يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية

3.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/64053

⸱

يوليو 13, 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية.

الملخص

مع انخفاض كثافة المعادن في العظام ، تكون العظام أكثر عرضة للكسر ، مما يؤثر سلبا على نوعية حياة المريض. يتم تنظيم نمو وتطور العظام بشكل رئيسي بواسطة الخلايا العظمية والخلايا الآكلة للعظام. وقد تم قبوله على نطاق واسع أن الخلايا العظمية الخلية مشتقة من خلايا البلاعم وحيدة الخلايا العظمية (BMMs). توجد BMMs وغيرها من الخلايا الجذعية المكونة للدم في تجويف نخاع العظام. لذلك ، فإن عزل BMMs المستقرة الواحدة من مجموعات الخلايا المختلفة وغير المتجانسة يمثل تحديا كبيرا. هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية. تم جمع الخلايا الملتصقة المستزرعة لمدة 24-48 ساعة في الثقافة الأولية. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 37.94٪ من الخلايا كانت CD11b / c + (مستضد سطح البلاعم الأحادي). أظهر تلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP) وتحليل اللطخة الغربية أن BMMs يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية في المختبر. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أنه يمكن اعتبار خلايا الالتصاق الثانوية نموذجا خلويا مناسبا لأبحاث تمايز الخلايا العظمية.

المقدمة

وقد أفيد أن خلايا سلالة البلاعم الأحادية الموجودة في نخاع العظم يمكن أن تتمايز إلى خلايا وحيدة الدم والبلاعم النسيجية 1,2. تستخدم الخلايا المذكورة أعلاه ، والتي يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية لتحقيق التوازن بين نمو العظام وتطورها ، كنموذج خلوي لحث الخلايا على الخلايا العظمية في الجسم الحي 3,4. نخاع العظم هو نسيج خاص يحتوي على عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، والتي تشمل على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، وخلايا البلاعم أحادية الخلايا (BMMs) ، والخلايا الجذعية المكونة للدم ، والخلايا البطانية ، والخلايا المناعية. في الواقع ، أشارت العديد من الدراسات السابقة إلى أن الخلايا الملتصقة التي خرجت من تجويف نخاع العظم للعظم الطويل يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية أو خلايا عظمية أو خلايا غضروفية أو خلايا دهنية5،6،7،8. على الرغم من استخدام طرق عزل وزراعة مختلفة لإنتاج مجموعات خلايا متجانسة مختلفة ، إلا أنه لا تزال هناك تحديات كبيرة في عزل وزراعة BMMs من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المختلفة.

تم تطوير عدة طرق لاستخراج البلاعم أحادية النواة في نخاع العظم (BMSCs). ومع ذلك ، فإن غالبية هذه الطرق معقدة9،10،11. على سبيل المثال ، يتطلب الطرد المركزي لتدرج الكثافة مجموعة متخصصة وتستغرق العملية وقتا طويلا ومرهقة. هذه الطريقة مناسبة لعزل BMMs من عينات الدم كبيرة الحجم ، ولكن ليس من عينات نخاع العظم9،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخراج عينات الأنسجة باستخدام هضم الكولاجيناز هو إجراء معقد ويستغرق وقتا طويلا. لا ينصح بهذه الطريقة لعزل BMMs من عينات نخاع العظم14,15. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن فصل التدفق يمكن أن يؤدي إلى مجموعات أحادية / بلاعم عالية النقاء ، إلا أنه يتطلب أحجام عينات كبيرة جدا ومتطلبات عالية من الأدوات والمعدات10,16. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طريقة إثراء الميكروبيدات مكلفة للغاية وغير مجدية في مختبر عام17.

لذلك ، في الدراسة الحالية تم اقتراح طريقة مريحة وسريعة ورخيصة لعزل البلاعم أحادية النواة عن نخاع العظام. تم استخدام خلايا نخاع العظم الملتصقة بنقاط زمنية مختلفة لعزل BMMs باستخدام طريقة الالتصاق الثانوية. يمكن أن تحفز BMMs المستخرجة بالطريقة المذكورة أعلاه على تكوين الخلايا العظمية في المختبر ، وبالتالي توفير نموذج خلية بسيط ومريح للدراسة المستقبلية لهشاشة العظام في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية للتجارب على الحيوانات الصادرة عن مركز البحوث الحيوانية المختبرية بجامعة تشجيانغ الطبية الصينية (رقم الموافقة: IACUC-20181029-11).

