لقد أحدثت الخزعة السائلة ثورة في نهجنا في الدراسات الانتقالية لعلم الأورام ، حيث يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة لتطبيقها السريري الناجح. هنا نصف بروتوكولا موحدا ومعتمدا لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية والتي يمكن تطبيقها في معظم مختبرات الأبحاث الانتقالية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول ما قبل التحليل المسبق للخزعة السائلة الموحدة لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يشير مصطلح الخزعة السائلة (LB) إلى جزيئات مثل البروتينات أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي و / أو النقيلي. برز LB كدعامة أساسية في البحوث الانتقالية وبدأ يصبح جزءا من ممارسة الأورام السريرية ، مما يوفر بديلا طفيف التوغل للخزعة الصلبة. يسمح LB بمراقبة الورم في الوقت الفعلي عن طريق استخراج عينة طفيفة التوغل ، مثل الدم. وتشمل التطبيقات الكشف المبكر عن السرطان، ومتابعة المرضى للكشف عن تطور المرض، وتقييم الحد الأدنى من الأمراض المتبقية، والتحديد المحتمل للتطور الجزيئي وآلية المقاومة. من أجل تحقيق تحليل موثوق به لهذه العينات التي يمكن الإبلاغ عنها في العيادة ، يجب النظر بعناية في إجراءات ما قبل التحليل واتباعها بدقة. يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة تحدد فائدتها في التطبيقات النهائية. هنا ، نقدم بروتوكولات موحدة من وحدة عمل الخزعة السائلة الخاصة بنا لجمع ومعالجة وتخزين عينات البلازما والمصل لتحليل الخزعة السائلة في المصب بناء على الحمض النووي الخالي من التداول. تتطلب البروتوكولات المعروضة هنا معدات قياسية ومرنة بما يكفي لتطبيقها في معظم المختبرات التي تركز على الإجراءات البيولوجية.
المقدمة
تم تعريف مصطلح "الخزعة السائلة" في عام 20101 على أنه وجود جزيئات (مثل البروتين أو الحمض النووي الريبي النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA)) أو الخلايا أو الحويصلات خارج الخلية (على سبيل المثال ، الإكسوسومات) في الدم وسوائل الجسم الأخرى التي تنشأ من الورم الأساسي. أحدث استخدام عينات الخزعة السائلة ثورة في أبحاث الأورام الانتقالية حيث أن خزعات الأنسجة ، التي تقتصر على منطقة معينة في لحظة معينة ، قد تفوت النسخ المستنسخة ذات الصلة بسبب عدم تجانس الورم. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الخزعة السائلة دورا ذا صلة في أنواع الأورام حيث تكون الأنسجة الأولية نادرة أو لا يمكن الوصول إليها ، لأنها قد تتجنب الخزعة الغازية ، مما يقلل من التكاليف والمخاطر على الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على موافقة أخلاقية مسبقة من المراكز المشاركة قبل استخراج عينات الدم. تم تنفيذ البروتوكولات التالية لعزل المصل والبلازما وفقا للمبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية الحيوية.
ملاحظة: يتم توفير الاعتبارات السابقة قبل بدء البروتوكول هنا. مطلوب موافقة أخلاقية مسبقة لاستخدام العينات البشرية في البحوث الطبية الحيوية ، مع الموافقة المستنيرة المقابلة. مطلوب خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية للتعامل مع عينات الدم. يجب ارتداء معطف المختبر والقفازات الواقية والنظارات طوال العملية لتجنب العدوى بمسببات الأمراض المنقولة بالدم. مطلوب ما لا يقل عن 30 دقيقة لمعالجة عينات المصل. بعد استخراج الدم في أنابيب بدون مضادات التخثر ، حافظ على درجة حرارة الغ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد الطرد المركزي لأنابيب الدم بدون مضادات التخثر ، تظهر المرحلة العليا باللون الأصفر الباهت وتتوافق مع جزء المصل (الشكل 2). تتم إزالة هذا الكسر بعناية واقتباسه للتحليل اللاحق.
قد يكون انحلال الدم موجودا إما في جزء البلازما أو المصل ، وسيكون للمرحلة العليا مظهر ضارب إلى الحمرة ، مما يشير إلى وجود ودرجة انحلال الدم (الشكل 3).
