من وسائط النمو إلى القارورة لتحييد التربسين.
    2. بالنسبة لخلايا MDA-MB-231، قم بشفط وسائط الخلايا من القارورة بنفس الطريقة التي تم تنفيذها في الخطوة 1.3.1 واستبدلها ب 1.5 مل من Trypsin-EDTA. بعد 7 دقائق من الحضانة ، أضف 8.5 مل من وسائط النمو إلى القارورة لتحييد التربسين.
  4. أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى مقياس الدم لتحديد عدد الخلايا في التعليق24. أعد تعليق الخلايا في الوسائط بالتركيز المطلوب من 2.5 × 105 خلايا / مل.
  5. قم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق الخلايا في كل بئر من لوحة مستديرة القاع ، غير ملتصقة ، 96 بئرا. بالنسبة للمعلقات المعدة بدون Matrigel (مصفوفة الغشاء السفلي ، انظر جدول المواد) ، أضف 50 ميكرولتر من وسائط النمو العادي إلى كل بئر.
    1. بالنسبة للمعلقات المعدة باستخدام مصفوفة الغشاء السفلي ، قم بإزالة قارورة المصفوفة من تخزين -20 درجة مئوية وضعها في الثلاجة لتذوب بين عشية وضحاها. قم بإعداد حاوية تحتوي على وسائط نمو ووضعها في الثلاجة لمدة 10 دقائق حتى تبرد.
    2. باستخدام طرف ماصة مجمد ، أضف المصفوفة إلى الوسائط المبردة بحيث يكون التركيز النهائي لهذا المحلول 5٪. أضف 50 ميكرولتر من هذا الوسط إلى كل بئر ، بحيث يكون التركيز النهائي للمصفوفة في هذه الآبار 2.5٪ 3.
      ملاحظة: في العمل السابق ، تم تقييم مورفولوجيا الركام لهذه الخطوط الخلوية10,25 ، ووجد أن مجاميع MDA-MB-231 تشكل كرويات مع إضافة مصفوفة الغشاء ، في حين أن مزارع MDA-MB-231 بدون المصفوفة و AU565 +/- matrix كلها تشكل مجاميع على شكل قرص. تم استخدام كروية كمية من >0.8 على مقياس من 0 (مستوى) - 1.0 (كرة مثالية) لتحديد المجاميع الكروية بما فيه الكفاية وبالتالي من المتوقع أن يكون لها نسبة السطح إلى الحجم المطلوبة للسلوك الشبيه بالجسم الحي 26,27.
  6. قم بالطرد المركزي للألواح عند 123 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد البذر لضمان جمع حبيبات الخلايا في قاع كل بئر.
    ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن بعد البذر. لاحظ المؤلفون أن الكثير من الوقت بين هذه الخطوات يسمح للخلايا بالاستقرار عبر قيعان وجوانب كل بئر ، مما يثبط قدرتها على التجمع والتجميع في قاع البئر.
  7. احتضان الألواح لمدة 4 أيام ، وعند هذه النقطة تعتبر مجاميع الخلايا ناضجة.
    ملاحظة: تتطلب مجاميع AU565 المعدة باستخدام مصفوفة الغشاء السفلي فترة استزراع إضافية مدتها 5 أيام لدراسة الاستجابة للأدوية (إجمالي 9 أيام ، تغيير الوسائط في اليوم 4).

2. إدارة تراستوزوماب (TZM) إلى مجاميع الخلايا AU565

  1. قم بإعداد 500 ميكروغرام / مل من محلول TZM (انظر جدول المواد) في وسائط النمو AU565. في اليوم 4 ، أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر ، بحيث يكون التركيز النهائي داخل كل بئر 50 ميكروغرام / مل.
  2. تجمع الثقافة لمدة 5 أيام إضافية بعد إضافة TZM ويتم تقييمها في النقاط الزمنية الرئيسية.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة ، تم استخدام نقاط زمنية من 0 ساعة (مباشرة قبل التخدير) ، و 24 ساعة ، و 120 ساعة بعد الدواء لتحليل الدواء.

