مقالة منهجية

طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية

DOI:

10.3791/64106

⸱

يونيو 23, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الحويصلات الجذعية الصغيرة خارج الخلية للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الحبل السري (hUC-MSC-sEVs) باستخدام إعداد بسيط على نطاق المختبر. يتميز توزيع الحجم وتركيز البروتين وعلامات sEVs ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر العملية القائمة على الطرد المركزي الفائق الطريقة الشائعة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs). ومع ذلك ، فإن العائد من طريقة العزل هذه أقل نسبيا ، وهذه الطرق غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية sEV. توضح هذه الدراسة طريقة ترشيح بسيطة على الطاولة لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية MSC المشتقة من الحبل السري البشري (hUC-MSC-sEVs) ، والتي تم فصلها بنجاح عن طريق الترشيح الفائق من الوسط المشروط ل hUC-MSCs. تم تمييز توزيع الحجم وتركيز البروتين والعلامات الخارجية (CD9 و CD81 و TSG101) ومورفولوجيا hUC-MSC-sEVs المعزولة بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ومقايسة بروتين BCA ، واللطخة الغربية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، على التوالي. كان حجم hUC-MSC-sEVs المعزول 30-200 نانومتر ، مع تركيز جسيم 7.75 × 10 10 جسيمات / مل وتركيز بروتين80 ميكروغرام / مل. لوحظت نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101. أظهرت هذه الدراسة أن hUC-MSC-sEVs تم عزلها بنجاح من الوسط المكيف hUC-MSCs ، وأظهر التوصيف أن المنتج المعزول استوفى المعايير المذكورة في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV 2018).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفقا ل MISEV 2018 ، فإن sEVs عبارة عن جسيمات ثنائية الطبقة دهنية غير قابلة للتكرار مع عدم وجود نواة وظيفية ، بحجم 30-200 نانومتر1. تحتوي sEVs المشتقة من MSC على جزيئات إشارات مهمة تلعب أدوارا مهمة في تجديد الأنسجة ، مثل microRNA أو السيتوكينات أو البروتينات. لقد أصبحوا بشكل متزايد "نقطة ساخنة" بحثية في الطب التجديدي والعلاج الخالي من الخلايا. أظهرت العديد من الدراسات أن sEVs المشتقة من MSC فعالة مثل MSCs في علاج الحالات المختلفة ، مثل التعديل المناعي2،3،4،5 ، وتعزيز تكوين العظم6 ، ومرض السكري7،8 ، أو تجديد الأوعية الدموية9،10. مع تقدم تجارب المرحلة المبكرة ، تم تسليط الضوء على ثلاث قضايا رئيسية رئيسية فيما يتعلق بالترجمة السريرية ل MSCs-EVs: إنتاجية EVs ، ونقاء EVs (خالية من حطام الخلايا والملوثات البيولوجية الأخرى مثل البروتين والسيتوكينات) ، وسلامة غشاء الطبقة المزدوجة الفوسفوليبيد للمركبات الكهربائية بعد العزل.

تم تطوير طرق مختلفة لعزل sEVs ، واستغلال الكثافة والشكل والحجم والبروتين السطحي ل sEVs11. الطريقتان الأكثر شيوعا في عزلات sEVs هما التقنيات القائمة على الطرد المركزي الفائق والتقنيات القائمة على الترشيح الفائق.

تعتبر الطرق القائمة على الطرد المركزي الفائق طرقا قياسية ذهبية في عزل المركبات الكهربائية. هناك نوعان من تقنيات الطرد المركزي الفائق التي يتم استخدامها عادة وهما الطرد المركزي التفاضلي والطرد المركزي الفائق التدرج الكثاف. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي طرق الطرد المركزي الفائق إلى انخفاض العائد وتتطلب معدات باهظة الثمن لأجهزة الطرد المركزي فائقة السرعة (100000-200000 × جم)11. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات الطرد المركزي الفائق وحدها غير فعالة في فصل الأنواع الفرعية للمركبات الكهربائية (sEVs والمركبات الكهربائية الكبيرة) ، مما يؤدي إلى طبقة رواسب غير نقية11. أخيرا ، يمكن أن يستغرق الطرد المركزي الفائق التدرج الكثافي وقتا طويلا ويتطلب خطوات احترازية إضافية مثل إضافة المخزن المؤقت للسكروز لمنع تلف التدرج أثناء خطوات التسارع والتباطؤ12. وبالتالي ، فإن الطرد المركزي الفائق عادة ما يؤدي إلى عائد منخفض نسبيا وغير قادر على التمييز بين مجموعات مختلفة من المركبات الكهربائية13 ، مما يحد من تطبيقه لإعداد المركبات الكهربائية على نطاق واسع11.

