Method Article

الكشف عن المبيضات القابلة للنشر الميداني Liberibacter asiaticus باستخدام تضخيم بوليميراز Recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a

DOI:

10.3791/64070

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1China-USA Citrus Huanglongbing Joint Laboratory, National Navel Orange Engineering Research Center, Gannan Normal University, 2Department of Biological Sciences, Gannan Normal University, 3Citrus Research and Education Center, Department of Microbiology and Cell Science, University of Florida - Institute of Food and Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل ، تم تطوير طريقة كشف سريعة وحساسة ومحمولة ل Candidatus Liberibacter asiaticus على أساس تضخيم بوليميراز recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسهل الكشف المبكر عن Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) من قبل مزارعي الحمضيات التدخل المبكر ويمنع انتشار المرض. يتم تقديم طريقة بسيطة لتشخيص Huanglongbing (HLB) السريع والمحمول هنا والتي تجمع بين تضخيم بوليميراز recombinase ومراسل الفلورسنت باستخدام نشاط النيوكلياز لنظام التكرارات القصيرة المتباعدة بانتظام / 12a المرتبط ب CRISPR (CRISPR-Cas12a). حساسية هذه التقنية أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الطريقة نتائج مماثلة ل qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas التقليدية ، يمكن إكمال طريقة الكشف المعروضة هنا في 90 دقيقة وتعمل في حالة متساوية الحرارة لا تتطلب استخدام أجهزة PCR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور النتائج من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Huanglongbing (HLB) هي واحدة من أكثر أمراض الحمضيات إشكالية في جميع أنحاء العالم1. يحدث HLB بسبب البكتيريا المستعمرة لللحاء والحساسية Candidatus Liberibacter spp. ، بما في ذلك Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) و Ca. L. africanus و Ca. L. americanus2. أكثر الأنواع المرتبطة ب HLB انتشارا في الصين والولايات المتحدة الأمريكية هي CLas ، والتي تنتقل عن طريق سيلليدات الحمضيات الآسيوية (Diaphorina citri) أو من خلال التطعيم3. بعد الإصابة ب CLas ، تظهر أشجار الحمضيات انخفاضا في النمو حتى الموت2. الأعراض الشائعة لأوراق الحمضيات المصا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء كاشف CLas

ملاحظة: بناء CLas-DETECTR هو عملية من أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، وتصور النتائج. يوضح الشكل 1 أ الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR.

  1. إعداد الحل
    1. تحضير المخزن المؤقت A: 20 mM NaOH في 6٪ PEG 200. للحصول على 100 مل ، أضف 113 مجم من هيدروكسيد الصوديوم و 6 جم من PEG 200 إلى 80 مل من H2O في زجاجة. احتضان الزجاجة في حمام مائي على حرارة 60 درجة مئوية حتى يذوب كل PEG 200. ثم أضف H2O إلى حجم 100 مل.
    2. تحضير الحل B: لكل تفاعل ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPA ، و 0.8 ميكرولتر من F-R....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، وصفنا منصة محمولة ، CLas-DETECTR ، تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a لتشخيص HLB في الميدان. مخطط CLas-DETECTR موضح في الشكل 1A.

عندما خضعت عينات الأوراق من أشجار نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB (الشكل 1B) ، والتي تم تأكيد وجود CLas لها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1C) ، لاختبار CLas-DETECTR ، شوهدت إشارة مضان خضراء في العينة المصابة ب HLB ولكن ليس في العينة غير المصابة ب HLB والتحكم السلبي (الشكل 1D).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة ومحمولة للكشف عن CLas تسمى CLas-DETECTR ، والتي تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a. يوضح الشكل 1 سير العمل. يكتشف CLas-DETECTR CLas بخصوصية وحساسية (الشكل 2 والشكل 3). علاوة على ذلك ، باستخدام عينات أوراق نيوهول ، يكتشف CLas-DETECTR CLas بنفس حساسية qPCR (الشكل 4). والجدير بالذكر أنه يمكن تصور نتائج الكشف مباشرة من خلال جهاز محمول باليد مستقل عن الأدوات القا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFD1400805) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيانغشي (20194ABC28007) ، ومشاريع إدارة التعليم في جيانغشي (GJJ201449) ، والابتكار التعاوني للبحث العلمي الزراعي الحديث في مقاطعة جيانغشي (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طقم استخراج هلام الحمض النووي AxyPrepCorning09319KE1مجموعة
استخراج الحمض النووي الجيني البكتيريفي الصين SolarbioD1600China
EnGen LbCas12a  TOLOBIO32104-01الصين
Ex Taq الإصدار 2.0 بالإضافة إلى صبغTaKaRaRR902Aالصين
جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد LUYOR3415RGالصين
ثقب لكمة  ديلي114الصين
أسيتات المغنيسيوم ، MgOAcTwistDxTABAS03KITالمملكة المتحدة
هيدروكسيد الصوديومSCR10019718الصين
NEB buffer 3.1 & nbsp ؛NEBB7203الولايات المتحدة الأمريكية
أنابيب شريط PCRLABSELECTPST-0208-FT-Cالصين
PEG 200   ؛سيجماP3015الولايات المتحدة الأمريكية
PrimeSTAR Max DNA PolymerasTaKaRaR045Aالصين
التحميل الأرجواني 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي  نيو إنجلاند بيولابسN0550Sالولايات المتحدة الأمريكية
TB بريمكس أخضر Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820BChina
TwistAmp BasicTwistDxTABAS03KITالمملكة المتحدة
سريع

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
  2. Bové, J. M. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Candidatus Liberibacter AsiaticusHuanglongbing DetectionRecombinase Polymerase AmplificationCRISPR Cas12aField DiagnosticsIsothermal DNA AmplificationCitrus Leaf TestingFluorescent DetectionqPCR ComparisonDNA Extraction

Related Articles