3. التصوير المقطعي بالتماسك البصري

ملاحظة: تم تصوير العينات الواردة هنا باستخدام التصوير المقطعي بالتماسك البصري (OCT) خلال كل يوم من أيام النضج (1-4) ، ثم مرة أخرى في اليوم 5 (24 ساعة بعد إضافة الدواء) واليوم 9 (120 ساعة بعد إضافة الدواء) لمجاميع مخدرة مختارة. تم استخدام نظام تجاري للتصوير المقطعي بالتماسك البصري في مجال الطيف (SDOCT ، انظر جدول المواد) لتصوير OCT للدراسة الحالية. على الرغم من أن هذا النهج قابل لأي نظام OCT تقريبا ، وأن الإجراء المتبع سيكون مشابها بشكل عام بين الأنظمة المختلفة ، إلا أن بعض الخطوات التفصيلية التالية خاصة بالمعدات الحالية.

  1. استخدام نظام OCT للتصوير الهيكلي. اضبط معدل المسح الضوئي A على 5.5 كيلو هرتز لجمع الصور عالية الدقة. اضبط مؤشر الانكسار على 1.33 للعينات في وسط سائل. اضبط حجم voxel على 1.10 × 1.10 × 2.58 ميكرومتر3.
  2. في نافذة معلمات الصورة على الجانب الأيسر من الشاشة، قم بتعيين مجال الرؤية (FOV) عن طريق إدخال قيم X وY وZ (بالملليمتر) بحيث يتم تضمين العينة داخل هذه المنطقة محل الاهتمام.
    ملاحظة: تم تعيين FOV لهذه الدراسات عادة إلى 1.5 × 1.5 × 0.5 مم3. تأكد من أن العينة تتناسب مع هذه المنطقة عن طريق تناوب إدخال "الزاوية" بين 0 و 90 درجة وإجراء تأكيد بصري.
  3. انقر فوق وضع الاستحواذ 3D ، ثم انقر فوق سجل لجمع فحص وحدة التخزين 3D للعينة.

4. تحليل الصور

  1. قم بتصدير ملف OCT إلى تنسيق البرنامج (Imaris، انظر جدول المواد).
    1. افتح الملف OCT في مجموعة أدوات تطوير البرامج. انقر فوق تصدير ، واضبط نوع الملف على .jpg ، وقم بتصدير الصور إلى مجلد فارغ.
    2. افتح برنامج معالجة الصور (FIJI، انظر جدول المواد) واستورد تسلسل الصور من المجلد حيث يتم تخزين ملفات JPEG المصدرة. استخدم برنامجا لربط تسلسل الصورة معا، ثم احفظ هذا الملف كصورة TIFF.
  2. إنشاء إعادة بناء وحدة التخزين باتباع الخطوات أدناه.
    1. افتح Imaris وانتقل إلى ملف TIFF المحول داخل Arena. انتقل إلى تحرير خصائص الصورة > وأدخل حجم voxel (بالميكرومتر) من صورة OCT في مربعات XYZ المقابلة. ثم انقر فوق موافق.
      ملاحظة: داخل شجرة كائن العينة على الجانب الأيسر من الشاشة، قم بإلغاء تحديد علامة التبويب مستوى الصوت لمنع تأخر البرامج.
    2. انقر فوق إضافة أسطح جديدة فوق شجرة الكائنات. في القائمة أسفل الشجرة ، انقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي وقم بالتحرير يدويا. ضمن نافذة ضبط العرض ، حرك السهمين الأحمر والأسود يدويا لتحسين التباين بين العينة والخلفية وتحسين تصور العينة.
    3. اضبط "موضع الشريحة" على الشريحة الموجودة على حافة واحدة من العينة، أي حيث تظهر إشارة العينة لأول مرة. استخدم مفتاح الهروب لتغيير الماوس من وضع التنقل إلى وضع التحديد ، ثم انقر فوق رسم. تتبع المخطط التفصيلي للمنطقة التي تعرض الإشارة يدويا.
    4. تقدم موضع الشريحة عن طريق إدخال الموضع التالي في مربع الإدخال. يجب أن يكون هذا الموضع التالي ≤100 شريحة في العينة أكثر من الموضع السابق. تتبع المنطقة التي تعرض الإشارة يدويا.
    5. كرر الخطوة 4.2.4 عبر سمك العينة حتى يتم الوصول إلى الحافة المقابلة للعينة. ثم انقر فوق إنشاء سطح في القائمة اليسرى لخياطة هذه الشرائح معا وإكمال إعادة بناء وحدة التخزين.