الطريقة الثانية لعزل EV هي عن طريق الترشيح الفائق ، والذي يعتمد على ترشيح الحجم. يعتبر الترشيح الفائق فعالا نسبيا من حيث الوقت والتكلفة مقارنة بالطرد المركزي الفائق ، لأنه لا يتضمن معدات باهظة الثمن أو أوقات معالجة طويلة14. وبالتالي ، يبدو أن الترشيح الفائق هو تقنية عزل أكثر فعالية من طريقتي الطرد المركزي الفائق المذكورتين أعلاه. يمكن أن تكون المنتجات المعزولة أكثر تحديدا بناء على أحجام المسام والعائد الأعلى15. ومع ذلك ، قد تؤدي القوة الإضافية المتكبدة أثناء عملية الترشيح إلى تشوه أو ثوران المركبات الكهربائية16.

اقترحت الورقة الحالية بروتوكولا فعالا من حيث التكلفة والوقت لعزل المركبات الكهربائية المشتقة من MSC للتحليل النهائي والأغراض العلاجية. جمعت الطريقة الموصوفة في هذه الورقة بين طريقة ترشيح بسيطة مع الطرد المركزي على مقاعد البدلاء لعزل المركبات الكهربائية عالية الإنتاجية وذات الجودة العالية من hUC-MSCs لتحليل المصب ، بما في ذلك تحليل حجم الجسيمات ، وفحص العلامات الحيوية ، والتصوير المجهري الإلكتروني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري والثقافة

  1. استزراع hUC-MSCs بكثافة بذر 5 × 103 / سم2 في DMEM ، مكملة ب 8٪ تحلل الصفائح الدموية البشرية و 1٪ Pen-Strep. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2. استبدل وسط زراعة الخلايا كل 3 أيام لضمان نمو الخلايا بشكل صحيح.
  2. قم بتوسيع الخلايا لتمرير 5 في قوارير T175 لعزل sEV.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى العديد من القوارير لحصاد غلة عالية من sEVs (يزداد العائد مع عدد الخلايا).

2. عزل حويصلة صغيرة خارج الخلية من hUC - MSCs

  1. استبدل وسط الاستزراع ب DMEM الطازج الخالي من الفينول الأحمر المكمل ب 1٪ Pen-Strep [وسط مكيف (CM)] عندما تصل الثقافة إلى التقاء 70٪ -80٪ عند الممر 5.
    تنبيه: استخدم الوسائط القاعدية فقط ؛ تجنب FBS ومكمل تحلل الصفائح الدموية البشرية لتجنب التلوث بواسطة sEVs الخارجية.
  2. بعد 24 ساعة ، قم بطرد مركزي CM عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. جمع وتصفية المادة الطافية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات التي يزيد حجمها عن 220 نانومتر.
  3. املأ وحدة مرشح الطرد المركزي ب 30 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) تمت تصفيته من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. جهاز الطرد المركزي وحدة مرشح الطرد المركزي عند 3500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. املأ CM المصفى في وحدة مرشح الطرد المركزي (الحد الأقصى لحجم كل وحدة هو 70 مل). أجهزة الطرد المركزي CM عند 3500 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يجب مراقبة مدة الطرد المركزي من وقت لآخر حتى يصل المحلول إلى سطح المرشح.
  5. تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. عكس الطرد المركزي كوب مرشح العينة مع كوب جمع التركيز عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 2 دقيقة.
  6. انقل CM المركز مرة أخرى إلى وحدة مرشح الطرد المركزي. أضف 30 مل من PBS المصفى إلى وحدة مرشح الطرد المركزي وطرد مركزي الوحدة عند 3500 × جم عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من المحلول في كوب محلول الترشيح. قم بتركيب كوب تجميع مركز على وحدة المرشح وأجهزة طرد مركزي عكسية عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على sEVs المنقى.
  8. قم بتصفية sEVs من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
  9. نقل العينات إلى أنابيب جديدة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