بعد الطرد المركزي لأنابيب EDTA ، ستكون عدة مراحل أو طبقات واضحة ؛ المرحلة العليا (ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخزعة السائلة لها العديد من التطبيقات المحتملة في أوقات مختلفة أثناء إدارة السرطان. أولا ، عند التشخيص لتحديد العلامات الجزيئية للورم التي من شأنها أن تشير إلى وجود آفة ورم محتملة يمكن التحقيق فيها سريريا. ثانيا ، أثناء العلاج للمراقبة في الوقت الفعلي للمرض ، وتقييم الاستجابة الجزيئية للعلاج ، والتطور النسيلي ، والكشف المبكر عن انتكاسات المرض أو مقاومة العلاج. أخيرا ، بعد العلاج الجراحي ، كأداة للكشف عن الحد الأدنى من الأمراض المتبقية. نشرت الجمعية الأوروبية لعلم الأورام الطبي (ESMO) مؤخرا مبادئ توجيهية لتنفيذ اختبار طف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
بياتريس بيلوسيلو (BB): حصلت BB على جائزة أتعاب لمتحدثة أو استشارية أو دور استشاري من Amgen و Astra-Zeneca و Biocartis و Janssen و Merck-Serono و Novartis و Qiagen و Roche Diagnostics و Roche Pharma و ThermoFisher و Pfizer و BMS. سارة لوبيز-تارويلا (SL): حصلت SL على جائزة أتعاب لمتحدثة أو استشارية أو دور استشاري من Astra-Zeneca / Daiichi-Sankyo و MSD و Novartis و Pfizer و Roche Pharma و Gilead و Lilly و Pierre Fabre و Seagen و GlaxoSmithKline و Veracyte. نويليا تارازونا (NT): حصلت NT على أتعاب للمتحدث أو الاستشارات أو الدور الاستشاري من Amgen و Pfizer و Merck-Serono و Servier و SEOM و ESMO. خافيير هرنانديز-لوسا (JHL): حصل على جائزة أتعاب لمتحدث أو استشاري أو دور استشاري من Astra-Zeneca و Janssen و Novartis و Roche Diagnostics و Roche Pharma و ThermoFisher و Lilly و Diaceutics. أفاد رودريغو توليدو (RT) بتلقي منح بحثية تتعلق بهذه الدراسة من نوفارتيس ومنح بحثية لا علاقة لها بهذه الدراسة من AstraZeneca و Beigene. أما المؤلفون المتبقون فليس لديهم أي إفصاحات فيما يتعلق بالمخطوطة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر شبكة البحوث الطبية الحيوية في السرطان (CIBERONC) على دعمها ومنحة المشروع التالية: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC PLATFORM لتوحيد وتعزيز الخزعة السائلة. PI رودريغو توليدو ، (CIBERONC) ، 2019-2021.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنابيب Eppendorf | Eppendorf | 0030 120.086 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| 10 مل ماصات مصلية يمكن التخلص | BIOFIL | GSP010010 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| 10 مل أنبوب Vacutainer K2 EDTA | Becton Dickinson | 367525 | يمكن استخدام هذه الأنابيب لجمع البلازما |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلين | BIOFIL | CFT411150 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| 3.5 مل BD Vacutainer أنبوب بدون مضاد للتخثر | Becton Dickinson | 368965 | استخدام أنابيب 8.5 أو 3.5 مل لجمع المصل 4 |
| مل قارورة بولي بروبيلين مبردة ، قاع دائري ، قائم بذاته | Corning | 430662 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| 4 مل أنبوب Vacutainer K2 EDTA | Becton Dickinson | 367864 | يمكن استخدام هذه الأنابيب لجمع البلازما |
| 4200 نظام TapeStation | Agilent | G2991BA | تتوفر العديد من طرق القياس الكمي مع تطبيق محدد ل cfDNA |
| 5 مل الماصات المصلية التي تستخدم لمرة واحدة | BIOFIL | GSP010005 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| 8.5 مل BD Vacutainer بدون مضاد للتخثر | Becton | Dickinson 366468 | يمكن استخدام أنابيب 8.5 أو 3.5 مل لأجهزة الطرد المركزي لجمع المصل |
| ، قادرة على ~ 3000 × <م > جم < / م > مع دوار دلو متأرجح | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 ؛ 10688725 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| صناديق تخزين الفريزر ل 1 & ndash ؛ 4 مل قوارير مبردة المبردة | Corning | 431120 | هذه الصناديق مطلوبة عند استخدام قوارير 4 مل للتخزين |
| أطراف ماصة p1000 | CORNING | 4809 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
| QIAamp مجموعة الحمض النووي المتداولة | Qiagen | 55114 | يمكن استخدام أي مجموعة متوفرة تجاريا خاصة بعزل cfDNA مع بروتوكول مراقبة الدم هذا. |
| Streck أنابيب الحمض النووي الخالية من الخلايا BCT CE 10 مل | Streck | 218997 | يمكن استخدام هذه الأنابيب لجمع البلازما |
| فريزر درجة الحرارة (-80 درجة ؛ ج) | ESCO | 2180104 | يمكن استخدام أي أنابيب / معدات قياسية |
المراجع
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