    6. انقر فوق تحرير، ثم انقر فوق تحديد القناع. يؤدي ذلك إلى إنشاء قناة جديدة في نافذة ضبط العرض تحتوي على العينة المعزولة فقط. يمكن الآن العثور على الخصائص المورفولوجية للعينة في علامة التبويب "إحصاءات > تفصيلية ".
      ملاحظة: تم اتباع هذا النهج لتحديد كرويات وأحجام تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة الحالية.
  3. احصل على الكثافة الخلوية الكلية للعينة باتباع الخطوات أدناه.
    1. أعلى شجرة الكائن، حدد إضافة بقع جديدة. في القائمة إعدادات الخوارزمية، قم بإلغاء تحديد جميع المربعات. انقر على السهم الأزرق للانتقال إلى شاشة القناة المصدر.
      1. من القائمة المنسدلة التي تظهر، حدد القناة المقنعة التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.2.8، والتي تسمى عادة القناة 2. أدخل متوسط قطر الخلية للعينة في مربع قطر XY. تأكد من التحقق من طرح الخلفية .
        ملاحظة: بالنسبة لهذا العمل مع خلايا AU565 وMDA-MB-231، تم تعيين القطر إلى 10 ميكرومتر. يعتمد هذا التحديد على حجم الخلية (موضح في قسم المناقشة).
    2. انقر فوق السهم الأزرق للانتقال إلى شاشة تصنيف المواقع . في الرسم البياني في أسفل القائمة، انقر واسحب الحافة اليسرى للعتبة الصفراء إلى الحافة اليسرى للرسم البياني، بحيث يتم تضمين جميع الكائنات في العتبة الصفراء المظللة. ثم انقر فوق السهم الأخضر لإكمال إنشاء البقعة.
    3. احصل على عدد الكائنات المحددة (أي عدد خلايا العينة) بالنقر فوق إحصائيات > إجمالي > إجمالي عدد النقاط.
    4. لتحديد متوسط كثافة الخلايا المجمعة، اقسم عدد خلايا التجميع (مقاسا في الخطوة 4.3.3) على الحجم الكلي (المحدد في الخطوة 4.2.6).
  4. تقييم الكثافة الإقليمية في الطبقات متحدة المركز من الركام الكروي (الشكل 1 ألف).
    1. بعد التحليل المورفولوجي وكثافة الخلايا ، قم بتقييم الكثافة الإقليمية. انقر فوق السطح الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.2.5 وانتقل إلى علامة التبويب نمط/جودة الأسطح . قم بتغيير التحديد إلى نقطة الوسط وقم بتغيير عرض البكسل إلى ≤20 للحصول على أفضل رؤية. انتقل إلى الإحصائيات > موضع > التفصيلي وسجل موقع المركز المركزي.
    2. حدد إضافة إطار مرجعي جديد من القائمة الموجودة أعلى شجرة الكائن. حدد المربعين مرئي وإصلاح بجوار XY في القائمة. انقر واسحب مركز أيقونة الإطار المرجعي بحيث يكون متماشيا مع البقعة المركزية. قم بإلغاء تحديد مربعي XY Visible و Fix وحددهما ل XZ.
      1. مرة أخرى ، انقر واسحب مركز رمز الإطار المرجعي بحيث يتماشى مع البقعة المركزية. أخيرا ، كرر هذا لمستوى YZ ، بالتناوب بين هذه المستويات الثلاثة الثابتة حتى يتوافق الإطار المرجعي تماما مع البقعة المركزية. انقر نقرا مزدوجا فوق الإطار المرجعي في شجرة الكائن وأعد تسميته في الوسط أو ما شابه ذلك.
    3. انقر فوق النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.3 وانتقل إلى الإحصائيات > الإطار المرجعي التفصيلي > الموضع. انقر فوق الموضع X الإطار المرجعي حتى يتم فرزه من أعلى إلى أدنى قيمة. سجل أعلى قيمة - يشير هذا إلى أبعد حافة للعينة ، أي نصف قطر العينة.
      ملاحظة: نظرا لأن العينات المستخدمة هنا دائرية في المستوى XY ، يمكن إجراء الحسابات على طول المحور X أو Y مع نتائج مماثلة. بالنسبة للعينات التي لا تظهر تناظر X-Y (هندسات غير متماثلة ، إهليلجية ، غير منتظمة ، إلخ) ، يوصى بإجراء هذه التحليلات على طول محاور متعددة.
    4. انتقل إلى الإحصاءات. في الزاوية السفلية اليسرى من القائمة ، انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف واحفظ البيانات في جدول بيانات.
