مقالة منهجية

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

DOI:

10.3791/64061

⸱

أغسطس 17, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Genome Integrity and Structural Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول بالتفصيل تحضير معقدات النيوكليوسومال باستخدام طريقتين لإعداد العينة لتجميد شبكات TEM.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصلاح الحمض النووي في سياق الكروماتين غير مفهوم بشكل جيد. تظهر الدراسات الكيميائية الحيوية التي تستخدم جزيئات النيوكليوسوم الأساسية ، وهي الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين ، أن معظم إنزيمات إصلاح الحمض النووي تزيل تلف الحمض النووي بمعدلات منخفضة مقارنة بالحمض النووي الحر. لم يتم توضيح التفاصيل الجزيئية حول كيفية تعرف إنزيمات إصلاح استئصال القاعدة (BER) على تلف الحمض النووي في النيوكليوسومات وإزالته. ومع ذلك ، تشير بيانات BER البيوكيميائية للركائز النووية إلى أن النيوكليوسوم يقدم حواجز هيكلية مختلفة تعتمد على موقع آفة الحمض النووي والإنزيم. وهذا يشير إلى أن الآليات التي تستخدمها هذه الإنزيمات لإزالة تلف الحمض النووي (DNA) في الحمض النووي الحر قد تختلف عن الآليات المستخدمة في النيوكليوسومات. بالنظر إلى أن غالبية الحمض النووي الجينومي يتم تجميعها في النيوكليوسومات ، فإن المعلومات التركيبية لهذه المركبات مطلوبة. حتى الآن ، يفتقر المجتمع العلمي إلى بروتوكولات مفصلة لإجراء دراسات هيكلية مجدية تقنيا لهذه المجمعات. هنا ، نقدم طريقتين لإعداد مركب من اثنين من إنزيمات BER المنصهرة وراثيا (Polymerase β و AP Endonuclease1) مرتبطة بفجوة نيوكليوتيد واحدة بالقرب من دخول وخروج النيوكليوسوم للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) التحديد الهيكلي. كلتا الطريقتين لتحضير العينة متوافقتان مع شبكات جودة التزجيج عن طريق التجميد الغاطس. يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لإعداد معقدات نووية أخرى بعوامل BER مختلفة ، وعوامل نسخ رائدة ، وإنزيمات معدلة للكروماتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنظيم الحمض النووي حقيقي النواة وضغطه بواسطة بروتينات هيستون ، مكونا الكروماتين. يشكل جسيم النواة الأساسي (NCP) الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين التي تنظم إمكانية الوصول إلى البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لإصلاح الحمض النووي ونسخه وتكراره1. على الرغم من أن البنية البلورية الأولى للأشعة السينية ل NCP قد تم حلها لأول مرة منذ أكثر من عقدين منالزمن 2 وتم نشر العديد من هياكل NCP منذ3،4،5،6 ، لم يتم بعد تحديد آليات إصلاح الحمض النووي في الركائز النووية. سيتطلب الكشف عن التفاصيل الجزيئية الكامنة وراء إصلاح الحمض النووي في الكروماتين توصيفا هيكليا للمكونات المشاركة لفهم كيفية تنظيم السمات الهيكلية المحلية ل NCP لأنشطة إصلاح الحمض النووي. هذا مهم بشكل خاص في سياق إصلاح استئصال القاعدة (BER) بالنظر إلى أن الدراسات الكيميائية الحيوية مع إنزيمات BER تشير إلى آليات فريدة لإصلاح الحمض النووي في النيوكليوسومات التي تعتمد على المتطلبات الهيكلية الخاصة بالإنزيم للتحفيز والموقع الهيكلي لآفة الحمض النووي داخل النيوكليوسوم7،8،9،10،11،12،13 . بالنظر إلى أن BER هي عملية إصلاح حيوية للحمض النووي ، فهناك اهتمام كبير بسد هذه الفجوات مع إنشاء نقطة انطلاق يمكن من خلالها إجراء دراسات هيكلية أخرى مجدية تقنيا تتضمن مجمعات نيوكليوسومات ذات صلة.