1. استخراج الخلايا

  1. ضع فئران Sprague-Dawley (فئران SD ، عمرها 1-10 أيام ، ذكورا أو إناثا) في أقفاص القتل الرحيم المليئة بثاني أكسيد الكربون2 بمعدل متوازن يتراوح بين 30٪ و 70٪ من حجم الحاوية / الدقيقة. بعد أن تفقد الفئران وعيها (20-60 دقيقة) ، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم لضمان موت غير مؤلم.
  2. اغمر الفئران في الكحول بنسبة 75٪ لمدة 10 دقائق للتطهير.
  3. قم بإزالة جميع أطراف الفئران بعناية باستخدام المقص والملقط ، وقم بالشفط باستخدام PBS باستخدام ماصة واغسل الدم الملتصق بالأطراف.
  4. أضف 5 مل من محلول البنسلين / الستربتومايسين إلى 500 مل من DMEM واخلطه جيدا. خذ أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل ، وأضف 5 مل من FBS و 45 مل من وسط DMEM ، واخلطه جيدا للحصول على 10٪ FBS DMEM يحتوي على محلول البنسلين / الستربتومايسين بنسبة 1٪. أضف 2 مل من وسط الثقافة أعلاه إلى أنبوب 5 مل.
  5. انقل عظام الأطراف إلى أنبوب 5 مل. استخدم المقص لقطع عظام الأطراف في الأنبوب إلى قطع صغيرة (1-3 مم) وخلط المتجانس لإعادة تعليق خلايا نخاع العظم في وسط الزرع. قف لمدة 5 دقائق حتى تستقر شظايا الأنسجة في قاع الأنبوب.
  6. أضف 10 مل من 10٪ FBS DMEM إلى طبق استزراع 100 مم، ثم انقل السوبرناتانت إلى طبق الثقافة. عند شفط السوبرناتانت ، تجنب نقل حطام الأنسجة إلى طبق الثقافة.
  7. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة تقريبا. بعد وقت الحضانة هذا ، سوف تلتصق غالبية الخلايا الجذعية الوسيطة بجدار طبق الاستزراع وتنمو ببطء ، في حين أن معظم BMMs ستظل معلقة في وسط الاستزراع.
  8. انقل تعليق الخلية في طبق الاستزراع 100 مم إلى قارورة جديدةبحجم 25 سم 2 واستمر في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة إضافية. قم بإزالة الوسط القديم بعناية واستبدله بوسط جديد بعد التصاق BMMs بجدار القارورة.
  9. الثقافة الفرعية عندما وصلت الخلايا الموجودة في القارورة إلى 80٪ -90٪ من التقاء.
    ملاحظة: تم استزراع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. خلال الثقافة ، تم توحيد مورفولوجيا الخلية تدريجيا. كانت الخلايا كبيرة ، غير منتظمة الشكل ، تنمو شعاعيا وتعلق على القارورة في شكل قرص ، حيث يمكن ملاحظة نوى متعددة.