    5. قم بإجراء عمليات حسابية يدوية لتحديد الطبقات متحدة المركز على طول المحور X.
      ملاحظة: بلغ قطر العينات المستخدمة في هذه الدراسة حوالي 500 ميكرومتر. وبالتالي ، هناك منطقتان خارجيتان متحدة المركز بسماكة 200 ميكرومتر ومنطقة مركزية داخلية بسماكة 100 ميكرومتر. يوصى بالحفاظ على مناطق بسماكة 200 ميكرومتر لأنه من المتوقع أن تتغير سلوكيات الانتشار على هذه المسافة 7,28,29,30. تمشيا مع هذا المنطق ، يوصى أيضا باستخدام مناطق أكثر مركزية للعينات الأكبر والعكس صحيح للعينات الأصغر.
    6. اضبط منطقة طبقة خارجية مقدارها 200 ميكرومتر بطرح 200 ميكرومتر من نصف القطر الخارجي الموجود في الخطوة 4.4.3. وبالتالي ، ستشمل المنطقة الخارجية بقع ذات مواضع X بيننصف قطر X و Xالخارجي ، الحافة الداخلية (الشكل 1A ، المنطقة البرتقالية).
    7. قم بتعيين منطقة انتقالية عن طريق طرح 200 ميكرومتر من Xالخارجي ، الحافة الداخلية. ستشمل المنطقة الانتقالية نقاطا ذات مواضع X بين X الخارجية ، الداخلية ، و Xالانتقالية ، الداخلية الحافة (الشكل 1A ، المنطقة الوردية).
    8. قم بتعيين منطقة أساسية مركزية تشمل البقع المتبقية بين مركز العينةوالحافة الانتقالية X الداخلية (الشكل 1A ، المنطقة الزرقاء).
    9. افتح ملف جدول البيانات المحفوظ الذي تم إنشاؤه في الخطوة 4.4.4. انتقل إلى علامة التبويب المسافة من الإطار المرجعي الأصلي.
    10. احسب عدد البقع في المنطقة الأساسية باستخدام الدالة" COUNTIF (العمود x، "< Xالانتقالي، الحافة الداخلية")، حيث العمودx هو عمود "المسافة من الإطار المرجعي الأصلي". القيمة الناتجة هي رقم الخلية في هذه المنطقة. اقسم هذه القيمة على حجم المنطقة للحصول على كثافة الخلية.
    11. بطريقة مماثلة ، احسب عدد الخلايا في المنطقة الانتقالية باستخدام "COUNTIF (العمود x ، "< Xالخارجي ، الحافة الداخلية") - COUNTIF (العمودx ، "> Xانتقالي ، داخلي الحافة").
    12. احسب عدد الخلايا في المنطقة الخارجية باستخدام "COUNTIF (العمودx، "> Xالانتقالي، الحافة الداخلية").
  5. تقييم كثافة الخلايا الإقليمية في العينات غير الكروية عبر "المقابس الإقليمية" (الشكل 1B).
    ملاحظة: بالنسبة للعينات غير الكروية التي لا تحتوي على طبقات متحدة المركز، تم تطوير طريقة "القابس الإقليمي" لأخذ عينات من كثافة الخلايا المحلية على أعماق شعاعية مختلفة في جميع أنحاء الركام.
    1. كرر الخطوات 4.4.1-4.4.3 لتعيين الإطار المرجعي المركزي (الشكل 1B، الدائرة الصفراء المركزية) والحصول على نصف قطر العينة الإجمالي.
    2. إجراء حسابات يدوية لتحديد موضع الإطارات المرجعية داخل المناطق الانتقالية والخارجية بحيث يمكن تقييم كثافة الخلايا في العينة في هذه المواقع.
      1. لحساب الموقع الخارجي، اطرح 50 ميكرومتر من قيمة نصف قطر العينة من الخطوة 4.5.1 واستخدم هذه القيمة كموضع X.
        ملاحظة: استخدم نفس قيم الموضع Y وZ المسجلة في الخطوة 4.5.1 لجميع المقابس داخل عينة معينة لقياس كثافة الخلايا على طول المحور X للعينة (الشكل 1B، الدائرة الصفراء في أقصى اليسار).