أصبح Cryo-EM بسرعة الطريقة المفضلة لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للمجمعات التي يمثل إعدادها على نطاق واسع لعينة متجانسة تحديا. على الرغم من أن تصميم وتنقية NCPs المعقدة بعامل إصلاح الحمض النووي (NCP-DRF) سيتطلب على الأرجح تحسينا مخصصا ، فإن الإجراء المقدم هنا لتوليد وتجميد مجمع NCP-DRF مستقر يوفر تفاصيل حول كيفية تحسين العينة وإعداد شبكة cryo-EM. هناك سير عمل (غير متعارضين) موضحين في الشكل 1 ، والتفاصيل المحددة في البروتوكول تحدد الخطوات الهامة وتوفر استراتيجيات لتحسين هذه الخطوات. سيدفع هذا العمل مجال إصلاح الكروماتين والحمض النووي في اتجاه يصبح فيه استكمال الكيمياء الحيوية بالدراسات الهيكلية ممكنا تقنيا لفهم الآليات الجزيئية لإصلاح الحمض النووي النووي بشكل أفضل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تجميع جزيئات النيوكليوسوم الأساسية عن طريق غسيل الكلى بالملح

ملاحظة: تم وصف تحضير جزيئات النواة الأساسية باستخدام بروتينات هيستون المؤتلفة للدراسات الهيكلية على نطاق واسع بالتفصيل من قبل الآخرين14،15،16. اتبع تنقية هيستون X. laevis المؤتلف وتجميع أوكتامير هيستون الموصوف من قبل الآخرين14,15 ، وقم بتجميع الركيزة النووية كما هو موضح أدناه.

  1. قم بشراء ثلاثة قليل النيوكليوتيدات (المدرجة في الجدول 1) بالمقياس المشار إليه: UND-197mer ، 161mer ، 35mer.
    1. PAGE تنقية الترامرات (197mer و 161mer) كما هو موضح17.
      1. كميات متساوية التلدين من قليل النيوكليوتيدات في 1x مخزن مؤقت للتلدين (10 mM Tris-Cl ، درجة الحموضة 8.0 ، 50 mM NaCl). على سبيل المثال ، امزج 40 ميكرولتر من 161 مير [166.7 ميكرومتر] ؛ 8 ميكرولتر من 35 مير [292.4 ميكرومتر] ؛ 16.8 ميكرولتر من حبلا شركات 197 مير [408.2 ميكرومتر] ؛ 10 ميكرولتر من 10x مخزن مؤقت صلب و 10.9 ميكرولتر من dH2O.
        ملاحظة: من الأهمية بمكان التحكم في تفاعل التلدين بتدرج درجة الحرارة. انظر الجدول 2 للحصول على تفاصيل حول تدرج درجة الحرارة.
  2. إجراء عمليات إعادة تكوين على نطاق صغير (مقياس بعامل 1/57 من المثال الموضح أدناه لحجم نهائي قدره 50 ميكرولتر) لتحديد نسبة الحمض النووي إلى أوكتامير هيستون (نسب البدء النموذجية للحمض النووي: أوكتامير هي كما يلي: 1: 0.9 ، 1: 1.1 ، 1: 1.2 ، 1: 2 ؛ كما هو موضح في الشكل 2 أ) ؛ من الأهمية بمكان تحديد هذه النسبة تجريبيا من خلال عمليات إعادة التشكيل على نطاق صغير.
    1. بعد تحديد هذه النسبة ، قم بإعداد إعادة تشكيل واسعة النطاق. على سبيل المثال ، امزج 32.9 ميكرولتر من DNA-197 bp [99.4 μM] ؛ 1647.1 ميكرولتر من TE (1x) ؛ 1120 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 62.3 ميكرولتر من أوكتامير هيستون WT [2.56 ميكرومتر].
  3. جعل مخازن غسيل الكلى:RB منخفضة و RBعالية كما هو موضح في الجدول 3 والجدول 4 ، على التوالي ؛ إعداد عمليات إعادة التشكيل كما هو موضح سابقا14.
    1. انقل أنبوب غسيل الكلى إلى الكأس الزجاجية التي تحتوي علىارتفاع RB ، واسمح بمواصلة غسيل الكلى ، مع التحريك اللطيف ، لمدة 16 ساعة أو حتى يتم نقل 2 LRB منخفض إلى دورق النفايات.
  4. انقل أنبوب غسيل الكلى إلى دورق سعة 1 لتر يحتوي على محلول RB50mM (الجدول 5) واسمح للعينة بغسيل الكلى لمدة 3 ساعات على الأقل أو طوال الليل.
    1. تقييم كفاءة إعادة التكوين على جل بولي أكريلاميد غير مسخ بنسبة 6٪ ، مما يضمن وجود أقل من 10٪ من الحمض النووي الحر وشريط NCP واحد ؛ يخزن نقاط الاتصال الوطنية في درجة حرارة 4 درجات مئوية. انظر الشكل 2 أ (الحارة 5) والشكل 2 ب للحصول على نتائج إعادة التكوين المثلى التمثيلية.