2. تلطيخ FACS للخلية

  1. هضم التربسين باستخدام 1-2 مل من التربسين التجاري عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق وعد الخلايا الملتصقة الثانوية لضمان عدد الخلايا النهائي من 100000 / عينة (عد الخلايا مع مقياس الدم Neubauer).
  2. قسم الخلايا إلى ثلاث مجموعات (500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 100000 خلية): (1) المجموعة الضابطة الفارغة التي تحتوي على خلايا غير ملطخة. (2) المجموعة الضابطة المتساوية النمط ؛ و (3) المجموعة التجريبية (تلطيخ CD11b/c).
  3. احتضان الأجسام المضادة الأولية (لا يوجد جسم مضاد لمجموعة التحكم الفارغة ؛ التحكم في النمط المتماثل المضاد CD11 لمجموعة التحكم في النمط المتماثل ، 0.6 ميكرولتر من الأجسام المضادة / العينة ، 1 ميكروغرام / عينة ؛ مضاد CD11b / c للمجموعة التجريبية ، 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة / العينة ، 1 ميكروغرام / عينة) على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. جهاز طرد مركزي في 300-350 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق الخلايا مع 500 ميكرولتر من PBS. كرر الإجراء أعلاه مرة واحدة للتأكد من غسل الأجسام المضادة الأولية غير المقيدة.
  5. احتضان الجسم المضاد الثانوي المقابل (لا يوجد جسم مضاد لمجموعة التحكم الفارغة ؛ الماعز المضاد للأرانب IgG للتحكم في النمط المتماثل والمجموعات التجريبية ، 0.25 ميكرولتر من الأجسام المضادة / العينة ، 1: 2000) على الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  6. جهاز طرد مركزي في 300-350 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant ، وأعد تعليق الخلايا مع 500 ميكرولتر من PBS. كرر الإجراء المذكور أعلاه مرة واحدة للتأكد من غسل الأجسام المضادة الثانية غير المقيدة.
  7. الكشف عن الخلايا الإيجابية CD11b / c عن طريق قياس التدفق الخلوي (10000 خلية / عينة) وتحليل البيانات عن طريق البرنامج (على سبيل المثال ، FlowJo 7.5).
    ملاحظة: للحصول على النسبة المئوية النهائية لخلايا CD11b/c+ ، تم استخدام الصيغة التالية: النسبة المئوية لخلايا CD11b / c + في المجموعة التجريبية - النسبة المئوية لخلايا CD11 + في المجموعة الضابطة isotype.

3. رايت جيمسا تلطيخ

  1. زرع الخلايا الثانوية الملتصقة التي تم تمريرها ثلاث مرات على صفائح تسلق الخلايا 35 مم 2 (1 × 106 خلايا / بئر) وزرعها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  2. تخلص من وسط الثقافة واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS.
  3. أضف محلول صبغة Wright-Giemsa (0.5 مل - 0.8 مل) إلى ورقة تسلق الخلية لمدة 1 دقيقة.
  4. امزج الصبغة بالماء المقطر (0.5 مل-0.8 مل) مع قطعة قطن ، والوقوف لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل محلول الصبغة بالماء المقطر ، ثم جففه لمدة 1-3 دقائق. مراقبة تحت المجهر.

4. فخ تلطيخ

  1. زرع الخلايا الثانوية الملتصقة التي تم تمريرها ثلاث مرات على صفائح تسلق الخلايا 35 مم 2 (1 × 106 خلايا / بئر) وزرعها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.
  2. استبدل الوسط القديم ب 10٪ FBS DMEM أو وسيط تحريض osteoclast مكمل بمنشط مستقبلات 50 نانوغرام / مل من رباط العامل النووي κB (RANKL) و 30 نانوغرام / مل من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ، والاستزراع عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 7 أيام إضافية.
  3. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام مجموعة تلطيخ TRAP وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وراقبها تحت المجهر.
    ملاحظة: تم تعريف الخلايا الإيجابية TRAP على أنها الخلايا العظمية ، والتي كانت أرجوانية تحت المجهر الضوئي. تم قياس عدد الخلايا الموجبة TRAP باستخدام برنامج ImageJ.