      2. فوق شجرة الكائن ، انقر فوق إضافة بقع جديدة وانقر فوق تخطي الإنشاء التلقائي ، تحرير يدويا. باستخدام المؤشر في وضع "التحديد" ، اضغط باستمرار على shift + انقر لوضع نقطة على الشاشة. في القائمة اليمنى، أدخل قيم موضع XYZ المحسوبة أعلاه. اضبط أقطار XY وZ على ≤20 للحصول على أفضل رؤية.
      3. كرر الخطوة 4.4.2 لإضافة إطار مرجعي في موقع التركيز هذا. أعد تسمية هذا الإطار المرجعي في شجرة الكائن الخارجية أو ما شابه ذلك.
      4. لحساب الموقع الانتقالي (نقطة الوسط)، أوجد متوسط قيمة موضعمركز X وقيم الموضعالخارجي X. استخدم هذه القيمة كموضع X للإطار المرجعي الانتقالي. كما هو موضح أعلاه، استخدم نفس قيم Y وZ المسجلة في الخطوة 4.5.1 لجميع المقابس داخل عينة معينة لقياس كثافة الخلايا على طول المحور X للعينة (الشكل 1B، الدائرة الصفراء الوسطى).
      5. كرر الخطوة 4.4.2 لوضع الإطار المرجعي الأوسط في هذا الموقع، مع إعادة تسميته "انتقالي" أو ما شابه ذلك بمجرد إنشائه.
    3. انقر على النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.3 وانتقل إلى الإحصاءات. في الزاوية السفلية اليسرى من القائمة ، انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى ملف واحفظ البيانات في جدول بيانات.
    4. افتح جدول البيانات. انتقل إلى علامة التبويب المسافة من الإطار المرجعي الأصلي. تظهر مسافة كل كائن إلى الإطارات المرجعية في العمود A، ويظهر تجميع الإطارات المرجعية لكل كائن في العمود G. استخدم الدالة "MOD" لتعيين كل مسافة رقميا إلى إطارها المرجعي المقابل، حيث 0 هو الإطار المركزي، و 1 هو الانتقالي، و 2 هو الخارجي.
    5. قم بتصفية القيم في هذا العمود للعمل مع المسافات في كل إطار مرجعي. لكل إطار من الإطارات المرجعية، احسب عدد الكائنات داخل 50 ميكرومتر من الإطار باستخدام الدالة "COUNTIF (العمود x، "≤50")، حيث العمودx هو عمود "المسافة من الإطار المرجعي الأصلي" لكل مجموعة. تتوافق القيمة الناتجة مع عدد الخلايا في هذا القابس الإقليمي. اقسم هذه القيمة على حجم القابس 100 ميكرومتر للحصول على كثافة الخلية.
  6. قم بإجراء طريقة التوصيل الإقليمي المكرر مكانيا (الشكل 1C).
    ملاحظة: استخدم هذا النهج لتقييم جدوى الخلايا الإقليمية استجابة لتطبيق الدواء. يؤدي تضمين المزيد من الإطارات المرجعية إلى تحسين دقة كثافات الخلايا التي يمكن حسابها في جميع أنحاء سمك النموذج.
    1. كرر الخطوات 4.4.1-4.4.3 لتعيين الإطار المرجعي المركزي (الشكل 1C، الدائرة الصفراء المركزية) والحصول على نصف قطر العينة.
    2. قم بإجراء حسابات يدوية لتحديد مواقع إضافية ذات أهمية. للقيام بذلك، أضف 100 ميكرومتر إلى قيمةمركز X، ثم استخدم قيم Y و Z لنقطة المركز لتحديد الموقع الأول على طول محور المركز. أضف إطارا مرجعيا إلى هذا الموضع كما في الخطوة 4.4.2 (الشكل 1C، دائرة صفراء مجاورة للدائرة المركزية).
      ملاحظة: أضف ميكرومتر أقل في هذه الخطوة إذا كنت تبحث عن تتبع كثافة دقة أعلى.
    3. كرر الخطوات 4.6.2، مع إضافة 100 ميكرومتر (أو العدد المطلوب من ميكرومتر) إلى كل موقع X متسلسل لإنشاء محور من المقابس المتباعدة بالتساوي من خلال سمك العينة. ضع الإطار المرجعي الأخير على بعد ≤50 ميكرومتر من نصف القطر الخارجي للعينة (الشكل 1C، الدوائر الصفراء).
    4. كرر الخطوات 4.5.3-4.5.5 للحصول على عدد الخلايا داخل كل قابس قطره 100 ميكرومتر. اقسم هذه القيم على حجم كل قابس مقابل للحصول على كثافة الخلايا المحلية.