2. إعداد مركب عامل إصلاح NCP-DNA (NCP-DRF)

  1. تنقية عن طريق الكهربائي هلام التحضير
    ملاحظة: هذه الطريقة هي الأكثر كثافة في العمل (من بين الطريقتين الموصوفتين) ، وعلى الرغم من أنها فعالة في إزالة الأنواع عالية الوزن الجزيئي (HMW) (الشكل 6 أ) بسبب عامل التخفيف العالي ، يمكن أن يؤدي إلى بعض التفكيك كما هو موضح في الشكل 7 أ (NCP الإعدادية خلية خارج الحارة) ، والإفراج عن الحمض النووي. ومع ذلك ، لا يزال ما يصل إلى 25٪ من الحمض النووي الحر متوافقا مع دراسات cryo-EM. بسبب التخفيف العالي ، استخدم هذه الطريقة لتنقية NCP فقط ، بدلا من المجمع بأكمله.
    1. تحضير 70 مل من محلول جل بولي أكريلاميد غير مسخ 6٪ في 0.2x TBE ، باستخدام محلول جل بولي أكريلاميد 37.5: 1 ، أكريلاميد: بيساكريلاميد. صب هلام أسطواني مع نصف قطر خارجي من 28 ملم والبلمرة بين عشية وضحاها.
    2. قم بتجميع جهاز تشغيل الجل التحضيري ، باستخدام غشاء غسيل الكلى مع قطع 6-8 كيلو دالتون ميجاوات. استخدم 0.25x TBE كمخزن مؤقت قيد التشغيل ومخزن مؤقت للشطف 1x (50 mM KCl ، 10 mM HEPES ، pH 7.5). قم بتشغيل الجل الأسطواني مسبقا عند 12 واط ثابت لمدة 1 ساعة ، واجمع الكسور التي تشغل المضخة التمعجية بمعدل تدفق يبلغ حوالي 1 مل / دقيقة.
      ملاحظة: إذا لم يكن كاشف الأشعة فوق البنفسجية متاحا لتحديد الكسور التي تحتوي على الحمض النووي ، فيمكن إجراء تجربة فحص باستخدام 32P-NCP لتحديد الأجزاء المهمة. مع الحفاظ على جميع الظروف كما هي ، يمكن بعد ذلك تنقية NCPs غير المسماة بدون كاشف للأشعة فوق البنفسجية.
    3. قم بتركيز 2.8 مل من NCP إلى 250 ميكرولتر باستخدام مرشح طرد مركزي (قطع MW 30 kDa) ، وقم بتحميله على الجل التحضيري والرحلان الكهربائي لمدة 6 ساعات. في 2 ساعة ، عندما ينفد السيانول زيلين من الجل ، ابدأ في جمع 1.5 مل من الكسور.
      ملاحظة: عند 2.5 ساعة ، ستكون الكسور خالية من زيلين سيانول. الحمض النووي (197mer) يذوب في حوالي 3-3.5 ساعة ، ومن المتوقع أن يتلاشى NCP عند علامة 4.5-5 ساعة.
    4. تحليل كسور الفائدة على 6٪ هلام بولي أكريلاميد غير مسخ. تجمع الكسور التي تحتوي على NCP ، وتركز على الفور مع مرشح الطرد المركزي (قطع MW 30 كيلو دالتون) إلى 1 ملغ / مل. في اليوم التالي ، قم بتقييم جودة NCP على جل بولي أكريلاميد 6٪ غير مسخ قبل التعقيد مع عامل إصلاح الحمض النووي (DRF) محل الاهتمام.
    5. احتضان NCP و DRF من الاهتمام على الجليد لمدة 15 دقيقة باستخدام المخزن المؤقت الأمثل للمجمع المحدد. على سبيل المثال ، امزج 1000 ميكرولتر من NCP [1.2 ميكرومتر] ؛ 260 ميكرولتر من مخزن مؤقت ربط 5x (250 mM HEPES ، درجة الحموضة 8 ، 500 mM KCl ، 25 mM MgCl2) ، 22 ميكرولتر من 3 M KCl ، و 18 ميكرولتر من MBP- Pol β-APE1 [338 ميكرومتر].
      ملاحظة: قد تحتاج درجة الحرارة والقوة الأيونية التي يتكون بها المجمع إلى تحسين المجمعات المختلفة.
    6. أضف الجلوتارالدهيد (مفتوح حديثا ؛ درجة EM) إلى تركيز نهائي قدره 0.005٪. لذلك ، لهذا التفاعل ، أضف 26.8 ميكرولتر من 0.25٪ جلوتارالدهيد مع 13.2 ميكرولتر من dH2O. تخلط جيدا ، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 13 دقيقة.
