هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل خلايا سلالة البلاعم أحادية الخلية عن عظام الفئران بطريقة الالتصاق الثانوية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مع انخفاض كثافة المعادن في العظام ، تكون العظام أكثر عرضة للكسر ، مما يؤثر سلبا على نوعية حياة المريض. يتم تنظيم نمو وتطور العظام بشكل رئيسي بواسطة الخلايا العظمية والخلايا الآكلة للعظام. وقد تم قبوله على نطاق واسع أن الخلايا العظمية الخلية مشتقة من خلايا البلاعم وحيدة الخلايا العظمية (BMMs). توجد BMMs وغيرها من الخلايا الجذعية المكونة للدم في تجويف نخاع العظام. لذلك ، فإن عزل BMMs المستقرة الواحدة من مجموعات الخلايا المختلفة وغير المتجانسة يمثل تحديا كبيرا. هنا نقدم بروتوكولا لعزل BMMs عن الفئران SD ، يسمى طريقة الالتزام الثانوية. تم جمع الخلايا الملتصقة المستزرعة لمدة 24-48 ساعة في الثقافة الأولية. أظهر تحليل التدفق الخلوي أن ما يقرب من 37.94٪ من الخلايا كانت CD11b / c + (مستضد سطح البلاعم الأحادي). أظهر تلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP) وتحليل اللطخة الغربية أن BMMs يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية في المختبر. تشير النتائج المذكورة أعلاه إلى أنه يمكن اعتبار خلايا الالتصاق الثانوية نموذجا خلويا مناسبا لأبحاث تمايز الخلايا العظمية.
المقدمة
وقد أفيد أن خلايا سلالة البلاعم الأحادية الموجودة في نخاع العظم يمكن أن تتمايز إلى خلايا وحيدة الدم والبلاعم النسيجية 1,2. تستخدم الخلايا المذكورة أعلاه ، والتي يمكن أن تتمايز إلى خلايا عظمية لتحقيق التوازن بين نمو العظام وتطورها ، كنموذج خلوي لحث الخلايا على الخلايا العظمية في الجسم الحي 3,4. نخاع العظم هو نسيج خاص يحتوي على عدة أنواع مختلفة من الخلايا ، والتي تشمل على سبيل المثال لا الحصر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، وخلايا البلاعم أحادية الخلايا (BMMs) ، والخلايا الجذعية المكونة للدم ، والخلايا البطانية ، والخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب في هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية للتجارب على الحيوانات الصادرة عن مركز البحوث الحيوانية المختبرية بجامعة تشجيانغ الطبية الصينية (رقم الموافقة: IACUC-20181029-11).
1. استخراج الخلايا
- ضع فئران Sprague-Dawley (فئران SD ، عمرها 1-10 أيام ، ذكورا أو إناثا) في أقفاص القتل الرحيم المليئة بثاني أكسيد الكربون2 بمعدل متوازن يتراوح بين 30٪ و 70٪ من حجم الحاوية / الدقيقة. بعد أن تفقد الفئران وعيها (20-60 دقيقة) ، قم بالقتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم لضمان موت غير مؤلم.
- اغمر الفئران في الكحول بنسبة 75٪ لمدة 10 دقائق للتطهير.
- قم بإزالة جميع أطراف الفئران بعناية با....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كان عدد الخلايا الملتصقة الثانوية مستقرا وموحدا. مع الانتشار المستمر للخلايا ، أصبحت غالبية الخلايا أكبر ، مع شكل غير منتظم ونمت لتصبح قرصا ملتصقا شعاعيا (الشكل 2C ، D). أظهر قياس التدفق الخلوي أن النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن CD11b / c ، وهي علامة جزيئية على سطح خلايا سلالة البلاعم الأحادية ، كانت حوالي 37.94٪ (الشكل 2A ، B). لمزيد من التحقق من أن الخلايا الإيجابية CD11b / c كانت خلايا سلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخلايا العظمية هي واحدة من أهم أنواع الخلايا المشاركة في حدوث وتطور أمراض العظام ، وكذلك واحدة من الأشياء الأساسية لأبحاث أمراض العظام20. يمكن أن تتمايز الخلايا الأحادية / البلاعم إلى خلايا عظمية. نظرا لأن البلاعم أحادية النواة (خلايا RAW264.7) مكلفة للغاية ويمكن تنشيطها بسهولة أثناء الزراعة ، فمن الصعب إجراء تجارب تمايز في المختبر باستخدام خط الخلايا هذا. على الرغم من أنه تم تطوير عدة طرق لاستخراج الخلايا الوحيدة / البلاعم من نخاع العظام ، بما في ذلك الطرد المركزي لتدرج الكثافة ، وهضم ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (رقم المنحة. LY19H060001) ومشروع خطة تشجيانغ للعلوم والتكنولوجيا الصينية التقليدية (رقم 2022ZB093).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 35 مم < سوب > 2 < / سوپ > شرائح تسلق الخلايا | NEST التكنولوجيا الحيوية | 80102 | |
| مكافحة القسطرة K | Abcam | ab19027 | 1: 1،000 |
| التحكم في النمط المتشاوي المضاد ل CD11 | Abcam | ab172730 | 1 & mu ؛ ز / اختبار ، 1.675 مجم / مل |
| مضاد CD11b / ج | أبسين | ABS124232 | ؛ 1 & مو ؛ ز / اختبار ، 1 مجم / مل |
| مضاد للفخ | Abcam | ab191406 | 1: 1،000 |
| مضاد بيتا ؛ أكتين | Beyotime | ؛ AF5003 | 1: 1,000 |
| شرائح تسلق الخلايا | NEST التكنولوجيا الحيوية | 80102 | |
| طبق زراعة الخلايا | corning 430167 | ||
| قارورة زراعة الخلايا | 430168 | ||
| وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) | جيبكو | C11995500BT | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | جيبكو | 10099141C | |
| الماعز المضادة للأرانب IgG | Abcam | ab150077 | ل IF ، 1: 2,000 |
| الماعز المضادة للأرانب IgG | Abcam | ab6721 | ل WB ، 1: 2,000 |
| M-CSF | Pepro tech | 400-28 | |
| PBS | Biosharp | BL302A | |
| RANKL | Pepro tech | 400-30 | |
| SD الفئران | شنغهاي SLAC مختبر المحدودة | 1-10 أيام | |
| مجموعة تحضير جل SDS-PAGE | Solarbio | P1200 | |
| TRAP / ALP طقم تلطيخ | واكو | 294-67001 | |
| حل التربسين-EDTA | Biosharp | BL512A | |
| حل رايت-جيمسا | Keygen Biotech | KGA225-1 |
المراجع
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