    5. كرر جميع الخطوات الواردة في هذا القسم للحصول على بيانات OCT التي تم جمعها في كل نقطة زمنية من تجربة الدواء. يجب أن تكشف مقارنة عدد الخلايا في كل موقع من خلال الدورة الزمنية للعلاج عن المكان الذي تتناقص فيه كثافة الخلايا (أي المناطق التي تعاني من موت الخلايا) ، وبالتالي مدى عمق اختراق الدواء (أي الطبقات التي تشهد انخفاضا في كثافة الخلايا مقابل تلك التي تحافظ على مستويات كثافة الخلايا أو تعرضها زيادة).

figure-protocol-1
الشكل 1: رسم توضيحي تخطيطي . (أ) نهج الطبقة متحدة المركز (الأصداف) لتقييم كثافة الخلايا الإقليمية في المجاميع الكروية. (ب) تم تطوير طريقة القابس الإقليمية لتقييم كثافة الخلايا المحلية في المجاميع غير الكروية، حيث تستخدم المقابس الكروية الصغيرة (قطرها 100 ميكرومتر) (الموضحة باللون الأصفر) كمؤشرات كثافة في كل منطقة/سمك. (ج) تستخدم طريقة القابس الإقليمية المكررة مكانيا في دراسات تغلغل العقاقير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في منشور سابق ، تم إنشاء طريقة للقياس غير المدمر لكثافة الخلايا العالمية داخل المجاميع الخلوية باستخدامOCT 10. هنا ، يتم توسيع هذه التقنية لتقييم كثافة الخلايا الإقليمية لمجاميع الخلايا النامية. يوضح الشكل 1 مخططا لهذا الامتداد، حيث يمكن تقييم كثافة الخلايا في طبقات متحدة المركز من كروي أو أكثر محليا من خلال النظر بدلا من ذلك إلى المقابس الكروية الصغيرة (قطرها 100 ميكرومتر)، والتي يشار إليها بالدوائر الصفراء في الشكل 1B,C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اهميه
الكرويات الورم متعدد الخلايا (MCTSs) هي نماذج قوية ثلاثية الأبعاد في المختبر لدراسة تطور الورم وفحص المخدرات1،2،3. يعتمد تطوير فائدة هذه النماذج الإجمالية البسيطة نسبيا بشكل كبير على توصيف سماتها الرئيسية ، مثل التشكل وكثافة الخلايا ، والتي من المعروف أنها تؤثر على كل من تطور نموذج الورم والاستجابة العلاجية. ومع ذلك، فإن حجمها المطلوب يطرح تحديات في تقييم هذه الخصائص، وخاصة بالنسبة للتحليلات غي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R01 BRG CA207725 (MB / DTC) و NIH R01 CA233188 (MB). نود أن نشكر صيدلية AMC على Trastuzumab المقدمة لهذه التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 لوحة بئرGreiner Bio-One 650970CellStar CellStar Cell Cell Cell Surface ، https://shop.gbo.com/en/usa/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-repellent-surface/
0.25٪ تريبسين ، 2.21 ملي مولار EDTACorning25-053-CI
AU565 خلايا سرطان الثديATCC
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning 10-013-CV
مصل الأبقار الجنينيةATCC30-2020
برنامج فيجيمفتوح المصدر(فيجي فقط) ImageJ v2.1 / 1.5.3jتم التنزيل من https://imagej.net/software/fiji/
الدمFisher Scientific0267151B
برنامج تحليل الصور ImarisBitplaneالإصدار الحالي 9.8
L-glutamineLonza17-605E
Matrigelكورنينج354263
MDA-MB-231 خلايا سرطان الثديATCC
مجهرزايسZ1 AxioVision
بنسيلين ستربتومايسينكورنينج30-0002CI
جهاز طرد مركزي لوحEppendorf
RPMI متوسط 1640جيبكو11875-085
المجال الطيفي التصوير المقطعي للتماسك البصريThorLabsTEL220C1
قوارير ثقافة الخلايا T75Greiner Bio-One 658175
تم استخدام عينات سريرية من Trastuzumab Remnant من Trastuzumab في هذه الدراسة ، وهي موهوبة بسخاء من قبل صيدلية كلية الطب في ألباني.
مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutherland, R., JA, M., Inch, W. Growth of multicell spheroids in tissue culture as a model of nodular carcinomas. Journal of the National Cancer Institute. 46 (1), 113-120 (1971).
  2. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  3. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Analytical Biochemistry. 437 (1), 17-19 (2013).
  4. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
  5. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  6. Jiang, Y., Pjesivac-Grbovic, J., Cantrell, C., Freyer, J. P. A multiscale model for avascular tumor growth. Biophysical Journal. 89 (6), 3884-3894 (2005).
  7. Freyei, J. P., Sutherland, R. M. Regulation of growth saturation and development of necrosisin EMT6/R0 multicellular spheroids by the glucose and oxygen supply. Cancer Research. 46 (7), 3504-3512 (1986).
  8. Desoize, B., Jardillier, J. C. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical Reviews in Oncology Hematology. 36 (2-3), 193-207 (2000).
  9. Mellor, H. R., Ferguson, D. J. P., Callaghan, R. A model of quiescent tumour microregions for evaluating multicellular resistance to chemotherapeutic drugs. British Journal of Cancer. 93 (3), 302-309 (2005).
  10. Roberge, C. L., et al. Non-destructive tumor aggregate morphology and viability quantification at cellular resolution, during development and in response to drug. Acta Biomaterialia. 117, 322-334 (2020).
  11. Piccinini, F., Tesei, A., Bevilacqua, A. Single-image based methods used for non-invasive volume estimation of cancer spheroids a practical assessing approach based on entry-level equipment. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 135, 51-60 (2016).
  12. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  13. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 1-13 (2018).
  14. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7 (9), 819-830 (2012).
  15. Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integrative Biology. 3 (1), 31-38 (2011).
  16. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  17. Huang, D., et al. Optical coherence tomography HHS public access. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  18. Zhong, H. Q., et al. Enhancement of permeability of glycerol with ultrasound in human normal and cancer breast tissues in vitro using optical coherence tomography. Laser Physics Letters. 7 (5), 388-395 (2010).
  19. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), (2016).
  20. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  21. Hari, N., Patel, P., Ross, J., Hicks, K., Vanholsbeeck, F. Optical coherence tomography complements confocal microscopy for investigation of multicellular tumour spheroids. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  22. El-Sadek, I. A., et al. Three-dimensional dynamics optical coherence tomography for tumor spheroid evaluation. Biomedical Optics Express. 12 (11), 6844(2021).
  23. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3D bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomateralia. 95, 357-370 (2019).
  24. Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
  25. Roberge, C. L., Rudkouskaya, A., Barroso, M., Corr, D. T. Longitudinal, label-free assessment of cell density and viability in multicellular tumor spheroids via optical coherence tomography. Summer Biomechanics, Bioengineering, and Biotransport Conference. , (2020).
  26. Bellotti, C., Duchi, S., Bevilacqua, A., Lucarelli, E., Piccinini, F. Long term morphological characterization of mesenchymal stromal cells 3D spheroids built with a rapid method based on entry-level equipment. Cytotechnology. 68 (6), 2479-2490 (2016).
  27. Noto, A., et al. Stearoyl-CoA desaturase-1 is a key factor for lung cancer-initiating cells. Cell Death & Disease. 4 (12), 947(2013).
  28. Riffle, S., Hegde, R. S. Modeling tumor cell adaptations to hypoxia in multicellular tumor spheroids. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 36, 102(2017).
  29. Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11, 393-410 (2011).
  30. Grimes, D. R., Kelly, C., Bloch, K., Partridge, M. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids. Journal of the Royal Society Interface. 11 (92), 20131124(2014).
  31. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  32. Pozzi, S., et al. Meet me halfway: Are in vitro 3D cancer models on the way to replace in vivo models for nanomedicine development. Advanced Drug Delivery Reviews. 175, 113760(2021).
  33. Nguyen, E. H., Daly, W. T., Belair, D. G., Le, N. N., Murphy, W. L. High throughput screening format identifies synthetic mimics of matrigel for tubulogenesis screening. , Available from: https://abstracts.biomaterials.org/data/papers/2015/abstracts/547.pdf (2015).
  34. Duchnowska, R., Szczylik, C. Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treatment Reviews. 31 (4), 312-318 (2005).
  35. Zazo, S., et al. Generation, characterization, and maintenance of trastuzumab-resistant HER2+ breast cancer cell lines. American Journal of Cancer Research. 6 (11), 2661-2678 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Trastuzumab

مقالات ذات صلة