    7. إخماد مع 1 M Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.5 ، إلى تركيز نهائي قدره 20 mM Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.5. ركز على ~ 50 ميكرولتر واستبدل المخزن المؤقت بمخزن تجميد 1x: 50 mM KCl ، 10 mM HEPES ، درجة الحموضة 7.5 باستخدام عمود تحلية.
      تحذير: الجلوتارالدهيد يمكن أن يسبب حروق جلدية شديدة وتلف العين. إنه ضار إذا ابتلع ، وهو سام إذا تم استنشاقه. ارتد معطف المختبر ، ونظارات واقية ، وقفازات ، وتعامل مع الجلوتارالدهيد في غطاء دخان وارتد قناعا.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان إجراء تفاعل التشابك بكميات كبيرة مع NCP عند هذا التركيز المنخفض. أدت المحاولات السابقة للتشابك ، حتى عند هذا التركيز من الجلوتارالدهيد ، ولكن عند تركيز NCP أعلى بمقدار 10 أضعاف إلى تجميع العينة والإفراط في التشابك كما هو موضح بواسطة SDS PAGE وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. لم يكن لهذه الشبكات جسيمات يمكن تمييزها مع كتل فقط (الشكل 5D ، E).
    8. تحديد الامتصاص عند OD 280 و OD 260 والتركيز أكثر إذا لزم الأمر للوصول إلى 1.3-3 مجم / مل ، بناء على OD 280 (النسبة النموذجية ل OD260 / OD 280 = 1.7-2 تنتج جزيئات جيدة). بالنسبة لهذا الحجم الصغير البالغ 50 ميكرولتر ، فإن أفضل طريقة لتقليل فقد العينة هي عمل زر غسيل الكلى بغطاء أنبوب سعة 1.7 مل مغطى بغشاء غسيل الكلى (قطع 6-8 كيلو دالتون ميجاوات) ، وقطع الجزء السفلي من الأنبوب واستخدام حافة الأنبوب لإغلاق الغشاء أعلى الغطاء.
    9. ضع زر غسيل الكلى الذي يحتوي على العينة فوق طبقة البولي إيثيلين جلايكول ، مع توجيه الغشاء لأسفل (تحقق من التقدم كل 2 دقيقة). تفضل هذه الطريقة عندما يكون التركيز المطلوب أقل من أو يساوي 2.5 ضعف لتجنب تخفيف أو فقدان العينة في المكثف. من الأهمية بمكان إعداد شبكات cryo-EM للمجمع على الفور بعد هذه الخطوة.
  2. تنقية بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
    1. في اليوم السابق للتجميد ، اغسل ووازن عمود استبعاد الحجم ب 60 مل من dH2O ، متبوعا ب 80 مل من المخزن المؤقت للتجميد (50 mM KCl ، 10 mM HEPES ، pH 8) بين عشية وضحاها بمعدل 0.4 مل / دقيقة. باستخدام نقاط الاتصال الوطنية مباشرة بعد إعادة التكوين ، قم بإعداد نفس المركب باستخدام كميات أكبر بمقدار 2.5 مرة على النحو التالي: خلط 2500 ميكرولتر من NCP [1.2 ميكرومتر] ؛ 650 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط 5x ؛ 45 ميكرولتر من MBP-Pol β-APE1 [338 ميكرومتر] و 55 ميكرولتر من 3M KCl.
    2. احتضان الخليط على الجليد دون crosslinker لمدة 15 دقيقة. ثم أضف الجلوتارالدهيد إلى تركيز نهائي قدره 0.005٪ كما هو موضح في طريقة الجل التحضيري. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، ركز المجمع في مرشح طرد مركزي متوازن مسبقا (مع مخزن مؤقت للتجميد) إلى حوالي 120 ميكرولتر.
    3. قم على الفور بتحليل كسور الذروة وتركيز تلك الكسور التي تحتوي على الهستونات و MBP-Pol β-APE1 كما هو موضح سابقا. انظر الشكل 5A و B و C للحصول على نتائج ناجحة باستخدام طريقة استبعاد الحجم والشكل 7 باستخدام كلتا الطريقتين.

