في هذا العمل ، تم تطوير طريقة كشف سريعة وحساسة ومحمولة ل Candidatus Liberibacter asiaticus على أساس تضخيم بوليميراز recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن المبيضات القابلة للنشر الميداني Liberibacter asiaticus باستخدام تضخيم بوليميراز Recombinase جنبا إلى جنب مع CRISPR-Cas12a
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يسهل الكشف المبكر عن Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) من قبل مزارعي الحمضيات التدخل المبكر ويمنع انتشار المرض. يتم تقديم طريقة بسيطة لتشخيص Huanglongbing (HLB) السريع والمحمول هنا والتي تجمع بين تضخيم بوليميراز recombinase ومراسل الفلورسنت باستخدام نشاط النيوكلياز لنظام التكرارات القصيرة المتباعدة بانتظام / 12a المرتبط ب CRISPR (CRISPR-Cas12a). حساسية هذه التقنية أعلى بكثير من PCR. علاوة على ذلك ، أظهرت هذه الطريقة نتائج مماثلة ل qPCR عند استخدام عينات الأوراق. بالمقارنة مع طرق الكشف عن CLas التقليدية ، يمكن إكمال طريقة الكشف المعروضة هنا في 90 دقيقة وتعمل في حالة متساوية الحرارة لا تتطلب استخدام أجهزة PCR. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور النتائج من خلال جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول في الميدان.
المقدمة
Huanglongbing (HLB) هي واحدة من أكثر أمراض الحمضيات إشكالية في جميع أنحاء العالم1. يحدث HLB بسبب البكتيريا المستعمرة لللحاء والحساسية Candidatus Liberibacter spp. ، بما في ذلك Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) و Ca. L. africanus و Ca. L. americanus2. أكثر الأنواع المرتبطة ب HLB انتشارا في الصين والولايات المتحدة الأمريكية هي CLas ، والتي تنتقل عن طريق سيلليدات الحمضيات الآسيوية (Diaphorina citri) أو من خلال التطعيم3. بعد الإصابة ب CLas ، تظهر أشجار الحمضيات انخفاضا في النمو حتى الموت2. الأعراض الشائعة لأوراق الحمضيات المصا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. بناء كاشف CLas
ملاحظة: بناء CLas-DETECTR هو عملية من أربع خطوات: تحضير المحلول ، وعزل الحمض النووي الكلي للحمضيات ، وتضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة ، وتصور النتائج. يوضح الشكل 1 أ الرسم التخطيطي لمقايسة CLas-DETECTR.
- إعداد الحل
- تحضير المخزن المؤقت A: 20 mM NaOH في 6٪ PEG 200. للحصول على 100 مل ، أضف 113 مجم من هيدروكسيد الصوديوم و 6 جم من PEG 200 إلى 80 مل من H2O في زجاجة. احتضان الزجاجة في حمام مائي على حرارة 60 درجة مئوية حتى يذوب كل PEG 200. ثم أضف H2O إلى حجم 100 مل.
- تحضير الحل B: لكل تفاعل ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPA ، و 0.8 ميكرولتر من F-R....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، وصفنا منصة محمولة ، CLas-DETECTR ، تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a لتشخيص HLB في الميدان. مخطط CLas-DETECTR موضح في الشكل 1A.
عندما خضعت عينات الأوراق من أشجار نيوهول المصابة ب HLB وغير المصابة ب HLB (الشكل 1B) ، والتي تم تأكيد وجود CLas لها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 1C) ، لاختبار CLas-DETECTR ، شوهدت إشارة مضان خضراء في العينة المصابة ب HLB ولكن ليس في العينة غير المصابة ب HLB والتحكم السلبي (الشكل 1D).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة ومحمولة للكشف عن CLas تسمى CLas-DETECTR ، والتي تجمع بين أنظمة RPA و CRISPR-Cas12a. يوضح الشكل 1 سير العمل. يكتشف CLas-DETECTR CLas بخصوصية وحساسية (الشكل 2 والشكل 3). علاوة على ذلك ، باستخدام عينات أوراق نيوهول ، يكتشف CLas-DETECTR CLas بنفس حساسية qPCR (الشكل 4). والجدير بالذكر أنه يمكن تصور نتائج الكشف مباشرة من خلال جهاز محمول باليد مستقل عن الأدوات القا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل ماليا من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFD1400805) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيانغشي (20194ABC28007) ، ومشاريع إدارة التعليم في جيانغشي (GJJ201449) ، والابتكار التعاوني للبحث العلمي الزراعي الحديث في مقاطعة جيانغشي (JXXTCX2015002 (3 + 2) -003).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم استخراج هلام الحمض النووي AxyPrep | Corning | 09319KE1 | مجموعة |
| استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري | في الصين Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | الصين |
| Ex Taq الإصدار 2.0 بالإضافة إلى صبغ | TaKaRa | RR902A | الصين |
| جهاز الكشف عن الفلورسنت المحمول باليد | LUYOR | 3415RG | الصين |
| ثقب لكمة | ديلي | 114 | الصين |
| أسيتات المغنيسيوم ، MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | المملكة المتحدة |
| هيدروكسيد الصوديوم | SCR | 10019718 | الصين |
| NEB buffer 3.1 & nbsp ؛ | NEB | B7203 | الولايات المتحدة الأمريكية |
| أنابيب شريط PCR | LABSELECT | PST-0208-FT-C | الصين |
| PEG 200 ؛ | سيجما | P3015 | الولايات المتحدة الأمريكية |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | الصين |
| التحميل الأرجواني 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي | نيو إنجلاند بيولابس | N0550S | الولايات المتحدة الأمريكية |
| TB بريمكس أخضر Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | المملكة المتحدة |
المراجع
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
- Bové, J. M. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