3. توصيف hUC-MSC-sEVs

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية
    1. قم بتخفيف hUC-MSC-sEVs المعزولة في PBS المصفى إلى 20-100 جسيم / إطار.
    2. أدخل 1 مل من العينة المخففة في غرفة NTA باستخدام محاقن 1 مل يمكن التخلص منها.
    3. اضبط إعدادات القياس وفقا لذلك: اضبط مستوى الكاميرا على المستوى 14 ، وحدد عتبة الكشف لتشمل أكبر عدد ممكن من الجسيمات مع تقييد حساب 10-100 صليب أحمر ، ويقتصر عدد الصليب الأزرق على خمسة.
    4. لكل قياس ، سجل خمسة مقاطع فيديو مدتها 1 دقيقة وقم بتحليلها باستخدام برنامج NanoSight مع حد اكتشاف يبلغ خمسة.
    5. خذ القياسات في ثلاث نسخ لكل عينة.
  2. تحليل النشاف الغربي
    1. تحلل محلول تحلل hUC-MSC-sEVs باستخدام محلول تحلل الترسيب المناعي الإشعاعي البارد (RIPA) ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع طاف .
    2. قم بقياس البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين بحمض Bicinchoninic (BCA). قم بتجميع مجموعة الرحلان الكهربائي للهلام وفقا لذلك وقم بإجراء الرحلان الكهربائي للهلام عند 90 فولت حتى يصل البروتين إلى نهاية جل التراص. قم بتغيير الجهد إلى 200 فولت لفصل البروتينات حتى نهاية هلام الحل.
    3. قم بإجراء نقل شبه جاف لنقل البروتينات من الجل إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) عند 15 فولت لمدة 1 ساعة.
    4. سد غشاء PVDF مع 3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) / محلول ملحي مخزن Tris-0.1٪ v / v Tween 20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. احتضان غشاء PVDF بالأجسام المضادة الأولية على النحو التالي: الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفأر CD 9 (1: 500) ، الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفأر CD 81 (1: 500) ، الفأر المضاد ل GRP 94 الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر TSG 101 (1: 500) عند 4 درجات مئوية طوال الليل مع الاهتزاز المستمر.
    5. في اليوم التالي ، اغسل غشاء PVDF 5 × 5 دقائق باستخدام TBS-T واحتضان المزيد بجسم مضاد ثانوي: الفجل الفجل بيروكسيديز الفأر المترافق IgG kappa ملزمة البروتين (m-IgGκ BP-HRP) (1: 5000) لمدة 1 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة.
    6. مرة أخرى ، اغسل غشاء PVDF باستخدام TBS-T خمس مرات ، وتصور الغشاء في جهاز تصوير مقترن بالشحنة (CCD) باستخدام كاشف الكشف عن التلألؤ الكيميائي. تحليل مستوى التعبير عن البروتينات باستخدام برنامج ImageJ. أولا ، افتح ملف الصورة في ImageJ (ملف | فتح...). تحسين جودة الصورة عن طريق ضبط السطوع والتباين (صورة | ضبط | السطوع / التباين). اضبط الصورة حتى تصبح البقع مرئية بوضوح ، وانقر فوق الزر "تطبيق" ، ثم احفظ الصور بتنسيق TIFF (ملف | حفظ باسم | TIFF...).
  3. المجهر الإلكتروني النافذ
    1. قم بتخفيف جزء واحد من عينة hUC-MSC-sEVs بأربعة أجزاء من PBS المصفى إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر واحتضانه على شبكة نحاسية مطلية بالكربون لمدة 15 دقيقة.
    2. قم بإزالة العينة الزائدة باستخدام منديل المختبر واتركها تجف في الهواء لمدة 3 دقائق.
    3. احتضان 10 ميكرولتر من محلول حمض الفوسفوتونجستيك 1٪ (PTA) لتلطيخ العينة لمدة 3 دقائق.
    4. قم بإزالة محلول PTA الزائد بنسبة 1٪ باستخدام مناديل معملية واتركه يجف في الهواء لمدة 3 دقائق.
    5. استخدم العينة للتصوير بالمجهر الإلكتروني النافذ.
      ملاحظة: راجع الشكل 1 للاطلاع على خطوات التجربة التخطيطية الملخصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 2 أن hUC-MSC-sEVs لها وضع حجم جسيم عند 53 نانومتر ، في حين أن القمم المهمة الأخرى لحجم الجسيمات كانت 96 و 115 نانومتر. كان تركيز hUC-MSC-sEVs المقاسة بواسطة NTA 7.75 × 1010 جسيمات / مل. كان تركيز البروتين في hUC-MSC-sEVs المقاسة باستخدام مقايسة BCA حوالي 80 ميكروغرام / مل.

في تحليل النشاف الغربي ، أظهرت hUC-MSC-sEVs نطاقات إيجابية للعلامات الخارجية CD9 و CD81 و TSG101 ، لكنها كانت سلبية ل GRP94 (الشكل 3). GRP94 ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EVs هي واحدة من المجموعات الفرعية المهمة للإفراز في MSCs التي تلعب دورا حاسما أثناء العمليات الطبيعية والمرضية. ومع ذلك ، فقد ارتفعت sEVs ، التي يتراوح حجمها بين 30 إلى 200 نانومتر ، كأداة محتملة للعلاج الخالي من الخلايا في العقد الماضي. تم تطوير تقنيات مختلفة لعزل المركبات الكهربائية من MSCs. ومع ذلك ، فإن الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، والترشيح الفائق ، والترسيب القائم على البوليمر ، والتقاط التقارب المناعي ، والترسيب القائم على الموائع الدقيقة لها مزايا وعيوب مختلفة17. لا يمكن لأي من تقنيات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم نشر هذا الفيديو من قبل My CytoHealth Sdn. Bhd.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
40٪ أكريلاميدNacalai Tesque06121-95لطخة غربية
95٪ إيثانولNacalai Tesque14710-25مطهرات
الميثانول المطلقChemiz45081لتنشيط غشاء PVDF (اللطخة الغربية)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920إنزيم تفكك الخلايا
بيرسلفات الأمونيومChemiz14475تحفيز بلمرة الهلام (الرحلان الكهربائي الهلامي
المضاد للقرص المضغوط 81 (B-11)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-166029الجسم المضاد لعلامة sEVs
المضادة ل TSG 101 (C-2)سانتا كروز بيوتكنولوجيsc-7964الجسم المضاد لعلامة المركبات الكهربائية
الألبومين في مصل الأبقارNacalai Tesque00653-31PVDF غشاء يمنع
البروموفينول الأزرقNacalai Tesque05808-61علامة اللون الكهربائي
Centricon Plus-70 (100 كيلو دالتون NMWL)MilliporeUFC710008sEVs عزل
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880كاشف الكشف عن التلألؤ
الكيميائي CryoStor Frozen MediaSigma-AldrichC3124-100MLCell cryopreserve
Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسطNacalai Tesque08458-45وسائط زراعة الخلايا
ExcelBand محسنة 3 ألوان علامة بروتين عالية المدىSMOBIOPM2610علامات الوزن الجزيئي للبروتين
ورقة نشاف سميكة إضافيةATTOمخزن مؤقت (لطخة غربية)
GlycerolMerckG5516المواد الكيميائية للبقعة الغربية
Glycine1st BaseBIO-2085-500gمواد كيميائية للمخزن المؤقت (اللطخة الغربية)
الفجل الحار بيروكسيداز المصاحب بالبروتين IgG kappa binding (m-IgG & kappa; BP-HRP)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-516102الجسم المضاد الثانوي (اللطخة الغربية)
هيومن وارتون s الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الهلام (MSCs) مركزهندسة الأنسجة والطب التجديدي ، كلية الطب ، جامعة ماليزيا
الأجسام المضادة للفأر المضادة للقرص المضغوط 9 (C-4)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية  ؛ sc-13118جسم مضاد لعلامة sEVs
Nanosight NS300 مجهزة بكاميرا CMOS ، وعدسة موضوعية 20 مرة ، ووحدة ليزر زرقاء (488 & thinsp ؛ nm) ، وبرنامج NTA v3.2Malvern Panalytical ، المملكة المتحدة
paraformaldehydeNacalai Tesque02890-45تثبيت العينة أثناء TEM
البنسلين & ndash ؛ ستربتومايسينناكالاي تيسك26253-84مضاد حيوي لوسائط
فينيل ميثيل سلفونيل فلوريدNacalai Tesque27327-81تثبيط البروتياز في عينات sEVs بعد إضافة محلول ملحي مخزن بالفوسفات
المحزن بالتحلل Gibco10010023الغسيل ،
غشاء فلوريد البولي فينيلدين المخفف للعينة مع
0.45 مم حجم المسام		ATTOللاحتفاظ بالبروتين أثناء نقل البروتين (اللطخة الغربية)
كوكتيل مثبط البروتيازNacalai Tesque25955-11تثبيط البروتياز في عينات sEVs بعد إضافة المخزن المؤقت للتحلل
مجموعة فحص البروتين BicinchoninateNacalai Tesque06385-00
محلول عازل لعينة قياس البروتين مع 2-MENacalai Tesque30566-22عامل اختزال للصوديوم اللطخة الغربية
كلوريدNacalai Tesque15266-64كيماويات للبقعة الغربية
كبريتات الصوديوم دوديسيلNacalai Tesque31606-62الفاعل بالسطح الأيوني أثناء الرحلان الكهربائي للهلام
Tecnai G2 F20 S-TWIN مجهر إلكتروني ناقلFEI ، الولايات المتحدة الأمريكية
tetramethylethylenediamineNacalai Tesque33401-72مواد كيميائية لتحضير هلام
تريس1st قاعدةBIO-1400-500gالمواد الكيميائية للمخزن المؤقت (Western Blot)
  Tween 20GeneTexGTX30962Chemicals للأشعة فوق البنفسجية الغربية
(منتج Ultra Vision) تصوير CCDلاكتشاف إشارة اللطخة الغربية
الوطنية الحركة بیس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239(2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
  8. Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
  9. Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Ultrafiltration MethodConditioned MediumNanoparticle TrackingBCA Protein AssayWestern BlotTransmission Electron MicroscopeExosomal Markers

مقالات ذات صلة