3. تجميد مجمع النواة

  1. بعد تشغيل الفريزر المغرق وملء المرطب ب 50 مل من dH2O ، اضبط درجة حرارة الغرفة على 22 درجة مئوية و HR (الرطوبة) على 98٪. ضع كوب الإيثان وكوب النيتروجين السائل (الذي يحتوي على صندوق شبكي مصنف) في حاملات المساحة الخاصة بكل منهما.
  2. قم بتغطية كوب الإيثان بموزع غطاء الإيثان ، واسكب النيتروجين السائل (LN2) فوقه بعناية ، مع ملء كوب LN 2 أيضا ب LN2. عندما يستقر مستوى LN2 ويصل إلى 100٪ ودرجة حرارة -180 درجة مئوية ، افتح صمام الإيثان بعناية واملأ كوب الإيثان حتى يشكل فقاعة على الغطاء الشفاف. قم بإزالة موزع الإيثان.
  3. ضع ورقتي ترشيح على جهاز النشاف وثبتهما بحلقة معدنية. انتقل إلى الإعداد واستخدم المعلمات التالية للنشاف: 0 لطخة مسبقة ، 3 لطخة ، 0 بعد اللطخة ؛ حدد A-plunge وانقر على موافق.
  4. على الشاشة الرئيسية ، انقر فوق Load Scrapps ، وقم بتحميلها بشبكة بحيث يكون جانب الكربون / التطبيق متجها نحو اليسار (تم إعداده كما كان من قبل). قم بمعايرة الملقط بضبط المحور Z لضمان وجود بقعة صلبة. انقر فوق الغرفة السفلية وقم بتطبيق 3 ميكرولتر من المركب (1.3-3 مجم / مل ؛ OD280). انقر على لطخة / A-الغطس. سيؤدي ذلك إلى تدوير الشبكة لطخة من الأمام وسيغرق تجميدها.
  5. نقل وتخزين الشبكة في مربع الشبكة في غرفة LN2 . عندما يتم تجميد جميع الشبكات الأربع ووضعها في صندوق الشبكة ، قم بتدوير الغطاء إلى الوضع المحايد ، حيث يتم تغطية جميع الشبكات بالغطاء ، وشد المسمار. يمكن تخزين الشبكات في LN2 حتى يبدأ الفحص.