5. لطخة غربية

  1. زرع الخلايا الثانوية الملتصقة التي تم تمريرها ثلاث مرات على 35 مم2 أوراق تسلق الخلايا (1 × 106 خلايا / بئر) وزرع لمدة 24 ساعة.
  2. استبدل الوسط القديم ب 10٪ FBS DMEM أو وسيط تحريض osteoclast (50 نانوغرام / مل من RANKL و 30 نانوغرام / مل من M-CSF) والاستزراع لمدة 7 أيام إضافية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  3. استخراج البروتينات الخلوية الكلية مع المخزن المؤقت RIPA ، منفصلة بنسبة 10 ٪ SDS-PAGE ، ونقلها إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين18,19.
  4. يوضع المزيج مع 5٪ من مسحوق الحليب الخالي من الدسم (25 مل) لمدة 2 ساعة ويغسل ثلاث مرات ، لمدة 10 دقائق في كل مرة ، باستخدام TBS-Tween 20 (TBST).
  5. احتضن الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (مضاد β-أكتين ، مضاد TRAP ، ومضاد للكاثيبسين K ؛ تم تخفيف جميع الأجسام المضادة الأولية 1: 1000 ، 10 مل من الأجسام المضادة المخففة / الشريط) ، واغسلها ثلاث مرات باستخدام TBST.
  6. احتضان الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للأرانب IgG ، تخفيف 1: 2000 ، 10 مل من الأجسام المضادة المخففة / الشريط) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة ، وغسل ثلاث مرات مع TBST. تصور نطاقات البروتين باستخدام حل متطور.
    ملاحظة: تم تطبيع مستويات التعبير عن البروتينات المذكورة أعلاه إلى β الأكتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كان عدد الخلايا الملتصقة الثانوية مستقرا وموحدا. مع الانتشار المستمر للخلايا ، أصبحت غالبية الخلايا أكبر ، مع شكل غير منتظم ونمت لتصبح قرصا ملتصقا شعاعيا (الشكل 2C ، D). أظهر قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن CD11b / c ، وهي علامة جزيئية على سطح خلايا سلالة البلاعم الأحادية ، كانت حوالي 37.94٪ (الشكل 2A ، B). لمزيد من التحقق من أن الخلايا الإيجابية CD11b / c كانت خلايا سلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخلايا العظمية هي واحدة من أهم أنواع الخلايا المشاركة في حدوث وتطور أمراض العظام ، وكذلك واحدة من الأشياء الأساسية لأبحاث أمراض العظام20. يمكن أن تتمايز الخلايا الأحادية / البلاعم إلى خلايا عظمية. نظرا لأن البلاعم أحادية النواة (خلايا RAW264.7) مكلفة للغاية ويمكن تنشيطها بسهولة أثناء الزراعة ، فمن الصعب إجراء تجارب تمايز في المختبر باستخدام خط الخلايا هذا. على الرغم من أنه تم تطوير عدة طرق لاستخراج الخلايا الوحيدة / البلاعم من نخاع العظام ، بما في ذلك الطرد المركزي لتدرج الكثافة ، وهضم ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (رقم المنحة. LY19H060001) ومشروع خطة تشجيانغ للعلوم والتكنولوجيا الصينية التقليدية (رقم 2022ZB093).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
35 مم < سوب > 2 < / سوپ > شرائح تسلق الخلاياNEST التكنولوجيا الحيوية80102
مكافحة القسطرة KAbcamab190271: 1،000
التحكم في النمط المتشاوي المضاد ل CD11Abcamab1727301 & mu ؛ ز / اختبار ، 1.675 مجم / مل
مضاد CD11b / جأبسينABS124232  ؛ 1 & مو ؛ ز / اختبار ، 1 مجم / مل
مضاد للفخAbcamab1914061: 1،000
مضاد بيتا ؛ أكتينBeyotime  ؛ AF50031: 1,000
شرائح تسلق الخلاياNEST التكنولوجيا الحيوية80102
طبق زراعة الخلاياcorning 430167
قارورة زراعة الخلايا430168
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)جيبكوC11995500BT
مصل بقري الجنين (FBS)جيبكو10099141C
الماعز المضادة للأرانب IgGAbcamab150077ل IF ، 1: 2,000
الماعز المضادة للأرانب IgGAbcamab6721ل WB ، 1: 2,000
M-CSFPepro tech400-28
PBSBiosharpBL302A
RANKLPepro tech400-30
SD الفئرانشنغهاي SLAC مختبر المحدودة1-10 أيام
مجموعة تحضير جل SDS-PAGESolarbioP1200
TRAP / ALP طقم تلطيخواكو294-67001
حل التربسين-EDTABiosharpBL512A
حل رايت-جيمساKeygen BiotechKGA225-1

المراجع

  1. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
  2. Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity. Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).
  3. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  4. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  5. Zhou, X., et al. Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells. Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).
  6. Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).
  7. Li, Z., MacDougald, O. A. Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity. Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).
  8. Horowitz, M. C., et al. marrow adipocytes. Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).
  9. Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice. Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).
  10. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).
  11. Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies. Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).
  12. Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).
  14. Yu, Y. R., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).
  15. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes. Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).
  16. Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).
  17. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  18. Higashi, S. L., et al. Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology. Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).
  19. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).
  20. Yin, Z., et al. Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways. European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).
  21. Liu, F., et al. LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss. Redox Biology. , (2021).
  22. Jin, X., et al. Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways. Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

TRAP
عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.