4. شبكات الشاشة

  1. قبل تحميل العينات في المجهر ، ضع الشبكات المزججة على حلقة وقم بتثبيتها باستخدام مشبك C. قم بإجراء عملية القص هذه تحت LN2 في غرفة يتم التحكم فيها بالرطوبة ، لتجنب تلوث الجليد.
  2. عند تحميل المجهر ، أدخل الشبكات في شريط كاسيت مكون من 12 فتحة. قم بنقل الكاسيت إلى كبسولة nanocab وقم بتحميله في أداة التحميل التلقائي. تبدأ الآلية الروبوتية للمحمل التلقائي العملية.
  3. نقل الشبكة من الكاسيت إلى مرحلة المجهر. اضبط المرحلة على ارتفاع eucentric عن طريق تذبذب المرحلة 10 درجات وتحريك ارتفاع Z في نفس الوقت حتى يتم ملاحظة الحد الأدنى من الإزاحة المستوية في الصور.
  4. بمجرد الوصول إلى ارتفاع eucentric ، ابدأ التصوير. أولا ، احصل على الأطلس عن طريق التقاط صورة مونتاج 3 × 3 للشبكة ، حيث يتم التقاط كل مونتاج بتكبير 62x. اختر ثلاثة مربعات بأحجام مختلفة ؛ خذ الارتفاع المركزي ، ثم الصورة بتكبير 210x.
  5. بمجرد تصوير مربع ، اختر ثقبا واحدا من كل من الحافة والوسط وما بين المربعات. صور كل ثقب بتكبير 2600x.
  6. قبل التقاط هذه الصورة عالية التكبير، يحدث التركيز البؤري التلقائي عند إزاحة منطقة التصوير. التقط صورة التكبير العالي من مركز الفتحة عند تكبير 36000 مرة ووقت تعريض 7.1 ثانية و 60 إطارا وحجم 1.18 بكسل وإلغاء تركيز بؤري 3 ميكرومتر. انظر الصور التمثيلية للفحص في الشكل 5 والشكل 6 والشكل 7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام NCPs المجمعة بشكل صحيح (الشكل 2) لصنع مركب مع بروتين اندماج مؤتلف من MBP-Polβ-APE1 (الشكل 3). لتحديد نسبة NCP إلى MBP-Polβ-APE1 لتشكيل مجمع مستقر ، أجرينا مقايسات تحول الحركة الكهربية (EMSA) (الشكل 4) ، والتي أظهرت نطاقا متغيرا منفردا من NCP مع زيادة مولية بمقدار 5 أضعاف من MBP-Polβ-APE1. أثناء تحسين صنع هذا المركب ، كان التشابك مع الجلوتارالدهيد أمرا بالغ الأهمية لمنع NCP من الانهيار. في البداية ، تم إجراء تجميع مجمع NCP...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد بروتوكول محدد لتنقية عامل إصلاح الحمض النووي على الإنزيم محل الاهتمام. ومع ذلك ، هناك بعض التوصيات العامة ، بما في ذلك استخدام الطرق المؤتلفة للتعبير عن البروتين وتنقيته18 ؛ إذا كان البروتين محل الاهتمام صغيرا جدا (<50 كيلو دالتون) ، فإن تحديد الهيكل بواسطة cryo-EM كان شبه مستحيل حتى وقت قريب من خلال استخدام أنظمة الاندماج19 ، والسقالات الملزمة للجسم النانوي20 ، وتحسين استراتيجيات التصوير21.

م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور ماريو بورجنيا من نواة cryo-EM في المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية والدكتور جوشوا شتراوس من جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل على إرشادهم وتدريبهم في إعداد شبكة cryo-EM. كما نشكر الدكتورة جوليانا ميلو دا فونسيكا ريزيندي على المساعدة التقنية في المراحل الأولية من هذا المشروع. نحن نقدر المساهمة والدعم الرئيسيين للراحل الدكتور صموئيل ويلسون وأعضاء مختبره ، وخاصة الدكتور راجندرا براساد والدكتور جوناس جامسن لتنقية مركب APE1-Polβ المنصهر وراثيا. تم دعم البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية [أرقام المنح Z01ES050158 و Z01ES050159 و K99ES031662-01].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 م هيبس ؛ درجة الحموضة 7.5ثيرمو فيشر15630080
العلمي 1 م MgCl 2< / sub> ThermoFisher Scientific
10x TBEBio-rad1610733
25٪ جلوتارالديهايدفيشر Scientific50-262-23
3 M KClثيرمو فيشر Scientific043398.K2
491 خلية الإعداديةBio-rad1702926
Amicon Ultra 15 مرشح طرد مركزي (قطع MW 30 كيلو دالتون)Millipore SigmaZ717185
Amicon Ultra 4 مرشح الطرد المركزي (قطع MW 30 كيلو دالتون)Millipore SigmaUFC8030
AutoGrid TweezersTed Pella47000-600
الفريزر الغطس الأوتوماتيكيLeicaLeica EM GP
C-1000 تعمل باللمس thermocyclerBio-rad1851148
C-clips and ringsThermo Fisher6640--6640
محطة القطعSubAngostromSCT08
غشاء غسيل الكلى (MW cufoff 6-8 kDa)Fisher Scientific15370752
Diamond TweezersTechni-Pro758TW0010
dsDNAالحمض النووي المتكامل التقنياتN / A
FEI تيتان كريوسثيرمو فيشرKRIOSG4TEM
نظام تنقية FPLCAKTA مجمع29018224
نموذج 2110نظام
Ted Pella91000S
صناديق الشبكةSubAngostromPB-E
حزمة ملحقات تخزين الشبكةSubAngostromGSAX
السائل الإيثانN / AN / A
النيتروجين السائلN / AN / A
Minipuls 3 مضخة تمعجية ثنائية الرأسجيلسونF155008
NanodropThermo Fisher ScientificND-2000
Novex 16٪ ، تريسين ، 1.0 مم ، جل البروتينالصغير الحراري فيشر EC6695BOX
PipetmanGilsonFA10002M
أطراف الماصة (VWR) محلولVWR76322-528
(37.5: 1)Bio-rad1610158
البولي إيثيلين جلايكول (PEG)Millipore SigmaP4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500Millipore SigmaPURX35050
عامل إصلاح الحمض النووي المؤتلف المنقىN / AN / A
R 1.2 / 1.3 Cu 300 شبكةQuantifoilN1-C14nCu30-01
مؤتلف هيستون أوكتامرN / AN / A
أدوات قص الربيعSubAngostromCSA-01
Superdex 200 العمود 10/300Millipore SigmaGE28-9909-44
مجهر إلكتروني ناقل الحركةThermo FisherTalos Arctica 200 كيلو فولت
تجميع ملاقط ل FEI Vitrobot Mark IV-ITed Pella47000-500
UltraPure GlycerolThermo Fisher Scientific15514011
VitrobotThermo FisherMark IV System
Whatman ورق ترشيح (55 ملم)Cytiva1005-055
الزيلين سيانولثيرمو فيشر العلمي440700500
زيبا مايكرو سبين ديسبين ديسكوت أعمدة ، 7K MWCO ، 75 & micro ؛ إلثيرمو فيشر العلمي89877
AM9530G كسر نقي تنظيف تفريغ التوهج 7318122 Bio-radالعلمي هلام بولي أكريلاميد منخفض الاحتفاظ شبكات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909(2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118(2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032(2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255(2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة